廣東炭步芋頭軟腐病病原菌的分離鑒定與生物防治

羅燕羽 黃紹力 劉紹欽 魏利國 劉偉光 張木清

（廣州市農業科學研究院 廣東廣州 510335）

檳榔芋[Colocasia esculenta(L).Schott]又稱香芋，是芋屬魁芋類糧菜兼用的作物，其食用部位為植株根部球莖，皮粗糙，剖面呈檳榔紋，名“檳榔芋”[1]。其肉質細膩，風味獨特，除鮮食外，還被加工成芋圓、芋片、芋條、芋粉等，作為原料或配料也可添加到面包、奶茶、冰淇淋等食品中[2]。近幾年，隨著奶茶市場的發展，對檳榔香芋的需求量更是逐年攀升。廣東炭步文岡檳榔香芋是廣東省廣州市花都區炭步鎮的特產，其母芋（芋頭）呈直桶狀，體大形美，芋肉帶紫紅色檳榔花紋。煮食時，香味四溢，口感酥松、粉嫩、香醇。因其個頭大、肉質粉、味香、綿軟等特點而聞名海內外[3-4]。近幾年隨著種植結構的調整，炭步鎮種植檳榔芋的面積逐年擴大，檳榔芋已成為該鎮主栽蔬菜品種之一。然而長期的無性繁殖與連作導致了芋頭植株病蟲害嚴重、種性退化等，尤其是近幾年，發病率達到80%以上，到最后采收的商品率僅為15%左右，嚴重影響了炭步芋頭產業的發展[5]。

芋軟腐病是一種細菌性土傳病害，其病原菌隨種芋和植物殘體在土壤中越冬，借助雨水、灌溉水、小型昆蟲活動及農事活動傳播，從植株傷口侵入致病[6]。植株受害后，葉柄基部初呈水漬狀病斑，葉片萎蔫，迅速軟化，最后導致全株枯萎倒伏[7]。為探明芋軟腐病的致病菌，陳瀟航等[8]對廣西荔浦芋頭的軟腐病致病菌進行了分離鑒定，證明其病原菌為Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum。董曉菲等[9]也從福鼎市芋園中發病的檳榔芋中分離到了胡蘿卜軟腐果膠桿菌。不同的是Huang 等[10]從樂昌檳榔香芋病株中分離到的病源菌為Dickeya fangzhongdai。芋軟腐病是一種細菌性土傳病害，地下害蟲、連作、芋種及苗床消毒等皆與芋軟腐病的發生有關[11]。為防治芋軟腐病菌，吳天長等[12]利用可殺得2000 和多菌靈等藥劑進行防治；戴立智等[13]和何耀明[14]提出通過水旱輪作、種芋消毒和化學藥劑72%農用鏈霉素等多種方法進行綜合防治。為防止土壤微生態環境惡化，趙江濤等[15]從芋頭表面粘附的土壤中分離篩選到解淀粉芽孢桿菌BGP14，其對胡蘿卜軟腐果膠桿菌具有強大的拮抗活性，認為能夠有效防治貯藏期芋頭軟腐??；董曉菲等[16-17]從芋頭根際土壤中分離篩選出了9 株對檳榔芋軟腐病具有拮抗效果的細菌和2 株真菌性拮抗菌：藤倉鐮刀菌和塔賓曲霉，認為其對芋軟腐病有較好的生防應用價值。

盡管已有研究對芋軟腐病的致病菌進行分離鑒定，但不同的地區其氣候、土壤、栽培環境等皆不同，病原菌的種類、為害情況、發生特征及流行規律等也存在差異，且目前也尚未見到有關于廣東炭步地區芋軟腐病致病菌的相關報道，因此，開展廣東炭步地區芋頭軟腐病的致病菌的分離鑒定與防治研究具有重要意義。本研究采用組織研磨法進行病原菌分離，基于科赫氏法則進行致病性測定，根據形態學觀察、16S rDNA 序列與系統進化樹分析及生物學特性測定明確致病菌種類，并將芋脫毒種苗與微生物菌劑及生物炭相結合進行芋軟腐病的防治研究，以期為今后芋軟腐病的大田防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 患病檳榔芋頭球莖樣品取自廣州市花都區炭步文岡香芋合作社芋頭種植園。

1.1.2 供試培養基 營養瓊脂（NA）、LB 培養基，廣州環凱微生物有限公司；平衡復合肥、高氮型復合肥和高鉀型復合肥，雅苒挪威國際有限公司；“第一細”微生物菌劑，廣東植物龍生物技術有限公司；生物炭為玉米秸稈炭，河南立澤環?？萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采集發病的植株，用自來水清洗干凈，用滅菌剪刀剪下病健交界處0.5 cm3的組織塊，先經75%酒精表面消毒30 s，無菌水清洗3 次，然后用0.1%升汞消毒1 min，無菌水清洗5 次，再用無菌剪刀將消毒好的組織塊剪碎置于研缽中；加5 mL 無菌水研磨，靜置10 min 充分釋放菌液后，用灼燒過的接種環蘸取菌液，劃線至NA 培養基平板上，將平板倒置于37℃的恒溫培養箱中培養1～2 d；待平板上長出菌落，挑取單菌落接種至新的NA 培養基平板上，置于28℃的恒溫培養箱中倒置培養1～2 d，如此重復3～5 次進行菌落純化；將獲得純培養的菌株挑取單菌落于LB 液體培養基中，28℃振蕩培養12 h，再分別取500 μL 菌液和500 μL 的30%甘油于2 mL 離心管中混合均勻，液氮速凍后置-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 病原菌致病性鑒定 將純化后的單菌落接種于LB 液體培養基上，于28℃振蕩培養12～24 h后，離心去上清，加無菌水懸浮細菌，用A600光密度比濁法制備濃度為10 cfu/mL 的菌懸液。

圖1 芋軟腐病發病癥狀

（1）離體球莖組織塊侵染：準備健康的文岡檳榔香芋球莖，去皮洗凈后切成3 cm×2 cm×1 cm的組織塊，于超凈工作臺中用 75%酒精消毒1 min，無菌水清洗 3 次后再用0.1%升汞消毒1 min，無菌水清洗5 次，用無菌濾紙吸干表面水分后切成2 cm×1.5 cm×0.5 cm 的組織塊，放入放有無菌濾紙的無菌培養皿中，吸取20 μL 菌懸液注入組織塊表面，濾紙用無菌水潤濕，以注入無菌水的組織塊為空白對照，設3 次重復，于37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察記錄組織塊發病情況。

（2）田間活體回接：用滅菌解剖針蘸菌懸液后在盆栽健康芋頭植株基部上刺3 次，每10 株為一組處理，共3 組。接種后每天觀察，以無菌水作為對照，每個處理設3 重復。

取發病的芋頭球莖按照1.2.1 的方法重新分離病原菌，并與最初接種的菌落表型進行比較，以確定導致病害發生的病原菌是否為最初接種的菌落。

1.2.3 病原菌形態學鑒定 形態學觀察：將重新分離的病原菌單菌落接種于NA 平板培養基上，于28℃恒溫培養箱48 h 后，觀察、記錄菌株的大小、表面形狀、顏色、粘度、透明度。采用革蘭氏染色法，在油鏡下觀察菌體形態。

1.2.4 病原菌分子鑒定 將純化后的單菌落接種于LB 液體培養基上，于28℃振蕩培養12 h 后，取3 mL 菌液送至廣州艾基生物有限公司進行16S rDNA 的菌種鑒定。

1.2.5 病原菌生物學特性測定

（1）pH 對病原菌生長的影響 分別配置pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0 的LB 液體培養基，于 28℃恒溫下培養 36 h，測定其OD600值。

（2）病原菌對不同碳源的利用 在基礎培養液（KH2PO41.36 g，K2HPO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，純水1 000 mL）中分別加入1%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和乳糖，將pH 調到7.0 后進行滅菌；取0.1 mL 病原菌菌液于3 mL 的培養液中，28℃恒溫下培養36 h，測定其OD600值。

（3）其他主要生理生化特性 對菌株進行明膠液化、產H2S、氧化酶、5%NaCl 生長、37℃下生長、吲哚等生理生化指標試驗。

1.2.6 生物防治 研究表明，利用芋脫毒種苗進行栽培可減少病蟲害的發生。本研究以炭步芋頭脫毒種苗的假植杯苗為試材進行芋軟腐病的生物防治技術研究，具體栽培方式如下。

定植：3 月初進行定植，以粗顆粒泥炭土:珍珠巖=7:1（V:V）的比例為基礎種植基質裝入45 cm×40 cm 無紡布種植袋的1/5 后，添加100 g的平衡復合肥為底肥，然后繼續添加基質至種植袋的3/5 處，將脫毒種苗種植入裝好基質的種植袋中，種植深度為沒過脫毒種苗杯土表面即可，種植好的袋苗放置于苗床架上，以保證土壤和水等不被外源病菌侵染。

施肥：追肥分多次施入，第一次追肥在幼苗第一片新葉展開時（種植后約半個月），每株施高氮型復合肥30 g；生長旺盛前期（5 月中旬）進行第二次追肥，每株施平衡型復合肥50 g；生長旺盛中期（6 月中旬）進行第三次追肥，每株施高鉀型復合肥50 g；生長旺盛后期（7 月中旬）進行第四次追肥，每株施高鉀型復合肥50 g，生長旺盛末期（8 月中旬）進行第五次追肥，每株施高鉀型復合肥50 g。

水分：采用滴灌進行澆水，于每天5:00～9:00進行，保持水分濕潤。

覆土：分2 次進行覆土，配合施肥同時進行。第1 次培土在生長旺盛前期，施肥后向種植袋中添加粗顆粒泥炭土至4/5 處；第2 次培土在生長旺盛中期，施肥后向種植袋中添加粗顆粒泥炭土至與種植袋齊平。

試驗設定如下6 組處理開展研究，每組處理30 株，3 個重復，以探明對廣東炭步芋頭軟腐病最佳的防治技術。

①對照：利用芋脫毒種苗的假植杯苗正常栽培為對照。

②A+B+C+D+E：假植杯苗定植栽培前一周澆施一次“第一細”微生物菌劑800 倍液（A）；在定植的基礎種植基質中拌入種植基質體積為1%的生物炭（B）；定植時以‘第一細’微生物菌劑800 倍液作為定根水進行澆施至全部濕潤（C）；定植一個月后沿著芋植株基部澆施致病菌株的菌懸液100 mL（D）；每間隔半個月后澆施一次“第一細”微生物菌劑800 倍液，連續澆施3 次（E）。栽培管理與對照組相同。

③A+B+D+E；④A+D+E；⑤D+E；⑥D。

2 結果與分析

2.1 田間發病癥狀

患病植株葉片萎焉變黃、葉柄倒折，易拔起，芋球莖內部組織軟化腐敗，出現黏液且有腐爛惡臭味，有些病株球莖內部組織干燥發黑，有空洞，植株地上部分枯萎死亡（圖1）。

2.2 菌株的致病性鑒定

將分離的菌株活化制備成菌懸液回接到檳榔香芋離體塊莖組織，24 h 后，只有3 株菌株對芋頭球莖發生致病現象，命名為T2202、S1905 和S1910。接種菌株T2202 的組織塊呈灰白色，表面粘稠并散發臭味；接種菌株S1905 和S1910 的組織塊呈黃褐色，黃褐色處變軟并散發臭味（圖2）；對照組接種無菌水的組織塊沒有發生變化。由田間活體回接的試驗結果可知，被菌株T2202侵染的球莖從傷口處向內逐漸腐爛，發臭；而被菌株S1905 和S1910 侵染的球莖與菌株T2202 侵染的球莖不同，其球莖組織則呈干燥發黑、空洞的情況（圖3），亦有臭味。

圖2 菌株對離體球莖組織塊的致病性

圖3 菌株對田間活體球莖的致病性

對接種發病后的球莖按照方法1.2.1 方法重新分離病原菌，結果分離到的菌落在形態上和最初接種的菌落完全一致。根據柯赫法則，分離的菌株T2202 是引起炭步芋頭腐爛的病原菌，菌株S1905 和S1910 為炭步芋頭的另一致病菌。

2.3 病原菌形態觀察

通過組織研磨法從病植體的塊莖中分離純化得到分離物，通過柯赫氏法則驗證，有3 株可使健康植株致病。由圖4～6 可知，3 株致病菌株的形狀、顏色及質地等均相似，菌落為圓形，灰白色，質地均勻、邊緣整齊，中央稍隆起，表面光滑濕潤，菌株有臭味，革蘭氏染色呈陰性。菌株T2202 的菌落較小，直徑1～2 mm，菌株S1905和S1910 的直徑大小為2～3 mm。

圖4 菌株T2202 菌落形態（A）及革蘭氏染色（B）

圖5 菌株S1905 菌落形態（A）及革蘭氏染色（B）

2.4 分子鑒定

提取菌株T2202、S1905 和S1910 的DNA，使用16S rDNA 引物進行PCR 擴增，經電泳檢測得到明亮清晰條帶，分子大小約1 500 bp。根據廣州艾基生物有限公司菌種鑒定結果，菌株T2202 分子大小為1 540 bp，菌株S1905 分子大小為1 432 bp，菌株S1910 分子大小為1 428 bp。將測序結果與NCBI 上相似序列經BLAST 對比，并用MEGA5.1 的鄰接法構建系統進化樹。從圖7和8 可以看出，菌株T2202 與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種Pectobacterium carotovorumsubsp. carotovorumstrain KNU28212 的親緣關系最近，相似度達到99%。菌株S1905 與假單胞菌屬菌株Pseudomonas entomophlaL48 的親緣關系最近，相似度達到98%；菌株S1910 與惡臭假單胞菌Pseudomona putidastrain SKG-1 的親緣關系最近，相似度達到100%。

圖7 菌株T2202 的PCR 凝膠電泳圖（A）和16S rDNA 系統進化樹（B）

圖8 菌株S1905 和S1910 的PCR 凝膠電泳圖（A）和16S rDNA 系統進化樹（B）

2.5 生物學特性測定

從表1 可以看出，菌株T2202 與S1905 和S1910 可生長的pH 均在5～9，pH 低于4 時不能生長，最佳生長pH 為7.0。菌株T2202 可發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖產酸，菌株S1905 和S1910 只能發酵葡萄糖產酸。3 個菌株皆可在5.0%的NaCl 培養液和37℃下生長，氧化酶反應和吲哚反應呈陽性（表2），明膠液化呈陰性。菌株T2202 可產生H2S；菌株S1905 和S1910 不產生H2S。

表1 pH 對病原菌生長的影響

表2 菌株的主要生理生化特征

2.6 防治技術

由表3 可知，處理組②③和④的發病率控制在20%以內，其中最好的是處理組②，接種T2202菌株的發病率僅為3.30%，接種菌株S1905 和S1910 的沒有發生病害?？梢?，在使用脫毒種苗的前提下，定植前澆施“第一細”微生物菌劑對芋軟腐病可以起到很好的防治作用，在定植時再澆施“第一細”微生物菌劑，并在基質中添加生物炭可進一步防治。定植后再澆施“第一細”微生物菌劑也可起到一定的作用，但作用效果較差。

表3 不同處理對芋軟腐病發病率的影響

3 討論與結論

3.1 討論

細菌性軟腐病是目前眾多植物的一種重要病害，可使半夏[18]、魔芋[19]、馬蹄蓮[20]、春羽[21]等植物發生軟腐病，亦是目前為害廣東炭步芋頭最嚴重的病害，發病率可到80%以上，嚴重影響了芋頭的品質和產量，給芋農們帶來了巨大的經濟損失。有研究表明，芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌引起的[8-9]，但Huang 等[10]分離的致病菌為D. fangzhongdai。本研究從廣東炭步文岡香芋中分離到的菌株T2202 為胡蘿卜軟腐果膠桿菌，該菌株的形態特征和生物學特性與董曉菲等的研究結果[16-17]一致，最適生長pH 為7.0，可在5.0%的NaCl 培養液和37℃下生長，氧化酶反應和吲哚反應呈陽性，可利用葡萄糖、甘露醇產酸，明膠液化呈陰性，而陳瀟航等[8]分離鑒定的菌株其明膠液化呈陽性。離體塊莖組織侵染和田間活體回接的結果也表明，菌株T2202 對芋頭具有致病性?？坪辗▌t表明，分離的菌株是引起炭步芋頭腐爛的病原菌。

假單胞菌是自然界分布最廣的微生物之一，在環境生物修復、生物防治、生物轉化等領域逐步體現出越來越重要的作用，但有些種類也是植物常見的致病菌[22]。本研究從炭步文岡檳榔香芋病株中不僅分離到了胡蘿卜軟腐果膠桿菌T2202，還分離到了假單胞菌S1905 和S1910。從形態學和生物學特性上看，菌株S1905 和S1910與假單胞菌屬的特征描述表現一致[23-24]，氧化酶陽性，只能利用葡萄糖產酸，不能利用蔗糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖產酸，明膠液化呈陰性。16S rDNA 系統進化樹分析結果表明，菌株S1905 與假單胞菌屬菌株P. entomophlaL48 的相似度達到98%；菌株S1910 與惡臭假單胞菌P. putidastrain SKG-1 的相似度達到100%。P. entomophla是一種蟲媒性假單胞菌，目前對其的研究較少，主要是代謝物質分子以及對果蠅的毒殺作用等方面[25]，未有其對植物病害方面的相關報道。惡臭假單胞菌是假單胞菌屬一種常見的條件致病菌，廣泛存在于土壤、水體和植物當中，是目前魚類的一種常見致病菌，亦是食用菌的病原之一[26]。本研究分離的菌株S1910 吲哚反應與楊圓圓等[27]分離的魚類惡臭假單胞菌不同，而與韓金鑫[23]從碳酸鹽巖表面分離的相同，其吲哚反應呈陽性。據報道，假單胞菌可引起百合軟腐病[28]、馬蹄蓮塊莖軟腐病[29-30]、柑橘枯萎病[31]、煙草野火病[32]、印度橡膠榕葉枯病[33]等，引起芋頭發生病害屬首次報道，具體致病種及其致病機理有待進一步研究。

對植物病害的傳統防治主要是針對病害本身，通過施用化學農藥[6-7]或進行輪作、間作[14]等方法以達到防治病害的目的。生物防治被認為是目前比較有前景的控制措施，在芋軟腐病的防治上亦有學者[15]通過篩選拮抗菌進行防治，但主要也只是在室內篩選等試驗階段，未能形成配套的技術應用于實際生產當中。研究表明，微生物菌劑在改善土壤環境、培肥地力、提高肥料利用率、促進植物生長、增強抗性、減少病蟲害發生等方面表現出了良好的效果[34]。生物炭可以使土壤環境中微生物的多樣化性增加，改變土壤的物理特性，促進作物生長[35-36]。王瑩樂等[37]利用生物炭與生防菌Bacillus amyloliquefaciensP4 結合防控香芋軟腐病取得了良好的生防效果。本研究在王瑩樂等[37]的基礎上，以芋植物健康為關注點，用脫毒種苗進行栽培可保證種源無病害；在芋頭脫毒種苗假植時，人工提前補充微生物菌劑，可在芋頭根際形成優勢菌群；定植時再補充微生物菌劑，并在土壤中添加生物炭，可增加土壤有益微生物含量，抑制病原菌，還可調整根際微生物菌群結構，改良土壤微生態；定植后再定期向土壤中補充微生物菌劑，保證了有益微生物對病害的控制能力。

3.2 結論

本研究從廣東炭步文岡檳榔香芋中共分離到3 株致病菌，菌株T2202 屬胡蘿卜軟腐果膠桿菌，為廣東炭步文岡檳榔香芋軟腐病的致病菌；菌株S1905 和S1910 屬假單胞菌，可導致芋頭內部空洞、干燥發黑。將脫毒種苗與微生物菌劑、生物炭結合，通過土壤微生物菌群重建和根際微生物調控可以有效控制芋頭軟腐病的發生，該技術對軟腐病的防治不僅安全有效，還可保證芋頭的品質，可進一步示范推廣。