河北省小麥赤霉病病原鑒定及毒性差異分析

宋璐璐，田嬌嬌,2，李 娜，張 娜，楊文香

（1.河北農業大學 植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治技術創新中心/國家北方山區農業工程技術研究中心，河北 保定 071001；2.河北省清河縣職教中心，河北 邢臺 054800；3.河北省植保植檢總站，河北 石家莊 050035）

由鐮刀菌（Fusariumspp.）引起的小麥赤霉病(Fusariumhead blight，FHB)又稱爛穗病。在美國、中國、歐盟、英國、非洲、巴西等地區廣泛發生，是一種世界性的流行真菌病害［1-2］。該病害可發生在小麥生長的任何時期，引起苗枯、莖基腐、稈腐和穗腐，其中以穗腐危害最大。通?？梢栽斐尚←湝p產10%～15%，嚴重發生可以造成20%～40%的產量損失，大流行則可造成80%～90%以上的損失［3］。

小麥赤霉病是典型的氣候性病害，主要發生于氣候溫暖濕潤的地區。近年來，隨著全球氣候變暖及耕作制度的變化，小麥赤霉病的發生范圍逐漸向過去干旱低溫的北部和西部種植區擴大，以前該病害在河北為偶發性病害，但近年來赤霉病的發生面積由河北省的南部向北呈繼續擴展趨勢，已經成為河北省的常發病害。

小麥赤霉病的致病菌主要包括禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）、黃色鐮刀菌（F.culmorum）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）和雪腐鐮刀菌（F.niva）［4］。在我國，主要為禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌［5］，長江中下游小麥赤霉病的主要致病菌是亞洲鐮刀菌［6］，而在北方小麥種植區河北中部和南部地區，主要病原菌類型為禾谷鐮刀菌［7-8］。經研究發現，禾谷鐮刀菌的毒素類型主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)和乙酰雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)［9］。不同地區鐮刀菌產生毒素化學型不同，長江上游的小麥種植區主要的化學型為NIV；長江中下游小麥種植區主要的化學型為DON［10］；北京與河北地區小麥真菌毒素污染的主要類型為DON 與15-AcDON［11］。同時禾谷鐮刀菌菌株間存在明顯的致病分化，不同地區的小麥赤霉病菌的致病力不同［12］。

從2017 年至今，隨著氣溫的改變，河北省的小麥赤霉病發生頻率和嚴重度不斷提升，其病原菌是否發生改變，毒素類型、致病性是否存在差異均需要明確。為此本研究將從河北省不同地區采集小麥赤霉病病穗，分離病原菌，利用分子標記和形態鑒定明確其病原菌類型，利用分子標記明確赤霉病菌的毒性類型，以期為抗病品種的鑒定和病害的防治奠定基礎。

1 材料及方法

1.1 病原菌的分離純化

2020—2021 年5 月份，從河北省小麥主要種植區采集具有典型赤霉病癥狀的病穗樣本182 份。從采集的病穗的穎殼處取病組織，采用組織分離法分離病原菌，用無菌剪刀剪下病組織約0.3 cm，依次用0.1%升汞（30 s）、75%乙醇（30～60 s）和無菌水（重復3 次）消毒表面，按照分離培養的操作程序，將無菌病組織表面的水分吸干，置于馬鈴薯培養基（PDA）平板上，每皿放1 塊病組織料，并做標記，在28 ℃培養箱中培養2～3 d。菌落形成后，挑出新的菌絲體，在PDA 平板上培養，獲得菌株的純培養物，進行編號，備用。

1.2 病原菌形態學鑒定

接種菌株于PDA 培養基培養，5 d 后按照赤霉病形態鑒定程序進行鑒定［13］，觀察菌株菌落形態特征，基質顏色等；另在綠豆培養基中25 ℃、120 r/min 培養，待5～7 d 后產生足夠的分生孢子時，在顯微鏡下照相觀察孢子形態特征。

1.3 病原菌種群的鑒定

采 用CTAB 法提取 小麥赤 霉病菌基因組DNA，使用特 異性引 物Fg16 F（CTCCGGATATGTTGCGTCAA），Fg16 R（GGTAGGTATCCGACATGGCAA），進行PCR 擴增，PCR 擴增總體系為25 μL，模板DNA1 μL，正反引物各0.5 μL，Master mix12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性45 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min，PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得出2 條PCR 產物擴增片段，目的片段大小分別為410 和497 bp，在410 bp 大小的為F.graminearum種群；497 bp 大小的為F.asiaticum種群。

1.4 F. graminearum 菌株產毒化學型檢測

1.4.1 DON 和NIV 毒素化學型檢測 用毒素特異性引物ToxP1（GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA）和ToxP2（TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA）以F.graminearum種群的DNA 為模板，進行PCR 擴增，PCR 擴增總體系為25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，PCR 擴增程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，52 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min，PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得出2 條PCR 產物擴增片段，目的片段大小分別為300 和360 bp，在300 bp 大小的為產生DON 毒素的菌株；360 bp 大小的為產生NIV毒素的菌株。

1.4.2 3-AcDON 和 15-AcDON 毒素化 學型檢測 以產生DON 毒素的鐮刀菌菌株的DNA 為模板，利用引物對Tri303 F（GATGGCCGCAAGTGGA），Tri303 R（GCCGGACTGCCCTATTG）和Tri315 F（CTCGCTGAAGTTGGACGTAA）Tri315 R（GTCTATGCTCTCAACGGACAAC）進行PCR 擴增，PCR 擴增總體系為25 μL，模板DNA 2 μL，正反引物各1 μL，Master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，PCR 擴增程序為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，共30 個循環；72 ℃延伸10 min，PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得出2 條PCR 產物擴增片段，目的片段大小分別為583 和863 bp，引物Tri303F/Tri303R 擴增出583 bp 的片段，表明該菌株產生3-AcDON。引物Tri315F/Tri315R 擴增出863 bp 片段，表明該菌株產生15-AcDON。

1.5 病原菌的致病力鑒定

1.5.1 菌絲生長速率和產孢量的測定 為了測定不同地理來源的禾谷鐮刀菌的侵染能力，隨機選取引起不同癥狀的菌株No.32、No.36、No.49 和No.58，利用‘衡觀35’作為接種品種，測定這些菌株的致病力。

將4 種不同的小麥赤霉病菌接種在PDA 上，在25 ℃培養3 d。用滅菌的打孔器沿菌落邊緣打孔，將直徑為5 mm 的菌塊接種在PDA 上，25 ℃培養3～4 d。每隔24 h 用交叉法測量菌落直徑。當菌落直徑為7～8 cm 時，比較菌落的大小和形態，然后拍照。每個菌株重復3 次。利用血球計數板統計孢子數量。

1.5.2 內胚芽鞘接種測定病菌致病力 用1%升汞（HgCl2）消毒處理的小麥種子催芽，20 ℃培養2～3 d。當胚芽鞘長2～3 cm 且其幼葉未生長時，選擇生長勢相同的胚芽鞘，參考武愛波［14］方法進行胚芽鞘的接種。接種7 d 后調查小麥發病情況，并測定小麥幼苗莖基部褐斑的長度。根據小麥幼苗莖基部產生的褐斑長度，將菌株致病性分為弱、中、強3 種類型，褐斑長度標準分別為≤0.7 cm、0.7～1.0 cm 和≥1.0 cm。試驗數據用SPSS 進行統計分析。

1.5.3 花期接種致病力鑒定 參考陳懷谷［15］單小花定位定量孢子懸浮液（1×105CFU/mL）進行注射接種。按徐雍皋等［16］的方法，于接種后10 d 以5 級標準觀察記載病情，以日擴展速率（r*）進行菌株致病力的統計分析。

日擴展速率r*公式為：

式中：x=每穗病情級別：N=接種穗數；10=接種至病害調查記載時間為10 d。

田間花期接種試驗中禾谷鐮刀菌致病力類型劃分標準為：弱，r*≤0.25；中，0.25 ＜r*＜0.35；強，r*≥0.35。采集的數據在α=0.05 顯著水平下，進行各種相關統計分析。

2 結果與分析

2.1 河北省小麥赤霉病病原及其特性分析

2.1.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法，對2021 年從河北省4 市7 縣12 個地塊田間自然發病182 個小麥赤霉病病穗進行病原菌分離，共分離純化得到90 株菌株。

2.1.2 病原菌的形態學鑒定 本試驗所分離的病原菌均具有鐮刀菌菌株的典型性狀。分離的菌株在PDA 平板上28 ℃培養3～5 d 后，氣生菌絲生長繁茂，呈白色棉狀，菌落基質由白色漸漸漸變為洋紅色，中心老菌絲呈黃色（圖1a）。隨著培養時間的加長，黃色蔓延至邊緣，中心的老菌絲塌陷，緊貼培養基（圖1b）。初步判斷為F.spp 菌群。在綠豆培養基中25 ℃培養3 d 后，顯微鏡下鐮刀菌孢子清晰可見，分生孢子為無色，有2～7 個膈膜不等，多數有3～5個膈膜（圖1c）。

圖1 分離病原菌在PDA 上的培養性狀及分生孢子Fig. 1 Morphology of the colony and conidia of the pathogen isolated

2.1.3 鐮刀菌種群的分子鑒定 為進一步明確分離病原菌的種類，利用特異性引物Fg16F/R 對菌株進行PCR 擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，結果顯示，所有的菌株都能擴增出1 條帶，呈現出1 種帶型（圖2）。鑒定結果表明，引起小麥赤霉病病原菌的類型均為F.graminearum（410 bp），且在12 個采集點中均分離到該類型的菌株，說明禾谷鐮刀菌（F.graminearum）在河北省各采樣地點普遍存在，未鑒定出F.asiaticum。

圖2 鐮刀菌菌株的PCR 鑒定Fig. 2 PCR identification of F.spp.isolate

2.1.4 DON 與NIV 毒素化學型的鑒定 引物ToxP1/ToxP2 在毒素化學類型試驗中區分DON 和NIV 毒素，對產生NIV 毒素的菌株擴增片段為360 bp，對產生DON 毒素的菌株擴增片段為300 bp。對90 株鐮刀菌菌株進行PCR 擴增，結果表明測試的菌株中均擴增出產DON 毒素所對應的300 bp 條帶（圖3）。鑒定結果表明小麥赤霉病的產毒類型為DON 毒素類型，未鑒定出NIV 毒素類型。

圖3 鐮刀菌菌株產生毒素化學型的PCR 鑒定Fig. 3 PCR identification of toxin chemotypes produced by F.spp.

2.1.5 3Ac-DON 與15Ac-DON 毒素化學型的鑒定 在產DON 毒素的菌株中，利用Tri303F/R 引物擴增出583 bp 片段的是3Ac-DON，Tri315F/R 引物擴增出863 bp 片段的是15Ac-DON。在90 個產DON 毒素的菌株中，78 個為15Ac-DON（圖4），僅有1 個為3Ac-DON（圖5），還有11 個菌株采用2 對引物并未擴出條帶。鑒定結果表明從河北省各個地點采集的小麥赤霉病菌的毒素類型以15Ac-DON 為主，是優勢毒素類型。

圖4 禾谷鐮刀菌15-AcDON 的毒素化學型分子鑒定Fig. 4 Molecular Identification of 15-AcDON toxin chemical type of F. graminearum

圖5 禾谷鐮刀菌 3-AcDON 的毒素化學型分子鑒定Fig. 5 Molecular identification of chemical type of 3-AcDON toxin produced by F. graminearum

2.2 不同病原菌致病力測定分析

2.2.1 菌絲生長速率和分生孢子量的測定 選擇不同地理來源、引起不同癥狀的4 個菌株No.32、No.36、No.49、No.58 開展致病力測定。結果發現，所測試4 個菌株在相同培養條件下，其生長速率存在一定差異，分別為14.66、14.05、14.71、14.91 mm/d。經過SPSS 顯著性分析，No.36 菌株生長最慢，與其他菌株的生長速度存在顯著差異。利用綠豆培養基對4 個菌株進行產孢誘導，測定其產孢量，結果不同病原菌產孢量不同，其中No.49 號菌的產孢量最多，與No.32，No.36 號菌株存在顯著差異（見表1）。

表1 不同菌株的生長速率及孢子產量Table 1 Growth rate and spore yield of different F. graminearum isolates

2.2.2 胚芽鞘接種法與田間花期接種測定病原菌的致病力 為了測定病原菌的致病力，試驗采用胚芽鞘接種法［14］、田間花期接種［15］進行鑒定。接種7 d 后測量不同菌株的病斑長度來觀察胚芽鞘的發病情況，小麥幼苗莖基部的褐斑病長度存在顯著差異（表2）。No.36 菌的病斑長度最短為0.55 cm，No.49 菌引起的病斑長度最長，No.32、No.36 的危害速度慢，兩者差異不顯著，但與No.49、No.58 差異顯著。根據小麥幼苗莖基部褐斑的長度（表2），將接種No.32、No.36、No.49、No.58 菌株的菌液的小麥致病力類型分別為弱、弱、強、中。

表2 胚芽鞘接種及鐮刀菌菌株致病力類型Table 2 Germinal sheath inoculation and pathogenicity type of F. graminearum

采用單小花定位定量法接種小麥麥穗，分別取表2 中列出的4 個菌株的20 μL 孢子懸浮液（1×105CFU/mL）分別接種到溫室培養的小麥穗，培養10 d后鑒定，結果表明接種小麥均產生赤霉病危害癥狀，但不同菌株的日擴展速率不同。No.32、No.36、No.49 和No.58 的日擴展速率分別為0.32、0.35、0.40和0.40，所對應的致病力類型分別為中、中、強、強，其中No.49、No.58 的日擴展速率與其他菌株相比，形成顯著性差異（表3）。

表3 小麥不同部位DON 毒素含量及花期接種致病力類型Table 3 Content of DON toxin in different parts of diseased wheat and the evaluation of pathogenicity at flowering stage

將接種不同菌株的麥穗分別研磨，采用ELISA試劑法對研磨樣品進行DON 含量測定，結果表明，不同菌株之間DON 含量差異顯著，No.32、No.36、No.49 和No.58 的DON 總量分別為1 189.01、1 251.80、1 439.09 和1 397.59 μg/kg。接 種No.49菌秸稈的DON 含量最高，No.32 菌的含量最少。而莖稈中No.49 菌株的毒素含量同樣較高，但從總體來看，病原菌產生的毒素多存在于穎殼和穗軸中。盡管不同鐮刀菌菌株均為同一產毒類型，但在DON毒素的積累量上表現出差異。

3 結論與討論

小麥赤霉病是由鐮刀菌不同種群引起的真菌病害，但種群因地理差異不同，優勢菌株、產毒類型、致病性也不同。在國內的主要致病菌株為亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）和禾谷鐮刀菌（F.graminearum），F.asiaticum主要分布于長江中下游的溫暖地區，F.graminearum主要分布于北方的寒冷地區。鐮刀菌的種群分布除了與溫度有關，張昊等［17］人也發現致病種的類型與作物輪作方式存在一定相關性，在玉米與小麥輪作的地區，禾谷鐮刀菌以F.graminearum種群為主，在水稻與小麥輪作的地區，禾谷鐮刀菌以F.asiaticum種群為主。為了明確河北省鐮刀菌的種群是否發生變化，本研究從河北省主要小麥種植區的4 市7 縣12 個麥田分離純化得到90 個鐮刀菌菌株，采用禾谷鐮刀菌的特異性引物16F/R 鑒定出1 個菌種，為F.graminearum。馬斌等［18］人的研究結果也表明河北省的主要病原優勢菌株為F.graminearum，這些結果表明至今河北省的小麥赤霉病菌類型沒有改變。

為了進一步明確F.graminearum的毒素類型，對90 株小麥赤霉病菌株進行PCR 檢測，發現均為DON 型毒素，其中毒素化學型最多的是15-AcDON，有78 株，且在石家莊元氏分離獲得1 株產毒素類型為3-AcDON，只有極少數不能有效檢測出15-AcDON、3-AcDON 的相應條帶，與DON毒素類型中還存在其他的毒素組成有關。有研究發現在玉米中的化學型為3-AcDON 的禾谷鐮刀菌［19］；也有研究結果表明DON 毒素中主要的化學型為15-AcDON［20-21］。

在致病菌株同是F.graminearum，產毒類型一致的情況下，來自不同地區的致病菌株的的致病力也存在差異，本試驗測試的4 個菌株No.32、No.36、No.49、No.58 在相同培養條件下菌絲生長速率存在一定差異，No.36 菌株生長最慢，No.49菌株的產孢量最多，然后No.36 的產孢量少。病原菌的致病力測定結果表明小麥幼苗莖基部的褐斑病長度存在顯著差異。No.32、No.36、No.49、No.58菌株的致病力類型分別為弱、弱、強、中。用單小花定位定量法測定病原菌的致病力，發現不同菌株的日擴展速率不同，No.49、No.58 的日擴展速率最大；由于毒素是病原菌致病的物質基礎之一，毒素的多少與致病力強弱有關［22］。通過檢測小麥籽粒、穗軸、穗莖稈3 個部位的毒素積累情況，發現在3個部位中，No.49 的毒素含量最高，其次是No.58、No.36、No.32；3 個部位毒素積累量不同，籽粒的毒素積累量最多，其次是穗軸、穗莖稈，這一情況與徐飛［23］的結果一致；雖不同禾谷鐮刀菌菌株均為同一產毒類型，但在DON 毒素的積累量上表現出差異。致病力強的菌株，毒素積累量最多，表明致病力與毒素積累量呈正相關。通過菌絲生長速率、產孢量、日擴展速率，產毒量的多少進行比較，明確了河北省的小麥赤霉病菌的致病力存在強弱差異。本研究通過分子標記、形態鑒定等方法明確了赤霉病菌的毒性類型以及致病差異，為抗病品種的鑒定和病害的防治奠定了基礎。