深州蜜桃果實腐爛病病原菌鑒定及拮抗菌株的篩選

劉君盈，孫新康，崔鐘池，王海燕

（河北農業大學 植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治技術創新中心，河北 保定 071000）

桃（Prunus persica（L.）Batsch），薔薇科、李屬植物。桃在中國已有4 000 年以上的栽培歷史［1］，據統計2021 年中國桃種植面積和產量分別為89.0 萬hm2和1 599.3 萬t，均居世界第一位［2］。中國傳統“四大蜜桃產區”，分別是河北深州、浙江奉化、江蘇陽山和山東肥城，其中，河北深州蜜桃已有2 000 多年的栽培歷史［3］。近年來，隨著深州市蜜桃栽培面積不斷擴大，桃果實在生長發育過程中，易受到各種病蟲為害。8—9 月份正值蜜桃成熟期，采收季節常遇高溫濕熱天氣，儲運過程中易受到各種損傷，更容易受到多種病原菌的侵染引起果實腐爛。

目前，我國已報道引起桃腐爛的病害有10 種，如桃褐腐病、炭疽病、灰霉病和軟腐病等，自幼果期至成熟期均可受到危害，造成蜜桃果實變軟和腐爛，嚴重影響蜜桃產量和質量［1,4］。據國內外報道，目前造成桃褐腐?。≒each brown rot）的病原菌分別為美澳型核果鏈核盤菌（Monilinia fructicola）、果產鏈核盤菌（M.fructigena）、梅生鏈核盤菌（M.mumecol）、多子座鏈核盤菌（M.polystroma）和松散鏈核盤菌（M.laxa）與云南鏈核盤菌（M.yunnanensis）［5］；桃炭疽?。≒each anthracnose）病原菌分別由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）侵染造成，且2 種病原為復合小種［6］。目前膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）被細分為果生炭疽菌（C.fructicola）和暹羅炭疽菌（C.siamense）［7］。近年來，存在2 種病害同時發生的現象，其初期癥狀難以分辨，后期造成桃果實嚴重腐爛，使蜜桃喪失商品價值［8］，嚴重影響了深州蜜桃的產量和質量，減少了果農的經濟收益。

化學防治是防治桃褐腐病和炭疽病的主要方法，化學藥劑雖能有效、快速地達到防治目的，但長期使用化學農藥不僅會污染環境，造成農藥殘留，而且對一些非靶標的植物、微生物，甚至人類的安全造成了潛在的威脅［9-10］。生物防治可以減少對環境的干擾，具有綠色安全等特點，目前已成為研究的熱點［11］。本研究擬通過利用傳統病原鑒定結合多基因分子鑒定對患病蜜桃病原菌進行鑒定，并以鑒定出的病原菌為靶標，進行拮抗細菌的篩選，以期為深州蜜桃腐爛病的生物防治提供依據，為蜜桃腐爛病的綜合防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 病果采集與病原菌分離培養

2021 年9 月調查河北省深州市深州鎮10 處蜜桃果園。在果實近成熟期對腐爛果實進地觀察，每個桃園采集發病的蜜桃樣本10 份。采用組織分離法對發病果實進行病原菌分離純化，選取具有典型發病癥狀的蜜桃，用滅菌刀片在果實病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm 若干小方塊，將其放入70%的酒精浸泡15 s，10%次氯酸鈉溶液進行表面消毒30 s，最后用無菌水清洗3～4 次，用滅菌濾紙吸去多余水分后，置于PDA 平板上，26 ℃培養箱暗培養5 d，待菌絲長出后，用無菌接種環接種到新培養基上純化培養。待菌落長出后分別置于4 ℃和-80 ℃保存。

1.2 病原菌形態學觀察

將分離獲得的純培養物置于PDA 培養基，26 ℃暗培養5 d，觀察菌落生長變化、形態和顏色，待產孢后在顯微鏡下觀察分生孢子的類型、形狀、顏色，并測量孢子大小。

1.3 致病性測定

按照柯赫氏法則將分離得到的病原菌進行離體回接。選取健康、外觀整齊、成熟度以及大小相似的蜜桃果實，75%酒精浸泡消毒后，無菌水沖洗3 次。在果實表面用無菌接種針輕微刺傷，同時用打孔器從新鮮菌落的邊緣打取菌餅，倒置菌餅貼于果面刺傷處，并置于塑料箱中，以不接菌處理為對照。將塑料箱置于26 ℃培養箱暗培養，定期觀察果實發病情況，待果實發病具有明顯特征時，對病組織重新分離和鑒定，與接種前病原菌形態相同即可確定為致病菌。

1.4 病原菌的分子鑒定

采用CTAB 法分別提取2 種病原菌的DNA。以提取的DNA 作為PCR 擴增模板，利用引物ITS、GAPDH、TUB2 對菌株H-1、H-2、H-3 進行檢測，利用引 物ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2 對菌株T-1、T-2、T-3 進行 檢測［12-13］。PCR反應總 體系為25 μL，含 有Master Mix12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上下游引物和模板DNA 各1 μL，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 產物送上海生工生物工程有限公司測序。利用MAFFT version7 進行序列比對，利用Bio Edit 軟件進行序列串聯，利用MAGE11 軟件，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.5 拮抗細菌的篩選

以蜜桃腐爛病原菌H-1、H-2、H-3 和T-1、T-2、T-3 為靶標菌，采用平板對峙法篩選有效的拮抗細菌。在PDA 培養基平板背面中心點處接種生長5 d 的致病菌菌餅（直徑5 mm），距中心點左右兩側2.5 cm處接5 mm 拮抗細菌菌餅，每個處理3 次重復，對照組不接細菌，只接真菌菌餅。置于26 ℃恒溫培養5 d，觀察是否出現污染狀況，根據抑菌帶寬度計算抑制率，抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100。

2 結果與分析

2.1 深州蜜桃果實腐爛病發生情況

通過對深州蜜桃果實腐爛病田間調查發現，桃果實主要病害有桃褐腐病、炭疽病、軟腐病等。溫暖高濕、枝葉蔭蔽的環境有利于病原菌的發生和傳播，嚴重時整棵桃樹大部分果實都會出現腐爛的現象。桃腐爛病發生分為幾種類型：蜜桃果實摘袋后，有些果實病斑逐漸結合，導致整個果實腐爛，病部果肉變為褐色，病斑表面產生灰褐色絨球狀霉簇（圖1-A）；有些果實底部或腰部出現褐色圓形或橢圓形病斑，病斑處果肉變軟（圖1-B）；有些果實病斑表面凹陷，產生橘紅色小粒點（圖1-C）。這些導致蜜桃腐爛的癥狀肉眼難以區分，且發病率在50%～75%，直接影響蜜桃品質和產量。

圖1 桃果實田間腐爛的癥狀Fig. 1 The symptoms of peach fruit rot in the field

2.2 深州市蜜桃果實腐爛病病原菌的分離與形態學鑒定

采用組織分離法對癥狀相似的病果進行病原菌分離，分離純化獲得6 株病原菌，根據病原菌在PDA 培養基上的菌落形態，挑選6 株代表性菌株進行后續試驗，編號分別為H-1、H-2、H-3 和T-1、T-2、T-3（圖2-A,B）。將菌株H-1、H-2、H-3 分別接種于PDA 培養基上，菌株H-1、H-2、H-3 在PDA培養基上的菌落形態完全一致，初期菌絲生長速度較慢，大部分菌落邊緣完整，部分菌落邊緣有缺陷，呈花瓣狀，菌落顏色為偏灰黃色或灰褐色，中間顏色深邊緣顏色淺（圖2-A 正面、A1 背面），呈輪紋狀排列。在顯微鏡下觀察，H-1 分生孢子透明，呈橢圓形或檸檬形，鏈狀，有分枝（圖2-A2），孢子平均大小為15.3 μm×10.5 μm，根據菌落形態和孢子形態初步鑒定病原菌為子囊菌鏈核盤菌（Moniliniaspp.）的病菌。

圖2 代表性菌株H-1 和T-1 形態特征Fig. 2 Morphological characteristics of the representative isolate H-1 and T-1

將T-1、T-2、T-3 菌株分別接種于PDA 培養基上培養，菌株T-1、T-2、T-3 在PDA 培養基上的菌落形態完全一致，菌絲生長致密呈白色，菌絲生長速度較快，菌落平整，邊緣整齊（圖2-B），后期菌落背面呈黑褐色（圖2-B1）。通過在顯微鏡下觀察發現T-1、T-2、T-3 分生孢子為單細胞，透明，圓柱形至紡錘形（圖2-B2），孢子平均大小為（9.7～12.1）μm×（3.1～4.5）μm，根據菌 落形態和孢子形態初步鑒定病原菌為膠孢炭疽復合種（Colletotrichumloeosporioidesspecies complex）。

2.3 深州蜜桃果實腐爛病病原菌的致病性驗證

根據柯赫氏法則進行回接試驗，將菌株H-1、H-2、H-3 接種于蜜桃果實7 d 后，蜜桃果實出現了淡褐色近圓形病斑（圖3-A），病斑部位出現灰色或淡黃色絨球狀霉簇，病部果肉褐變；將菌株T-1、T-2、T-3 接種于蜜桃果實，7 d 后蜜桃果實出現了淡褐色近圓形水漬狀病斑（圖3-B），而對照組果實均無發病癥狀（圖3-A1,B1）。分別對人工接種發病的果實再次進行病菌分離，成功分離獲得與原病原菌一致的菌株，證明分離到的病原菌為致病菌。

圖3 致病性檢測Fig. 3 Pathogenicity assay

2.4 深州蜜桃果實腐爛病病原菌的分子生物學鑒定

將病原菌H-1、H-2、H-3 基因組中的ITS、GAPDH、TUB2 序列在與GenBank 中進行BLAST比 對，發 現H-1、H-2、H-3 基因組中的ITS、GAPDH、TUB2 序列與M.fructicolastrain 等菌株相似性為100%。進一步利用MAGE 11 軟件，采用鄰接法構建系統發育樹，聚類結果顯示，菌株H-1、H-2、H-3 與模式菌株M.fructicolastrain M15.4A_Nc_Ch 和M.fructicolastrain shhf15 聚集于同一分支上，自展值為100%（圖4-A）。菌株序列上傳NCBI，基因編號分別為ITS: ON26211、GAPDH:ON303282、TUB2: ON303279。結合病原菌形態學鑒定，證明患病蜜桃果實中分離到的真菌為美澳型核果鏈核盤菌（M.fructicola）。

圖4 M. fructicola A 和C. siamense B 序列比對構建系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of M. fructicola A and C. siamense B trains constructed with the sequence alignment results

將病原 菌T-1、T-2、T-3 基因組中的ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2 序列在 與GenBank 中進行BLAST 比對，發現T-1、T-2、T-3基因組中的ITS、ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、TUB2 序列與C.siamensestrain 等菌株相似性為100%，進一步利用MAGE 11 軟件，采用鄰接法構建系統發育樹，聚類結果顯示，菌株T-1、T-2、T-3 與模式菌株C.siamenseSDQD5 聚集于同一分支上，自展值為98.4%（圖4-B）。菌株序列上傳至NCBI，基因編號分別為ITS：ON063324、ACT：ON099443、CAL：ON099446、CHS-1：ON099449、GAPDH：ON099452、TUB2：ON099455。結合病原菌形態學鑒定，證明患病蜜桃果實中分離到的真菌為暹羅炭疽菌（C.siamense）。

2.5 深州蜜桃果實腐爛病病菌室內拮抗細菌的篩選

為篩選出對桃褐腐病和桃炭疽病病原菌具有抑制效果的拮抗細菌，對實驗室保存的102 株拮抗細菌（編號為JK-1 至JK-102）進行抑菌篩選試驗，結果獲得6 株拮抗細菌對M.fructicola抑菌率達到50% 以上；9 株拮抗細菌對C.siamense抑菌率達到50%以上。平板對峙試驗結果表明，拮抗菌株JK-21 和JK-47 對桃褐腐病原菌和桃炭疽病病原菌均具有明顯的抑制效果（圖5）。

圖5 拮抗細菌JK-21 和JK-47 在PDA 平板上對M. fructicola 和C. siamense 的抑制效果Fig. 5 Antagonistic effect of bacteria JK-21 and JK-47 against M. fructicola and C. siamense on PDA plate

JK-21 對桃褐腐病和桃炭疽病病原菌抑菌平均直徑分別為1.833 和1.967 cm；JK-47 對桃褐腐病和桃炭疽病病原菌抑菌平均直徑分別為1.633 和2.667 cm，拮抗菌株JK-21 對桃褐腐和桃炭疽病病原菌抑菌率最高，分別為75.1%和70%；拮抗菌株JK-47對桃褐腐和桃炭疽病病原菌抑菌率次之，分別為77.8%和59.7%。因此，后續可選用這2 株拮抗細菌為桃褐腐和桃炭疽病病原菌的生防菌，進一步展開相關研究。

3 結論與討論

本研究通過對深州桃園進行調查發現深州蜜桃腐爛發生情況，對河北省深州蜜桃腐爛病樣品進行組織分離、純化、柯赫氏法則實驗驗證病原菌菌株種類。根據培養病原菌菌株、孢子形態觀察、多基因序列系統發育分析和致病性檢測，結合已報道的關于褐腐病菌和炭疽病菌的描述［14-15］，鑒定引起蜜桃腐爛病的兩種病原菌分別為美澳型核果鏈核盤菌（M.fructicola）和暹羅炭疽菌（C.siamense）。本研究為探究河北深州蜜桃腐爛病的田間防控提供了依據。

褐腐病菌和炭疽病菌寄主范圍廣泛，具有豐富的遺傳多樣性，其形態特征、致病力和近似種等之間差異微小，有時會存在多種病菌同時侵染同一種寄主上的現象，對病害診斷造成影響［16-19］。病原菌的鑒定通常采用形態觀察、分子生物學鑒定和多基因序列分析，多基因序列分析可以鑒定不同屬之間的親緣關系，也有人利用多基因系統發育分析結合形態學特征分析的綜合方法，用于鑒定病原菌種類［17］；李河等［18］利用ITS、CAL 和GAPDH 基因進行綜合分析，根據形態特征及多基因系統發育樹分析，對采集自我國6 個省市油茶產區的炭疽病樣進行了鑒定，其中23 株病原菌被鑒定為果生刺盤孢菌C.fructicola。張麗瓊［19］通過構建G3PDH 和TUB2系統發育進化樹，并結合形態學鑒定，明確了引起上海地區桃褐腐病病原菌主要為M.fructicola。參考以上研究方法，本研究依據ITS、GAPDH、TUB2 多基因序列分析構建多基因系統發育樹和形態學分析，明確了深州地區引起蜜桃褐腐病病原菌為美澳型鏈核盤菌（M.fructicola），基于ITS、GAPDH、TUB2、ACT、CAL、CHS-1 等多基 因序列分析構建多基因系統發育樹和形態學分析，明確了深州地區引起桃炭疽病病原菌為暹羅炭疽菌（C.siamense）。

在桃果實生長期間，噴施殺菌劑仍是桃果實病害防治的主要手段，常用藥劑有多菌靈、百菌清、吡唑醚菌酯等，為了增加桃產量及減少各種病害，長期使用化學藥劑會導致病原菌產生抗藥性，增加藥劑殘留量以及污染環境等問題。近年來，生物防治因其安全、高效、無殘留等特點在病害防控領域逐漸成為研究的熱點，目前已有報道從高產桃園土壤中分離、篩選具有防治作用的細菌菌株，對不同病原菌引起的桃褐腐病均具有良好的抑制效果,袁雪等［21］篩選到特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis對桃褐腐病病原菌的抑菌率為74.48%，拮抗細菌可能降解致病因子，導致致病因子不能正常的發揮作用，減少了病原菌對桃的侵染。潘朝勃等［22］篩選到對杧果炭疽有防治效果的枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis，抑菌率在88.83%。本研究通過篩選獲得拮抗細菌JK-21 對美澳型核果褐腐病菌（M.fructicola）和暹羅 炭疽菌（C.siamense）的抑菌率分別為75.1% 和70%；JK-47 對美澳型核果褐腐病菌（M.fructicola）和暹羅炭疽菌（C.siamense）的抑菌率分別為77.8%和59.7%，對預防深州蜜桃果實病害發生具有重要的應用價值，后續關于2 種生防菌的作用生防機制及田間的應用防效有待進一步研究。