六君子湯乙酸乙酯提取物干預CAFs 條件培養基下EC9706 細胞能量代謝的機制研究

陳 星婁翔宇尚藝婉周哲旭劉 洋劉婭茹胡嘯博陳玉龍

(1.河南中醫藥大學,鄭州 450046;2.河南省中醫方證信號傳導重點實驗室,鄭州 450046)

食管癌(esophageal carcinoma, EC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,根據2020 年中國癌癥調查報告顯示,食管癌是發病率排名第六位的惡性腫瘤[1]。盡管隨著醫療水平的發展和進步,食管癌的五年生存率有了一定提升,但僅僅維持在18%左右[2-4]。

腫瘤細胞的生長與腫瘤微環境中存在的癌相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)關系密切。 在腫瘤微環境中,CAFs 是腫瘤微環境中含量最豐富的細胞,可為腫瘤細胞提供各種能量物質,促進腫瘤細胞生長、增殖[5-7]。 因此,CAFs 對腫瘤細胞的能量代謝有著重要作用。

前期研究發現六君子湯乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Liujunzi Decoction,EAELD)可以通過調節AMPK/mTOR 通路影響EC9706 細胞的能量代謝,抑制該細胞的活性,并增強化療藥順鉑對EC9706 細胞的療效[8],且70%～80%細胞融合度的CAFM,含量為60%時能夠明顯促進EC9706 細胞的能量代謝,因此,本研究擬通過CAFs 與EC9706 細胞體外間接共培養,探討EAELD 是否通過干預CAFs 條件培養基下EC9706 細胞的能量代謝,進而影響腫瘤細胞的增殖,為六君子湯的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

人食管鱗癌EC9706 細胞,由河南中醫藥大學分子生物中心提供,本實驗室傳代培養。 人癌相關成纖維細胞(CAFs),由課題組分離并鑒定。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 高糖培養基(貨號:12100)、胰蛋白酶-EDTA 消 化 液(貨 號: T1300)、 噻 唑 藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,貨號:M8180)(Solarbio 公司);胎牛血清(Lonsera 公司,貨號:A97E00G);二甲基亞砜(DMSO,Amresco 公司,貨號:D8370);乳酸測試盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A019-2-1);葡萄糖比色法測試盒(Elibscience 公司,貨號:EBC-K234-M);XF 糖酵解速率測定試劑盒(貨號:10334-100);水化液(貨號:08418001)、XF96 孔細胞培養板(貨號:101085-004)、基礎檢測培養基(貨號:23217002)、XFp 細胞線粒體壓力測試試劑盒(貨號:103101-100,Agilent 公司);兔抗人M2 型丙酮酸激酶抗體(Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2,貨號:4053s);兔抗人p-PKM2 抗體(貨號:3827s)、兔抗人己糖激酶2 抗體(Hexokinase 2,HK2,貨號:2867s)、兔抗人α-微管蛋白抗體(α-Tubulin,貨號:2125s)(CST 公司)、兔抗人葡萄糖轉運蛋白1 抗體(Glucose transporter 1,GLUT1,貨號:YN4056)、 兔抗人單羧酸轉運體- 1 抗體(monocarboxylic acid transporter 1, MCT1, 貨 號:ab179832)、兔抗人MCT4 抗體(Monocarboxylic acid transporter 4,貨號:ab234728)(Immunoway 公司);反轉錄試劑盒(Toyobo 公司,貨號:117000);2×SYBR ? Green ( 武 漢 ABclonal 公 司, 貨 號:RM21203)。

酶標儀(BIO-TEK 公司,型號:ELx-800);CO2培養箱(美國Thermo 公司,型號:371);超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司,型號37997);能量代謝分析系統(美國Agilent 公司,型號:Seahorse XFe96);倒置顯微鏡(德國Laica 公司,型號:DFC450C);熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司,型號:QuantStudioTM6 Flex);熒光分光光度計(美國Thermo 公司,型號:NanoDrop One);電泳儀(美國Bio-Rad 公司,型號:PowerPac Basic);凝膠成像系統(美國Bio-Rad 公司,型號:Universal Hood Ⅱ)。

1.3 實驗方法

1.3.1 六君子湯乙酸乙酯部位提取

六君子湯組成參照《醫學正傳》,按照人參∶白術∶茯苓∶甘草∶陳皮∶半夏=1 ∶1.5 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1.5打成粗粉混勻,以M(藥物重量):V(70%乙醇體積)= 1 ∶8 比例混勻于圓底燒瓶內,設置加熱溫度為50℃,煮沸1.5 h 后,8 層紗布過濾藥渣,重復兩次。將藥液靜置過夜后進行濃縮,濃縮體積大約與生藥總重量相當,濃縮液與乙酸乙酯體積比為2 ∶1 進行萃取,萃取6 次,合并萃取液,過濾,旋轉蒸發儀回收乙酸乙酯后,水浴鍋濃縮,低溫真空干燥,稱重,為EAELD。 經質譜分析鑒定其共有663 種物質,主要成分以2-羥基肉桂酸、4-二羥基苯甲酸、5-羥基酸橙黃酮、草黃素-8-C-葡萄糖苷(金雀花素)、高車前素-8-C-葡萄糖苷等酚酸類、黃酮類為主。

1.3.2 細胞的傳代與培養

EC9706 細胞與CAFs 均采用由10%的胎牛血清和90% DMEM 含雙抗的高糖培養基配制成的完全培養基進行培養,置于37℃、5% CO2的培養箱中,待細胞融合度達80%～90%進行1 ∶3 ～1 ∶5傳代。

1.3.3 條件培養基的制備

取對數生長期的CAFs 細胞,根據實驗所需的細胞數,用8 mL 完全培養基重懸,放入CO2培養箱中,培養24 h 后,使細胞融合度達70%～80%,1 mL PBS 洗滌后,依次加入10 mL 不含胎牛血清的DMEM 含雙抗高糖培養基,繼續培養48 h 后,收集培養基為CAFM,-20℃保存1 周,-80℃長期保存。

1.3.4 MTT 法檢測EAELD 對EC9706 細胞增殖的影響

取對數生長期的EC9706 細胞,每孔1×104個接種于96 孔板里,置于CO2培養箱中培養24 h,用不含胎牛血清的DMEM 含雙抗高糖培養基,將EAELD 工作液配制為不同濃度(0、10、20、40、60、80 μg/mL),置于CO2培養箱繼續培養48 h。 按照DMEM ∶5 mg/mL MTT=9 ∶1,每孔100 μL 加入MTT工作液,4 h 后,每孔加入150 μL 的DMSO,酶標儀檢測570 nm 波長下各孔吸光值,計算各組藥物抑制率,選取IC30、IC50為后續實驗用藥,實驗重復3 次。藥物抑制率=(空白對照組OD 值-用藥組OD 值)/空白對照組OD 值×100%

1.3.5 能量代謝分析系統檢測EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝的影響

取對數生長期的EC9706 細胞,接種于Seahorse 96 孔板中,每孔細胞懸液80 μL,每孔8000 個細胞,每組3 個復孔。 置于CO2培養箱中培養24 h 后,根據1.3.4 中MTT 檢測結果加藥,選取濃度為25 μg/mL 作為低劑量組、40 μg/mL 作為高劑量組,用條件培養基配制EAELD 工作液,分別處理細胞,繼續培養48 h。 不添加EAELD 的計作CAFM 組。 按照說明書,檢測各組細胞能量代謝情況。 實驗結果由Wave 軟件分析。

1.3.6 比色法檢測EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞上清乳酸含量及葡萄糖攝取量

取對數生長期的EC9706 細胞,按照一定數量接種于6 孔板中,培養24 h 后加藥(分組同1.3.5),繼續培養48 h 后,收集細胞上清,1500 r/min,5 min離心,PBS 稀釋3 ～5 倍。 按說明書要求進行檢測,并測定條件培養基中乳酸、葡萄糖的濃度,計算加藥培養后培養基中乳酸、葡萄糖含量的變化。

1.3.7 RT-qPCR 法 檢 測 EAELD 對 CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子mRNA 表達的影響

細胞分組同(1.3.5),用TRIzol 提取總RNA,超微量分光光度計測定總RNA 在260 nm 和280 nm處A 值,計算RNA 濃度,以10 μL 體系進行反轉錄,再以10 μL 體系對c-DNA 進行擴增,以β-肌動蛋白(β-actin)為內參,用2-△△Ct計算各個樣品中目的mRNA 相對表達量。 引物由鄭州點睛公司設計合成,序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.8 Westernblot 法 檢 測EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子蛋白表達的影響

細胞分組同(1.3.5),以RIPA 裂解液∶蛋白磷酸酶抑制劑:蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶1 的比例,配制細胞裂解液混合物,每孔加入100 μL 裂解細胞,按BCA 試劑盒說明測定蛋白濃度,98℃變性8 min,取20 μg 蛋白上樣,用10%的十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜75 min,5%脫脂牛奶室溫封閉4 h,一抗HK2、PKM2、p-PKM2、GLUT1、MCT1、α-Tubulin 按照1 ∶1000 比例稀釋,MCT4 按照1 ∶3000 比例稀釋,孵育4℃過夜,TBST 漂洗3 次,二抗按照1 ∶1000 比例稀釋,室溫孵育1 h,再次漂洗3次,配制ECL 發光顯影液,上機檢測,顯影拍照。 以α-Tubulin 為內參,使用“Image Lab”分析每組條帶的光密度值,以目的條帶光密度值/內參條帶光密度值,計算各組蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

每組實驗重復3 次,數據采用IBM SPSS 21.0軟件進行分析,結果采用平均數±標準差(±s)進行描述。 若結果符合正態分布且方差齊,兩組之間對比采用獨立樣本t檢驗;多組之間比較則采用單因素方差分析,兩兩對比以LSD 為統計依據。 若符合正態分布,方差不齊,以DunnettT3 為統計依據。 若不符合正態分布,則選擇非參數檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EAELD 對食管癌EC9706 細胞增殖的影響

與DMEM 組相比,除10 μg/mL 組外,不同濃度的EAELD 對EC9706 細胞的增殖均有抑制作用(P＜0.05),抑制率隨EAELD 濃度的升高而升高,選取25 μg/mL、40 μg/mL 分別為低濃度組、高濃度組。見圖1。

注:與DMEM 組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖1 EAELD 對EC9706 細胞增殖的影響(n=3)Note.Compared with DMEM group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 1 Effects of EAELD on EC9706 cell proliferation

2.2 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝的影響

與CAFM 組相比,EAELD 低劑量組和高劑量組都能夠顯著降低非線粒體耗氧、基礎呼吸值、最大呼吸值、合成ATP 耗氧量、備用呼吸能力、基礎糖酵解、補償糖酵解、糖酵解潛能(P＜0.01),EAELD 高劑量組能夠下調EC9706 細胞的線粒體耗氧與基礎糖酵解比值(P＜0.05)。 見表2、表3,圖2。

注:A:線粒體呼吸能力;B:糖醇解速率。圖2 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞線粒體呼吸能力和糖醇解速率影響的“海馬”曲線Note.A, Mitochondrial respiratory capacity.B, Glycololysis rate.Figure 2 “Hippocampus” curve of the effect of EAELD on mitochondrial respiratory capacity and glycololysis rate of EC9706 cells under CAFM

表2 EAELD 對CAFM下EC9706細胞線粒體能力的影響(±s,n=3)Table 2 Effects of EAELD of soup on mitochondrial capacity of EC9706 cells under CAFM

表2 EAELD 對CAFM下EC9706細胞線粒體能力的影響(±s,n=3)Table 2 Effects of EAELD of soup on mitochondrial capacity of EC9706 cells under CAFM

注:與CAFM 組相比, **P＜0.01。Note.Compared with CAFM group, **P＜0.01.

線M粒ito體ch壓ond力ri指al 標pre(spsum roe l i/nmdienx)EAELD(μg/mL)0 25 40 Non-mitocho非nd線ria粒l o體xy耗gen氧consumption 77.80±10.44 40.80±4.84** 17.00±3.03**Basal基re礎sp呼ira吸tio值n value 115.40±6.89 61.00±10.85** 24.72±1.68**Maximu最m大re呼spi吸rat值ion value 162.26±9.81 79.94±10.44** 34.69±3.28**Oxygen co合ns成umpA tTioPn耗of 氧AT量P synthesis 11.16±2.15 5.41±2.3** 1.59±2.15**Spare備re用sp呼ira吸tio能n c力apacity 46.86±9.23 18.94±3.27** 9.97±3.33**

表3 EAELD 對CAFM下EC9706 細胞糖酵解能力的影響(±s,n=3)Table3 Effects of EAELD on the glycolytic capacity of EC9706 cells under CAFM

表3 EAELD 對CAFM下EC9706 細胞糖酵解能力的影響(±s,n=3)Table3 Effects of EAELD on the glycolytic capacity of EC9706 cells under CAFM

注:△表示該比值無單位。與CAFM組相比,**P＜0.01。Note.△indicatestheratiohasnounit.ComparedwithCAFMgroup, **P＜0.01.

糖酵解指標(pmol/min)Indicators of glycolysis EAELD(μg/mL)0 25 40基礎糖酵解Basal glycolysis 789.72±146.04 410.18±148.77** 311.11±75.93**補償糖酵解Compensative glycolysis 1274.88±197.67 678.48±169.42** 424.26±129.51**線粒體耗氧與基礎;糖酵解比值△Mitochondrial oxygen consumption and basal use; glycolytic ratio △ 0.14±0.02 0.15±0.05 0.08±0.02**糖酵解潛能Glycolytic potential 378.41±73.27 210.1±44.33** 88.03±44.38**

2.3 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞上清乳酸含量及葡萄糖攝取量的影響

與CAFM 組相比,EAELD 高劑量組能夠減少CAFM 培養的EC9706 細胞葡萄糖攝取(P＜0.05),EAELD 低劑量組和高劑量組均能減少CAFM 培養的EC9706 細胞上清乳酸含量(P＜0.01)。 見圖3。

注:A:葡萄糖攝取量;B:上清乳酸含量。 與CAFM 組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖3 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞代謝物質的影響(n=3)Note.A, Glucose uptake.B, Lactic acid content of supernatant.Compared with CAFM group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 3 Effects of EAELD on the metabolism of EC9706 cells under CAFM

2.4 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子mRNA 表達的影響

與CAFM 組相比,EAELD 的低劑量組和高劑量組都能夠下調GLUT1 的mRNA 表達(P＜0.05,P＜0.01);EAELD 低劑量組能夠下調MCT1 的mRNA表達(P＜0.05)。 見表4。

表4 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子mRNA 表達的影響(±s,n=3)Table 4 Effects of EAELD on mRNA expression related to energy metabolism in EC9706 cells under CAFM

表4 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子mRNA 表達的影響(±s,n=3)Table 4 Effects of EAELD on mRNA expression related to energy metabolism in EC9706 cells under CAFM

注:與CAFM 組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。Note.Compared with CAFM group, *P＜0.05, **P＜0.01.

mRNA 名稱mRNA name EAELD(μg/mL)0 25 40 HK2 1 0.85±0.06 1.45±0.4 PKM2 10.82±0.21 0.9±0.18 GLUT1 1 0.71±0.15* 0.64±0.07**MCT1 1 0.72±0.16* 0.99±0.14 MCT4 1 1.04±0.28 0.96±0.27

2.5 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子蛋白表達的影響

與CAFM 組相比,EAELD 低劑量和高劑量組能夠下調p-PKM2、HK2、PKM2、MCT1 蛋白表達(P＜0.01),EAELD 高劑量組能夠下調p-PKM2、GLUT1的蛋白表達(P＜0.01,P＜0.05)。 見表5,圖4。

表5 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子蛋白表達的影響(±s,n=3)Table 5 Effects of EAELD on molecular protein expression related to energy metabolism in EC9706 cells under CAFM

表5 EAELD 對CAFM 下EC9706 細胞能量代謝相關分子蛋白表達的影響(±s,n=3)Table 5 Effects of EAELD on molecular protein expression related to energy metabolism in EC9706 cells under CAFM

注:與CAFM 組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。Note.Compared with CAFM group, *P＜0.05, **P＜0.01.

蛋白名稱Protein name EAELD(μg/mL)0 25 40 p-PKM2 0.31±0.06 0.31±0.01 0.2±0.03**HK2 1.74±0.52 0.86±0.17** 0.8±0.33**PKM2 1.42±0.29 0.71±0.25** 0.42±0.2**GLUT1 0.65±0.12 0.51±0.1 0.39±0.13*MCT1 0.47±0.03 0.28±0.06** 0.23±0.08**MCT4 0.1±0.02 0.15±0.03 0.16±0.04

3 討論

食管癌屬于中醫學“噎膈”病的范疇。 食管癌的發生與脾胃功能異常有著密切聯系,正如《靈樞·四時氣》曰:“飲食不下,膈塞不通,邪在胃脘”[9]。 脾胃失調是其主要病機,健脾和胃法是治療“脾胃失調”這一病機的常用方法,也是食管癌的常用治法之一,其代表方為六君子湯,該方出自《醫學正傳》,由人參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏,六味藥物組成,全方共奏益氣健脾、燥濕化痰之效,是治療食管癌的常用方藥,臨床應用發現六君子湯具有抗腫瘤、對放化療增效減毒、調節惡性腫瘤患者免疫功能等作用[10]。

腫瘤細胞與CAFs 細胞的能量交互,是在單羧酸轉運蛋白(MCTs)的作用下,腫瘤細胞與CAFs 之間實現了乳酸、丙酮酸的高效利用[11-13],前期研究發現隨著EAELD 濃度的增加,對EC9706 的抑制率也隨之增加,并且調節AMPK/mTOR 通路影響EC9706 細胞的能量代謝[8],其次發現70%～80%細胞融合度的CAFs 條件培養基在60%的濃度時對EC9706 的增殖作用最明顯,基于此,本研究以CAFs條件培養基培養的EC9706 細胞為對象,研究EAELD 能否干預其能量代謝。

首先采用Seahorse 能量代謝分析系統檢測EAELD 對CAFs 條件培養基下的EC9706 細胞能量代謝的影響。 結果顯示EAELD 的低劑量組和高劑量組均可以明顯抑制在CAFM 中的EC9706 細胞糖酵解能力和線粒體呼吸能力。 由于糖酵解利用1 分子葡萄糖可生成2 分子的三磷酸腺苷(ATP),因此癌細胞需要增加葡萄糖的攝取來維持高水平的糖酵解,而EAELD 可以減少CAFM 培養的EC9706 細胞的葡萄糖的攝取與上清中乳酸的含量。

GLUT1 是轉運葡萄糖的關鍵蛋白,GLUT1 順濃度梯度將葡萄糖轉運至細胞內,為腫瘤細胞提供代謝原料[14]。 HK2、PKM2 作為糖酵解限速酶,HK2能夠與線粒體外膜的電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1(VDAC1)相互作用并結合,促進ATP 合成相關酶的激活,增強ATP 的產生、促進糖酵解、抑制細胞凋亡,為腫瘤細胞提供合成大分子的碳源[15-17]。 PKM2 是糖酵解過程的最后一個限速酶,可將磷酸烯醇式丙酮酸快速轉化為丙酮酸、加快糖酵解速率、產生更多的ATP[18-21]。 PKM2 的翻譯后修飾影響著PKM2 的活性,PKM2 的酪氨酸殘基105(Y105)被磷酸化后,能夠促進PKM2 二聚體的形成,抑制四聚體活性,增加腫瘤細胞的生物合成,以促進腫瘤細胞的增殖[22-23]。 MCTs 能夠催化L-乳酸、丙酮酸等單羧酸鹽和酮體跨質膜的質子連接轉運,在腫瘤代謝中起著至關重要的作用[24-25],其中MCT1 根據細胞內外的主要底物濃度以及跨質膜的pH 梯度,進行L-乳酸在質膜上的轉運,而MCT4 在糖酵解活躍的組織中表達更多,主要作用是從細胞中排出乳酸[24,26],CAFs 與腫瘤細胞之間可通過MCT1、MCT4 實現乳酸的高效利用,促進糖酵解與氧化磷酸化能力的增強,促進腫瘤細胞的代謝與增殖[27-28]。 研究結果顯示,EAELD 能夠下調GLUT1、MCT1 的mRNA 表達,降低GLUT1、HK2、PKM2、MCT1、p-PKM2 蛋白的表達,因此EAELD 能夠通過調控GLUT1、HK2、PKM2、MCT1 分子,抑制CAFs 條件培養基下EC9706 細胞的能量代謝。

此外,研究中發現MCT1、HK2、PKM2 mRNA 的水平隨著EAELD 濃度的濃度升高而升高,其原因可能是MCT1 對乳酸親和力高于MCT4,MCT4 在低氧條件下更為活躍,在缺少MCT4 的細胞中,MCT1根據細胞內外乳酸水平,決定乳酸進出細胞[29-30],由此推測在常氧環境中,EC9706 細胞主要由MCT1實現乳酸的轉運。 由于腫瘤細胞的代謝途徑會隨環境變化而變化,有研究表明:血清饑餓后,人膠質瘤細胞U251 的氧化磷酸化水平會增加,糖酵解能力被抑制[31],因此推測腫瘤細胞在血清饑餓與EAELD 的干預下,其代謝方式主要為糖酵解,MCT1的表達升高用于轉運乳酸。 而HK2、PKM2 雖然有升高趨勢,但是并無統計學差異,其次從mRNA 到蛋白,中間受較多因素的調控,其中翻譯效率、蛋白質的降解都會影響最終蛋白的表達,具體機制尚不明確,將進行進一步驗證。

綜上所述,EAELD 能夠干預CAFM 下EC9706細胞的能量代謝的影響,其機制與其能夠調控HK2、PKM2、GLUT1、MCT1、MCT4 的mRNA 和蛋白表達相關。 然而EAELD 調控能量代謝相關通路的機制有待進一步深入研究。