基于HIF-1α/自噬途徑探討二氯化鈷調控3T3-L1脂肪細胞炎癥反應及胰島素抵抗的機制

岳欣欣付 洋李怡然尹曉燕于 飛傅全威

(1.遼寧何氏醫學院,沈陽 110000;2.北部戰區總醫院,沈陽 110000;3.東莞康華醫院,廣東 東莞 523080)

細胞自噬(autophagy)是細胞在生理、營養匱乏等應激條件影響下,通過自噬溶酶體途徑,將胞質內受損的細胞器和過度積累的脂質等成分降解的生物學過程[1]。 近年來,通過不同的干預方法調控自噬活性,研究其對肥胖和糖尿病疾病的影響成為學者們關注的熱點[2-5]。 缺氧是誘導自噬發生的常見方法之一,然而缺氧誘導的自噬激活是把雙刃劍,它既可以發揮保護作用,也可以發揮加重細胞損傷的作用[6-7]。 因此,本研究在低氧誘導劑CoCl2干預條件下模擬體外缺氧環境,以3T3-L1 誘導為成熟脂肪細胞為細胞模型,基于HIF-1α/自噬途徑,探討低氧誘導劑CoCl2調控脂肪細胞自噬活性,發揮自噬的保護作用,闡明其使脂肪細胞免受炎癥損傷和改善胰島素抵抗的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株

3T3-L1 前脂肪細胞購自ATCC(XY-XB-1608)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 不完全培養液和胰蛋白酶-EDTA 消化液(Keygen);CoCl2(Sigma);MTT(Aladdin);抗體: HIF-1α(BD, 美國)、LC3B(Cell Signaling Technology, 美國)、Belin-1 (Santa Cruz, 美國)、β-actin (Abcam,美國) 。 Western blot 及IP 細胞裂解液、蛋白上樣緩沖液、地塞米松溶液、胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBMX)、FBS 胎牛血清均購自上海碧云天生物技術有限公司。

超凈工作臺購自江蘇通凈凈化設備有限公司;CO2細胞培養箱,購自美國NUAIRE 公司;高速低溫離心機,購自英國Dynamica 公司;PCR 儀及熒光定量系統購自美國BIO-RAD 公司;蛋白質電泳和轉移系統購自美國BIO-RAD 公司;Olympus CKX41 顯微鏡、CKX53 倒置相差顯微鏡、BX63 自動熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養和誘導分化

3T3-L1 前脂肪細胞用含10%小牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、鏈霉素的DMEM 高糖培養液培養。 細胞融合近80%～90%開始誘導分化,加入含10%胎牛血清(FBS)、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L 地塞米松和10 mg/L 胰島素的DMEM 高糖培養液培養48 h, 再換為含10%FBS、10 mg/L 胰島素的DMEM 高糖培養液繼續培養48 h, 隨后以10% FBS 的高糖DMEM 繼續培養,誘導8～12 d 后進行實驗。 當觀察到90%以上的細胞變圓并有大量脂滴出現,說明3T3-L1 被誘導為成熟的脂肪細胞[8]。

1.3.2 分組與干預措施

將誘導分化的成熟脂肪細胞,給予不同濃度(50、100、150、200、400 μmol/L)和不同時間(0、12 h、24 h、48 h)CoCl2處理,分析CoCl2干預脂肪細胞的濃度和時間,根據此結果,將成熟的脂肪細胞分為0 h 組(對照組)和CoCl2干預12 h 組、24 h 組、48 h 組。

1.3.3 細胞存活率檢測(MTT 法)

將脂肪細胞按照一定的濃度接種于96 孔中,每組設置6 個平行孔,每孔加入100 μL 細胞懸浮液,培養至細胞個數接近1×104/孔時,按照分組需求加入藥物干預。 然后每孔加入10 μL 濃度為5 mg/mL的MTT 溶液,放入細胞培養箱中繼續培養4 h 后棄去培養基,每孔加入150 μL DMSO,放在搖床上低速搖晃10 min,最后用酶聯免疫檢測儀測定每孔在490 nm 處的吸光值。

1.3.4 Western blot 檢測

按照Western blot 細胞裂解液說明書提取蛋白,用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。 取30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳,轉移到PVDF 膜上后用5% BSA 或5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,然后與各種一抗在4℃孵育過夜。 一抗稀釋度分別為:HIF-1α(1 ∶500) 、LC3-Ⅱ (1 ∶500) 、Beclin-1 (1 ∶200) 、Glut-1(1 ∶500)和β-actin (1 ∶4000)。 TBS 洗滌3次后加入二抗,室溫搖床2 h 后,加入ECL 發光液反應,曝光后拍照分析。

1.3.5 細胞免疫熒光檢測

采用LC3B 自噬熒光檢測試劑盒檢測脂肪細胞中自噬活性水平。 將細胞以3.5×104/mL 接種于共聚焦培養皿,誘導分化成熟。 實驗分組和干預措施同1.3.2,用甲醛∶丙酮(1 ∶1)固定細胞,LC3B 兔多克隆抗體0.5 μg/mL 37℃孵育1 h, 山羊抗兔IgG 0.01 mg/mL 37℃孵育30 min, 抗熒光淬滅劑封片,應用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3.6 ELISA 法檢測細胞上清液炎癥因子的水平

取各組培養液上清,離心(1000 r/min,20 min),去除細胞碎片,保存于-20℃冰箱,按照ELISA 試劑盒說明書步驟,檢測脂肪細胞培養液上清中TNF-α、IL-6 的水平。

1.4 統計學方法

采用Graphpad prism 8.0 軟件進行數據分析和繪圖。 對連續型數值變量用平均數±標準差(±s)表示,所用分析方法為單因素方差分析,對符合正態性和方差齊性的檢驗,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度和不同時間CoCl2 對脂肪細胞存活情況的影響

用MTT 法檢測不同濃度和不同時間CoCl2對脂肪細胞存活情況的影響,結果見圖1,隨著干預時間的增加,不同CoCl2濃度組脂肪細胞均出現存活率下降的趨勢,隨著CoCl2濃度的增加,同一時間段脂肪細胞的存活率也隨之降低,這提示脂肪細胞存活率與CoCl2濃度變化、干預時間存在劑量依賴和時間依賴的變化趨勢。 不同濃度CoCl2干預脂肪細胞12 ～24 h 時,細胞存活率開始出現下降趨勢,但是下降趨勢不明顯。 干預24 ～48 h 時脂肪細胞存活率出現明顯下降趨勢,這提示干預24 h 是潛在的時間節點。 用50、100、150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 時,細胞存活率出現下降的趨勢,但不顯著,而用200、400 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h,細胞存活率出現顯著降低的趨勢。這提示150 μmol/L 濃度的CoCl2是干預脂肪細胞模擬適度缺氧環境的最佳濃度。

圖1 不同濃度不同時間CoCl2 對脂肪細胞存活率影響Figure 1 Effect of different concentration and time of CoCl2 on the survival rate of adipocytes

2.2 CoCl2 對脂肪細胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Glut-1 蛋白表達水平的影響

根據2.1 實驗結果,選取150 μmol/L 的CoCl2對脂肪細胞分別干預0 h、12 h、24 h、48 h,檢測脂肪細胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1、Glut-1 蛋白的表達水平,結果如圖2 所示,與0 h 組(對照組)相比,12 h 和24 h 組LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達水平增高,且具有統計學意義(P＜0.05),與12 h 組相比,24 h 組LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達水平增高,且具有統計學意義(P＜0.05),這一結果提示12～24 h 自噬相關蛋白表達增加,自噬水平增加,24 h 自噬水平增加最為顯著。 與0 h 組(對照組)相比,12 h 和24 h 組HIF-1α、Glut-1 蛋白表達水平增高,且具有統計學意義(P＜0.05),與12 h 組相比,24 h 組HIF-1α、Glut-1 蛋白表達水平增高,且具有統計學意義(P＜0.05),這一結果提示缺氧12 ～24 h 時HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白表達水平開始增加,且與自噬增加水平一致,自噬水平增加可能以依賴HIF-1α 方式存在。

注:與0 h 組相比, *P＜0.05;與12 h 組相比, #P＜0.05。圖2 不同時間CoCl2 對脂肪細胞中HIF-1α、LC3-Ⅱ、Beclin-1 和Glut-1 蛋白的表達的影響Note.Compared with 0 h group, *P＜0.05.Compared with 12 h group, #P＜0.05.Figure 2 Effects of CoCl2 on the expressions of HIF-1α,LC3-Ⅱ,Beclin-1 and Glut-1 in adipocytes of different times

2.3 CoCl2 對脂肪細胞自噬水平的影響

采用LC3B 自噬免疫熒光檢測試劑盒檢測脂肪細胞自噬水平,結果見圖3,與0 h 組(對照組)相比,24 h 組自噬水平顯著增加,12 h 和48 h 組自噬水平無顯著變化。 這一結果提示150 μmol/L 的CoCl2干預脂肪細胞24 h,自噬活化水平最為顯著,與自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達水平一致。

圖3 免疫熒光檢測LC3B 的表達情況Figure 3 Results of LC3 positive cell staining in each group

2.4 CoCl2 對脂肪細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響

檢測脂肪細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6的水平,結果見圖4,與0 h 組(對照組)相比12 h 和24 h 組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平無明顯增加,無統計學意義(P＞0.05),48 h組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著增加,且有統計學意義(P＜0.05)。 與12 h 組相比,24 h 組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平無明顯增加,無統計學意義(P＞0.05),48 h 組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著增加,且有統計學意義(P＜0.05)。 這一結果提示缺氧干預12 ～24 h 時是適度缺氧條件下,自噬水平增加以依賴HIF-1α 的方式增加的同時,自噬發揮保護細胞的作用,減輕了細胞炎癥因子的水平。

注:與0 h 組相比, *P＜0.05;與12 h 組相比, #P＜0.05。圖4 脂肪細胞上清液中炎癥因子TNF-α 和IL-6 的水平Note.Compared with 0 h group, *P ＜0.05.Compared with 12 h group, #P＜0.05.Figure 4 Effects of CoCl2 on the expressions of TNF-α and IL-6 in culture supernatants of adipocytes

3 討論

體外模擬缺氧環境,誘導細胞缺氧常用二氯化鈷(CoCl2),其主要機制是二價鈷離子可誘導細胞低氧誘導因子(hypoxia induced factor,HIF)及其調控的下游基因的表達[9]。 因此,故本研究以此為依據將3T3-L1 細胞暴露于二氯化鈷作用條件下觀察細胞在缺氧應激條件下的生物學變化情況,本研究結果發現,隨著CoCl2干預細胞時間的增加,不同CoCl2濃度組脂肪細胞均出現存活率下降的趨勢,隨著CoCl2濃度的增加,同一時間段脂肪細胞的存活率也隨之降低,這提示脂肪細胞存活率與CoCl2濃度變化、干預時間存在劑量依賴和時間依賴的變化趨勢。 12 ～24 h 時段,用不同濃度CoCl2干預脂肪細胞時,細胞存活率開始出現下降趨勢,但是下降趨勢不明顯。 24 ～48 h 時段,用不同濃度CoCl2干預脂肪細胞時,脂肪細胞存活率出現明顯下降趨勢,這提示CoCl2干預脂肪細胞24 h 是潛在的影響脂肪細胞存活率的時間轉折點。 再觀察24 h 時,用50、100、150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞,脂肪細胞存活率開始出現下降的趨勢,但是不顯著,用200、400 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞,脂肪細胞存活率出現顯著降低的趨勢,這提示150 μmol/L 濃度的CoCl2是干預脂肪細胞模擬適度缺氧環境的最佳濃度,這一結果與既往研究結果相似[10]。

缺氧是誘導自噬發生的最常見原因之一[11]。缺氧后HIF-1α 被活化,如果自噬以依賴HIF-1α 活化的方式發生,將有助于抵御缺氧損傷,維持細胞穩態;如果自噬以不依賴HIF-1α 活化的方式被激活,將促進細胞損傷和凋亡,既往多項研究基于此探討如何調控自噬來達到治療疾病的作用[12-18]。鑒于此,本研究預探討150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞是否可調控自噬以依賴HIF-1α 活化的方式發生,發揮自噬保護細胞的作用。 因此,闡明HIF-1α/自噬途徑的關鍵分子信號通路是本研究的關鍵所在。 本研究選取150 μmol/L 濃度的CoCl2分別于0 h、12 h、24 h、48 h 干預脂肪細胞,探索HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白、自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達水平,本研究結果發現,與0 h組(對照組)相比,24 h 組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達水平顯著增加,HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白表達水平也顯著增加,且增加水平明顯高于其他組,由此結果我們推測自噬的活化是以依賴HIF-1α 活化的方式發生的,進一步說明150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 是調控自噬活化的最佳干預條件,且在此干預條件下自噬以依賴HIF-1α 方式的活化,發揮其保護細胞的作用。與此同時,本研究進一步通過免疫熒光技術檢測自噬活性,結果發現,與0 h 組(對照組)相比,24 h 時自噬活化水平顯著增加,且最為顯著,這一研究結果與24 h 時自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達水平一致。 由此,本研究發現,基于HIF-1α/自噬途徑,150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 可調控自噬活化發揮保護細胞的作用。 既往研究發現150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 后,脂肪細胞開始出現凋亡表現,凋亡的相關蛋白p53、Bcl-2 和caspase-9 等表達增加[10],這項研究從另一個方向說明24 h 后自噬開始發揮促進細胞損傷和凋亡的作用,也從另一個方向證實了本研究的結果是與其一致的。

既往研究證實,與瘦體重人群相比,肥胖人群脂肪組織中自噬相關蛋白LC3 的表達水平增高,且與脂肪組織炎狀態和胰島素抵抗密切相關,但是對于肥胖狀態下脂肪細胞自噬活性和炎癥狀態的變化存在爭議[4,19]。 基于上述理論,為進一步說明基于HIF-1α/自噬途徑,150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 可調控自噬活化發揮保護細胞的作用與抑制脂肪細胞炎癥因子的分泌相關。 本研究采用150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞0 h、12 h、24 h、48 h,分析脂肪細胞中脂肪炎癥因子的分泌情況,研究結果發現隨著干預時間的延長,脂肪炎癥因子TNF-α、IL-6 分泌水平逐漸升高,與0 h 組相比,12 h、24 h 脂肪炎癥因子TNF-α、IL-6 分泌水平無顯著升高,48 h 時脂肪炎癥因子TNF-α、IL-6 分泌水平升高最為顯著,這與24 h 時自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達水平顯著增加趨勢相反,也與24 h 時HIF-1α 及其下游的Glut-1 蛋白表達水平顯著增加的趨勢相反,這提示自噬活性增加時,炎癥因子的分泌減少。 這一結果明確了50 μmol/L濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 可調控自噬活化,抑制脂肪細胞炎癥因子的分泌,發揮保護細胞免于炎癥損傷的作用。 炎癥因子TNF-α 和IL-6 分泌可干擾胰島素信號通路轉導導致胰島素抵抗[20-21]。由此,本研究可進一步推測150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 可基于HIF-1α/自噬途徑激活自噬活性,抑制炎癥因子分泌進而改善脂肪細胞的胰島素抵抗發揮細胞保護作用。

綜上所述,本研究發現基于HIF-1α/自噬途徑,150 μmol/L 濃度的CoCl2干預脂肪細胞24 h 可調控自噬以依賴HIF-1α 的方式被活化,使脂肪細胞免于進一步的炎癥損傷,并改善脂肪細胞的胰島素抵抗,發揮其保護脂肪細胞的作用。 期望低氧調控自噬成為治療肥胖、2 型糖尿病的靶點,未來如何更加精準調控細胞的自噬活化強度,分析其治療肥胖和糖尿病的精確分子機制,仍需要更多更先進深入的研究。