大蒜素通過JAK2/STAT3 信號通路改善高糖誘導的人腹膜間皮細胞-間充質轉化

甘林望李乾程高利超劉 琦李 瑩王玉潔歐三桃*

(1.西南醫科大學附屬醫院腎病內科/四川省腎臟疾病臨床醫學研究中心,四川 瀘州 646000;2.西南醫科大學附屬醫院呼吸內科,四川 瀘州 646000)

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)是影響人們健康的重要疾病,據統計我國成人患CKD 的比例已超過10%,其中終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD) 患 者 約 為300 萬[1]。 腹 膜 透 析(peritoneal dialysis,PD)具有保護腎功能、維持血流動力學穩定、改善貧血等優點,已成為治療ESRD 的主要方式之一。 而當腹膜長期處于生物不相容性的高糖透析液時其組織結構容易損傷而引起結構重塑,使腹膜纖維化(peritoneal fibrosis,PF)透析效能下降,超濾衰竭發生從而制約腹膜透析技術在臨床上的應用[2]。 人腹膜間皮細胞的上皮細胞-間充質轉分化是長期處于腹膜透析患者的腹膜組織中很常見的病理特征,是導致腹膜纖維化始動使腹膜超濾衰竭的主要原因之一[3]。 EMT 表現為上皮細胞表型逐漸消失,成纖維細胞的標志物增加,合成細胞外基質的能力提升等特征,其病理過程復雜,與多種細胞因子和信號通路密切相關[4]。 截至目前,對于EMT 在纖維化的作用被廣泛研究,但腹膜間皮細胞發生EMT 的分子機制尚未清楚。

大蒜素(allicin,AL)是大蒜由水蒸氣蒸餾而得到的一種揮發油,是大蒜主要的有效成分[5]。 研究發現大蒜素在抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提升機體免疫力等方面發揮作用[6]。 大蒜素的抗纖維化作用是近年來新發現的藥理作用之一。 研究表明大蒜素可抑制胃癌、卵巢癌等多種癌癥的上皮間質轉化,抑制癌癥遷移和侵襲[7-8]。 許寧寧[9]的研究結果表明大蒜素可通過抑制炎癥反應和腎組織纖維化保護慢性腎功能衰竭的大鼠。 因此,大蒜素影響部分組織纖維化的過程,但目前其對于腹膜纖維化的影響尚不清楚。 本研究通過分析D-葡萄糖(Dglucose,DG)對細胞形態及細胞增殖、EMT 發生及JAK2/STAT3 信號通路的影響,闡明其介導EMT 發生的分子機制;同時,通過分析高糖誘導后進行大蒜素處理是否能改善EMT 和炎癥,為減少腹膜間皮細胞的損傷及改善腹膜透析相關性腹膜炎癥的預后提供理論依據,為大蒜素在臨床上的應用提供理論及實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

人腹膜間皮細胞株HMrSV5,購自Procell 公司,貨號:CP-H180。

1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖(Solarbio,貨號:G8150,規格:250 g);大蒜素(Solarbio,貨號:SA8720,規格:20 mg)。 ELISA檢測試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司,貨號:ZC-32420,ZC-32446,ZC-35733);肌動蛋白(β -actin)、酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、磷酸化的酪氨酸蛋白激酶2(p-JAK2)、磷酸化的信號轉導和轉錄激活因子(p-STAT3)、信號轉導和轉錄激活因子(STAT3)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、E-鈣粘蛋白(N-cadherin)、p65、pp65、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA)(abclonal,貨號:AC026,A19629,AP0531,AP0705,A19566,A20798,A7277,A19083,A19653,AP0123,A19607,A17910);生物素化山羊抗兔IgG(abcam,貨號:ab6721);人腹膜間皮細胞完全培養基(Procell,貨號:CM-H180);胰酶(Hyclone,貨號:SH30042.01);胎牛血清(TRAN,貨號:P20522);雙抗(Basalmedia, 貨 號: S110JV); CCK-8 試 劑 盒(Biosharp, 貨 號: BS350A); 無 菌 PBS 溶 液(Servicebio, 貨 號: G4202)。 倒 置 生 物 顯 微 鏡(LEICA,型號DMI1);臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司,型號TDZ4-WS);CO2培養箱(三洋電機國際貿易有限公司,型號:MCO-15AC);掌上離心機(賽洛捷克,型號:S1010E);酶標儀(Molecular Devices,型號:spectra max PLUS 384);垂直電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司,型號:JY-SCZ4+);電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,型號:JY200C);水平脫色搖床(江蘇科析儀器有限公司,型號:TY-80A);化學發光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司);電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司生產,型號:DZKW-4)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

將人腹膜間皮細胞HMrSV5 解凍離心后,用含10%胎牛血清的DMEM 培養基懸浮細胞在培養皿中進行接種,于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。

1.3.2 細胞分組及處理

分組1:培養人腹膜間皮細胞后將其隨機分為5組:①對照組;②8.5 mmol/L DG 組:8.5 mmol/L D-葡萄糖誘導組;③17 mmol/L DG 組:17 mmol/L D-葡萄糖誘導組;④34 mmol/L DG 組:34 mmol/L D-葡萄糖誘導組;⑤68 mmol/L DG 組:68 mmol/L D-葡萄糖誘導組。 除對照組外,其余各分別用8.5、17、34、68 mmol/L 的D-葡萄糖誘導48 h。 分組2:培養人腹膜間皮細胞后將其隨機分為6 組:①對照組;②HG 組:34 mmol/L D-葡萄糖誘導組;③AL-L組:34 mmol/L D-葡萄糖+低劑量大蒜素誘導組;④AL-M 組:34 mmol/L D-葡萄糖+中劑量大蒜素誘導組;⑤AL-H 組:34 mmol/L-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組;⑥JAK2 組:34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 抑制劑誘導組。 對照組不做任何處理,HG 組用34 mmol/L 的D-葡萄糖誘導48 h,AL-L 組、AL-M 組、AL-H 組用34 mmol/L 的D-葡萄糖預處理6 h 后分別用10、20 和40 ng/mL 大蒜素誘導48 h,JAK2 組加入1 μmol/L AG490 預處理6 h 后用34 mmol/L的D-葡萄糖誘導48 h。

1.3.3 CCK-8 分析

取對數生長期的HMrSV5 細胞,PBS 洗滌,胰蛋白酶消化后收集,250 r/min 離心5 min,吸除上清液,加入適量培養基使其成為單細胞懸液;細胞計數后調節細胞密度為4×104/mL,每孔100 μL 接種于96 孔板中,37℃、5% CO2恒溫培養。 待細胞貼壁后,根據1.3.2 進行分組并處理,用無血清培養基1 ∶10 稀釋CCK-8 試劑,加入已稀釋CCK-8 工作液每孔110 μL;并輕輕晃動培養板數次,37℃、5% CO2恒溫繼續培養2 h。 使用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光值,根據公式細胞相對存活率=(各組OD 值/對照組平均OD 值)×100%,細胞抑制率=(1-實驗組平均OD/對照組平均OD)×100%計算相應的細胞存活率及抑制率,并在光鏡下觀察細胞形態并拍照。

Grange 葛蘭許：又叫 Bin 95，俗稱澳洲酒王，為Penfolds旗下常規酒款中的最頂級，首個年份為1951。

1.3.4 ELISA 試劑盒檢測

根據ELISA 試劑盒說明書檢測各組細胞上清中白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量。

1.3.5 蛋白免疫印跡(Western blot)

使用總蛋白提取試劑盒提取各組人腹膜間皮細胞的總蛋白,并用BCA 法進行定量。 各組取等量蛋白質用的SDS-PAGE 進行分離,分離后的蛋白質轉移至PVDF 膜上,用5%的脫脂奶粉封閉1 h 后,加入β-actin、JAK2、 p-JAK2、 STAT3、 p-STAT3、 Ecadherin、MCP-1、N-cadherin、p65、p-p65、Vimentin、α-SMA 抗體,4℃孵育過夜后TBST 清洗,然后二抗孵育,TBST 清洗,ECL 暗室顯色。 顯色后的蛋白使用Bio-Rad 全功能成像系統采集圖像,Image-Pro Plus 軟件分析光密度,以β-actin 為內參,計算各組蛋白質的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計分析軟件進行統計分析,數據用平均數±標準差(±s)表示。 對于各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),對于組間均數的比較采用最小顯著差數(LSD)法,以P＜0.05 作為評定差異有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 HG 誘導對HPMCs 及JAK2/STAT3 信號通路的影響

2.1.1 HG 誘導對HPMCs 增殖的影響

與對照組相比,4 種濃度的葡萄糖都能不同程度地抑制HPMCs 的增殖。 其中8.5 mmol/L D-葡萄糖誘導組具有顯著性的統計意義(P＜0.05),其余3 組有極顯著性的統計意義(P＜0.01)。 34 mmol/L D-葡萄糖誘導組細胞的相對存活率是對照組的一半,其可以明顯抑制HPMCs 增殖,但不會過度抑制,所以選擇34 mmol/L D-葡萄糖為后續高糖誘導模型的濃度(見圖1)。

注:與對照組比較, *P＜0.05, **P＜0.01。圖1 高糖誘導對人腹膜間皮細胞增殖的影響Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 1 Effects of hyperglycemia on proliferation of human peritoneal mesothelial cells

2.1.2 HG 誘導對HPMCs 形態學變化的影響

注:異常梭形細胞(?)。圖2 高糖誘導對人腹膜間皮細胞形態學變化的影響Note.Abnormal spindle cells(?).Figure 2 Effects of high glucose induction on morphological changes of human peritoneal mesothelial cells

2.1.3 HG 誘導對HPMCs 發生EMT 的影響

通過Western blot 檢測不同濃度的D-葡萄糖對EMT 相關蛋白表達的影響。 與對照組比,34 mmol/L D-葡萄糖誘導組顯著下調E-cadherin 的表達(P＜0.05),68 mmol/L D-葡萄糖誘導組明顯下調Ecadherin 和 上調N-cadherin 的 表 達(P＜0.01);34 mmol/L D-葡萄糖和68 mmol/L D-葡萄糖誘導組明顯上調Vimentin 的表達,17 mmol/L D-葡萄糖、34 mmol/L D-葡萄糖和68 mmol/L D-葡萄糖誘導組均明顯上調α-SMA 的表達(P＜0.01)(見圖3)。

注:與對照組比較, *P＜0.05, **P＜0.01。圖3 高糖誘導對EMT 發生標志蛋白表達的影響Note.Compared with control group, * P＜0.05, * *P＜0.01.Figure 3 Effects of high glucose induction on the expression of EMT marker protein

2.1.4 HG 誘導對HPMCs 中JAK2/STAT3 信號通路的影響

結果見圖4,與對照組比較,34 mmol/L D-葡萄糖誘導組顯著上調p-JAK2的表達(P＜0.05),68 mmol/L D-葡萄糖誘導組明顯上調p-JAK2 和p-STAT3 的表達(P＜0.01);JAK2 和STAT3 蛋白表達在對照組與四種不同濃度的D-葡萄糖誘導組間無顯著性差異(P＞0.05)。

注:與對照組比較, *P＜0.05, **P＜0.01。圖4 高糖誘導對JAK2/STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Effects of high glucose induction on the expression of JAK2/STAT3 signaling pathway related proteins

2.2 大蒜素對HG 誘導的EMT 及其引起的炎癥的影響

2.2.1 大蒜素對HG 誘導的EMT 中HPMCs 增殖的影響照組和34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 抑制劑誘導組(見圖5)。

注:與對照組比較, **P＜0.01;與HG 組比較, ##P＜0.01。圖5 大蒜素對高糖誘導的EMT 中人腹膜間皮細胞增殖的影響Note.Compared with control group, **P＜0.01.Compared with HG group, ##P＜0.01.Figure 5 Effects of allicin on proliferation of human peritoneal mesothelial cells in EMT induced by high glucose

2.2.2 大蒜素對HG 誘導的EMT 中HPMCs 形態學變化的影響

通過CCK-8 檢測不同濃度的大蒜素對HPMCs增殖的影響,結果表明HG 的誘導明顯下調HPMCs的相對存活率。 相比于HG 誘導組,實驗中設置的不同濃度的大蒜素及均能明顯上調HPMCs 的相對存活率(P＜0.01)。 其中34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組的促增殖作用最佳并接近于對觀察HPMCs 形態學變化發現HG 的誘導后異常梭形的HPMCs 比例增多。 而與HG 誘導組相比,3 種濃度的大蒜素均能使異常的HPMCs 減少,并且大蒜素的濃度越高,異常形態細胞的比例就越少,其中34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組的細胞形態與對照組更接近(見圖6)。

注:異常梭形細胞(■)。圖6 大蒜素對高糖誘導的EMT 中人腹膜間皮細胞形態學變化的影響Note.Abnormal spindle cells(■).Figure 6 Effects of allicin on morphological changes of human peritoneal mesothelial cells in EMT induced by high glucose

2.2.3 大蒜素對HG 誘導的EMT 發生的影響

HG 誘導后E-cadherin 蛋白表達明顯下調,Ncadherin、Vimentin 和α-SMA 蛋白表達明顯上調(P＜0.01),而經3種濃度的大蒜素處理后,E-cadherin蛋白表達上調,N-cadherin、Vimentin 和α-SMA 蛋白表達下調。 其中34 mmol/L D-葡萄糖+中劑量大蒜素誘導組的E-cadherin、Vimentin 和α-SMA 蛋白表達與HG 誘導組有顯著性差異(P＜0.05),34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組、34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 誘導組的EMT 發生相關蛋白表達與HG 誘導組有極顯著差異(P＜0.01)。 34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組的EMT 發生相關蛋白的水平與對照組更接近(見圖7)。

2.2.4 大蒜素對HG 誘導的EMT 引起的炎癥的影響

如圖8 所示,HG 誘導后IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量明顯升高(P＜0.01),而用3 種濃度的大蒜素及JAK2抑制劑處理后含量明顯降低(P＜0.01)。其中34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組的IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平與對照組更接近。 HG 誘導后MCP-1 和p-p65 蛋白的表達明顯上調,經不同濃度的大蒜素及JAK2 抑制劑處理后MCP-1 蛋白表達明顯下調(P＜0.01),34 mmol/L D-葡萄糖+低劑量大蒜素誘導組p-p65 蛋白的表達顯著下調(P＜0.05),34 mmol/L D-葡萄糖+中劑量大蒜素誘導組、34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組和34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2 抑制劑誘導組p-p65 蛋白的表達明顯下調(P＜0.01)。 p65 蛋白的表達在不同組間均無統計學意義(P＞0.05)。 34 mmol/L D-葡萄糖+高劑量大蒜素誘導組的炎性信號蛋白的水平與對照組更接近。

注:與對照組比較, **P＜0.01;與HG 組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。圖8 大蒜素處理對炎性因子含量及炎性信號蛋白表達的影響Note.Compared with control group, **P＜0.01.Compared with HG group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Figure 8 Effects of allicin treatment on the content of inflammatory factors and expression of inflammatory signaling proteins

3 討論

上皮間質轉分化是一種有助于傷口愈合的現象,但其會造成一些纖維化的疾病,比如腹膜纖維化[10]。 在PD 患者中,防止EMT 的發生可以改善腹膜纖維化,保護腹膜的功能[11]。 人腹膜間皮細胞是導致腹膜纖維化的主動參與者,其通過EMT 轉變為成纖維細胞,對腹膜纖維化起到了重要作用[12]。 發生EMT 時,腹膜間皮細胞喪失黏附性及細胞間的緊密連接,獲得侵襲及遷移的能力,進而侵入腹膜間皮下緊密帶,并合成致炎因子、致血管生成因子和細胞外基質[3,13]。 本研究中用D-葡萄糖誘導后明顯抑制了HPMCs 的增殖,并使其細胞形態呈現異常的梭形,同時,與EMT 的發生相關的上皮細胞標志E-cadherin 表達下調,間充質細胞標志α-SMA、N-cadherin 和 Vimentin 表達上調,這與Liu 等[14]和趙星旭等[15]研究結果一致,揭示此時HPMCs 發生了上皮間質轉分化;而經大蒜素處理后,HPMCs 增殖明顯提高,異常形態細胞比例減少,促進EMT 發生的間充質細胞蛋白表達顯著降低,抑制EMT 發生的上皮細胞蛋白表達顯著升高,揭示大蒜素能通過影響HPMCs 的增殖及形態和調節EMT 發生蛋白的平衡可以顯著改善EMT。

JAK/STAT 信號通路是介導細胞因子信號轉導的關鍵通路,其通過參與調節上皮細胞間的黏附影響上皮細胞癌惡性病變中細胞EMT 的發生[16]。 阻斷JAK2/STAT3 信號通路時腹膜間皮細胞EMT 的發生被抑制[17]。 磷酸化的STAT3 形成二聚體后進入細胞核,促進纖維化和與促炎癥因子相關的靶基因的表達[18]。 本研究中經D-葡萄糖誘導后,磷酸化的JAK2 和STAT3 的表達明顯上調,揭示高糖誘導激活了JAK2/STAT3 信號通路促進了HPMCs 的上皮間質轉分化。

炎癥是腹膜纖維化的關鍵因素,其與纖維化相互誘導、相互促進[19-20]。 研究表明由免疫性細胞分泌的IL-1、IL-6、TNF-α 等促炎因子和IL-4、IFN-β、TGF-β 等抗炎因子在免疫反應和慢性炎癥中發揮著關鍵的作用[21]。 細胞核因子-κB(NF-κB)信號通路被激活后會使IL-1β、IL-6 和TNF-α 等細胞炎癥因子表達上調從而加劇炎癥反應[22]。 而NF-κB 是由p50 和p65 亞基組成的異源性二聚體,是一種重要的胞漿內表達的多功能核轉錄因子,其激活后參與機體的慢性炎癥、免疫反應等過程[23]。 MCP1 是機體內炎癥級聯的起始細胞因子,其分泌受到IL-1、TNF-α 等信號分子的誘導[24]。 本研究中用高糖誘導后HPMCs 的促炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 明顯升高,磷酸化的p50 比例升高,MCP1 表達明顯上調,揭示此時HPMCs 的炎癥加重,而大蒜素明顯緩解了HPMCs 的炎癥反應。

綜上所述,高糖能使EMT 發生蛋白、炎癥相關蛋白及細胞因子的表達異常,激活JAK2/STAT3 信號通路從而促進EMT 的發生,而大蒜素能通過恢復HPMCs 形態及增殖異常、調節與EMT 發生及炎癥相關的蛋白及因子的水平使其逐漸恢復正常從而改善HPMCs 的上皮間質轉分化及炎癥。