LncRNA FGD5-AS1 對口腔鱗狀細胞癌細胞惡性表型的影響

楊 鋒劉廣龍*王艷卿

(1.濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院口腔科,山東 滕州 277599;2.滕州市中心人民醫院手術室,山東 滕州 277599)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔常見的惡性腫瘤之一,具有高發病率、高惡性度和不良預后的特點[1-2]。 雖然在手術和放化療方面有很大進步,但OSCC 患者的總生存率并無明顯提高[3]。 癌細胞遠處轉移是OSCC 進展過程中的致命因素[4]。 長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)在惡性腫瘤(包括OSCC)進展中發揮重要作用[5-6]。 FGD5 反義RNA1(FGD5 antisense RNA 1, FGD5-AS1) 是一個新發現的LncRNA,在喉鱗狀細胞癌[7]、膠質母細胞瘤[8]、乳腺癌[9]等多種癌癥中呈高表達。 最近發現,FGD5-AS1 表達在OSCC 組織和細胞中異常上調,敲低FGD5-AS1 可 抑 制OSCC 細 胞 惡 性 行 為[10]。 但FGD5-AS1 在OSCC 中的作用機制尚未完全明確。

研究顯示,miR-129-5p 的表達水平在OSCC 組織中下調[11];且高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)的3’-非翻譯區(3’-UTR)與miR-129-5p 存在結合位點,miR-129-5p 可通過靶向負調節HMGB1 表達抑制癌細胞的惡性生物學行為[12]。 HMGB1 已被證實在OSCC 中呈高表達,與OSCC 的易感性和惡性進展有關[13-14]。 然而,FGD5-AS1 在OSCC 中的作用是否與miR-129-5p 和HMGB1 有關還未可知。 因此,本研究旨在探討FGD5-AS1 對OSCC 細胞生物學行為的影響并分析潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人口腔黏膜細胞(human oral keratinocytes,HOK)和OSCC 細胞(SCC-9、HSC-4、SCC-25、CAL-27)均購自美國ATCC 公司。

1.1.2 臨床樣本

2018 年1 月～2021 年1 月,從滕州市中心人民醫院口腔科獲得30 例OSCC 患者的腫瘤組織及鄰近的正常組織。 30 例OSCC 患者包括26 例男性,4例女性,年齡32 ～76 歲;TNM 分期:Ⅰ期3 例,Ⅱ期8 例,Ⅲ期9 例,Ⅳ期10 例;病理分化高17 例,病理分化低或中13 例。 納入標準:經病理診斷結果為OSCC 患者;術前未接受抗腫瘤治療。 排除標準:術前接受抗腫瘤治療或放療、化療的患者;患有其它類型腫瘤的患者;患有免疫系統疾病的患者;有嚴重的心臟、肺部等系統性疾病的患者;資料不完整的患者。 本實驗獲得本院科研倫理審查委員會的批準。 此外,每個參與者在研究前都簽署了書面知情同意書。 組織樣本立即在-80℃冰箱冷凍。

1.1.3 實驗動物

40 只SPF 級雄性BALB/c 裸鼠取自山東大學實驗動物中心[SCXK(魯)2019-0001],體重19 ～22 g,6 周齡,飼養于濟寧醫學院動物房內[SYXK(魯)2021-0030]。

所有小鼠都被飼養在18 ～22℃、濕度20%、光照/黑暗周期12 h/12 h 的特定無病原體條件下。所有動物實驗均經濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院動物倫理委員會批準(H20220513),符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

FGD5-AS1 小干擾RNA/過表達載體(si-FGD5-AS1/pc-FGD5-AS1) 及相應對照(si-NC/pcDNA)、miR-129-5p 模擬物/抑制物(miR-129-5p mimics/inhibitor)及相應對照(NC mimics/inhibitor)購自上海吉瑪制藥技術有限公司(批號: 20181019、20180511);Lipofectamine 3000 購自山東博科再生醫學有限公司(批號:20190322);RevertAid 第一鏈互補DNA(complementary DNA,cDNA)合成試劑盒購自北京百諾威生物科技有限公司(批號:20170605);SYBR Green PCR 試劑盒購自北京畢特博生物技術有限責任公司(批號:20150627);細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)購自武漢菲恩生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司(批號:20140520);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司(批號:20170825);HMGB1 抗體購自Abcam 公司(批號:20201123)。 FACSCalibur 流式細胞儀(美國BD 公司);ABI 7300 實時熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);Varioskan LUX 多功能酶標儀(美國Thermo Scientific 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 TANRIC 數據庫分析

采用癌癥非編碼RNA 圖譜(TANRIC)來獲取和分析FGD5-AS1 在OSCC 中的表達水平。 利用來自癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)的大規模RNA-seq 數據集來探索LncRNAs 的功能( http:/ /bioinformatics.mdanderson.org/main/TANRIC: Overview)。

1.3.2 細胞培養

HOK 細胞和OSCC 細胞(SCC-9、HSC-4、SCC-25、CAL-27)用添加1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養基,在37℃和5% CO2條件下培養。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測FGD5-AS1 和miR-129-5p 表達水平

組織和細胞的RNA 提取采用TRIzol 試劑。 利用RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒將RNA 反向轉錄為cDNA。 用SYBR Green PCR 試劑盒在ABI 7300 實時熒光定量PCR 儀上進行PCR 擴增。GAPDH 和U6 作為內部對照,采用2-ΔΔCt方法計算目標基因的相對表達量。 引物如下:FGD5-AS1,正向 5 ’-TTTGCTGTTTGATATTGG-3’, 反 向 5 ’-TGTTTTGAGTTGTCTTCG-3’;miR-129-5p,正向5’-ACCCAGTGCGATTTGTCA-3 ’, 反 向 5 ’-ACTGTACTGGAAGATGGACC-3’; U6, 正 向 5’-GCCAGCTCCTACATCTCAGC-3 ’, 反 向 5 ’-AGCCTGACTTGCTAGTGGATTAT-3’;GAPDH,正向5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3 ’, 反 向 5 ’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。

1.3.4 細胞轉染

CAL-27 細胞分為Control 組(正常培養,不轉染)、si-NC 組(轉染si-NC)、si-FGD5-AS1 組(轉染si-FGD5-AS1)、si-FGD5-AS1+NC inhibitor 組(共轉染si-FGD5-AS1 和NC inhibitor)和si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組(共轉染si-FGD5-AS1 和miR-129-5p inhibitor),轉染按照Lipofectamine 3000說明書進行。 轉染48 h 后,收集細胞。

1.3.5 細胞增殖能力檢測

CCK-8 法:轉染后的CAL-27 細胞置于96 孔板中。 在培養24、48、72 和96 h 后用CCK-8 檢測細胞活力。 最后,通過酶標儀記錄450 nm 處的光密度(OD)值。 以OD 值代表細胞增殖活力(簡稱細胞活力)。 克隆形成實驗:將細胞以每孔300 個細胞的密度接種到6 孔板中,在細胞培養箱中培養14 d。當克隆體肉眼可見時,培養終止。 棄去培養基,4%多聚甲醛固定細胞15 min,結晶紫染色15 min。 在顯微鏡下觀察并計數細胞克隆數(＞50 個細胞)。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

將各組CAL-27 細胞重懸于100μL 結合緩沖液中,分別與5 μL FITC-Annexin V 染色液和5 μL PI染色液一起孵育10 min,使用FACSCalibur 流式細胞儀評估細胞凋亡。

1.3.7 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

將各組CAL-27 細胞接種于6 孔板,培養24 h。當細胞鋪滿80%以上的板后,用無菌移液管劃傷單層細胞,觀察劃痕并拍照。 然后,將CAL-27 細胞在無血清DMEM 培養基中繼續培養24 h,再次觀察劃痕并拍照。 使用Image J 軟件計算劃痕愈合率。 劃痕愈合率=(0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%。

1.3.8 Transwell 小室檢測細胞侵襲能力

將各組CAL-27 細胞重懸在無血清培養基中,取200 μL 細胞懸液(2×104個細胞)加入到預涂有基質膠的上室,下室加入600 μL 含10%胎牛血清的培養基。 孵育24 h 后,將附著在膜下表面的細胞分別用甲醇和結晶紫固定和著色。 在顯微鏡下隨機選取5 個視野進行入侵細胞計數。

1.3.9 雙熒光素酶報告實驗驗證FGD5-AS1 與miR-129-5p 的靶向關系

將 WT-FGD5-AS1/MUT-FGD5-AS1 克 隆 到pmirGLO 雙熒光素酶載體中,構建pmirGLO-WTFGD5-AS1/MUT-FGD5-AS1 重組載體。 將pmirGLOWT-FGD5-AS1/MUT-FGD5-AS1 載體分別與miR-129-5p mimic 或NC mimic 共轉染至CAL-27 細胞。采用雙熒光素酶報告分析系統對熒光素酶活性進行評估。

1.3.10 Western blot 檢測HMGB1 蛋白水平

從OSCC 組織和細胞中提取總蛋白。 蛋白質用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脫脂牛奶封閉膜1 h。隨后,將膜與抗HMGB1、β-actin 的一抗4℃下孵育過夜,再與二抗孵育1 h。 顯影,使用ImageJ 軟件計算HMGB1 蛋白表達,β-actin 為內參。

1.3.11 裸鼠移植瘤實驗

將轉染陰性對照(sh-NC)、sh-FGD5-AS1、miR-129-5p inhibitor 或 sh-FGD5-AS1 與 miR-129-5p inhibitor 共轉染的CAL-27 細胞(5×106)皮下注射至BALB/c 裸鼠(n=5),記為sh-NC 組、sh-FGD5-AS1組、miR-129-5p inhibitor 組和sh-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組。 每周記錄移植瘤的寬度和長度,計算腫瘤體積:腫瘤體積=(長×寬2)/2。 5 周后處死小鼠,取腫瘤稱重。 將腫瘤組織一部分固定后制備石蠟切片,切片經常規脫蠟后進行Ki67、HMGB1 免疫組化染色,另一部分進行勻漿檢測FGD5-AS1 和miR-129-5p 表達。

1.4 統計學方法

SPSS 20.0 軟件進行統計分析,計量資料符合正態分布以平均數±標準差(±s)表示。 兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TANRIC 數據庫分析FGD5-AS1、miR-129-5p在OSCC 中的表達

TANRIC 平臺數據挖掘顯示,在OSCC 腫瘤組織中FGD5-AS1 的表達水平是正常組織的4 倍,見表1。 288 份OSCC RNA-seq 樣本中,FGD5-AS1 表達與OSCC 患者G 級較差相關,見表2。

表1 TANRIC 平臺獲得的人類OSCC 組織和正常組織中FGD5-AS1的表達水平(±s)Table 1Expression level of FGD5-AS1 in human OSCC tissues and normal tissues obtained from TANRIC platform

組織Organization n FGD5-AS1正常組織 Normal tissue 38 0.36±0.12腫瘤組織 Tumor tissue 297 1.29±0.35 t/16.239 P /0.000

表2 不同分級OSCC組織中FGD5-AS1的表達水平(±s)Table2 Expression level of FGD5-AS1 in OSCC tissues of different grades

表2 不同分級OSCC組織中FGD5-AS1的表達水平(±s)Table2 Expression level of FGD5-AS1 in OSCC tissues of different grades

注:與G1 比較,*P＜0.05。Note.Compared with G1,*P＜0.05.

級別 Classification n FGD5-AS1 G1 43 0.79±0.18 G2 178 0.98±0.25*G3 62 1.32±0.41*G4 5 1.51±0.43*

2.2 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC 中的表達

與正常組織相比,腫瘤組織中FGD5-AS1 表達顯著增加,miR-129-5p 表達顯著減少(P＜0.05),見表3。 與人口腔黏膜細胞HOK 相比,OSCC 細胞系SCC-9、HSC-4、SCC-25、CAL-27 中FGD5-AS1 表達明顯升高,miR-129-5p 表達顯著降低(P＜0.05),且CAL-27 細胞中FGD5-AS1 表達水平最高、miR-129-5p 表達最低,因此選擇CAL-27 細胞進行后續實驗,見表4。

表3 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC 組織中的表達水平(±s,n=30)Table 3 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC tissues

表3 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC 組織中的表達水平(±s,n=30)Table 3 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC tissues

組織 Organization FGD5-AS1 miR-129-5p正常組織 Normal tissue 2.13±0.34 2.43±0.31腫瘤組織 Tumor tissue 4.78±0.59 0.89±0.12 t 21.315 25.375 P 0.000 0.000

表4 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC細胞系中的表達水平(±s,n=6)Table 4 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC cell line

表4 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC細胞系中的表達水平(±s,n=6)Table 4 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC cell line

注:與HOK 比較,*P＜0.05。Note.Compared with HOK,*P＜0.05.

細胞系 Cell line FGD5-AS1 miR-129-5p HOK 1.00±0.03 1.03±0.08 SCC-9 2.46±0.12* 0.45±0.04*HSC-4 3.47±0.23* 0.42±0.06*SCC-25 4.35±0.29* 0.39±0.05*CAL-27 5.12±0.34* 0.35±0.03*

2.3 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞增殖的影響

si-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞中的FGD5-AS1 表達量、OD 值(48 h、72 h、96 h)、克隆細胞數顯著低于Control 組和si-NC 組(P＜0.05),見表5 和圖1。

圖1 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞克隆細胞數的影響Figure 1 Effect of interfering with FGD5-AS1 on the number of OSCC cell clones

表5 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞增殖的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of FGD5-AS1 interference on OSCC cell proliferation

表5 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞增殖的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of FGD5-AS1 interference on OSCC cell proliferation

注:與Control 組比較,*P＜0.05;與si-NC 組比較,#P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with si-NC group,#P＜0.05.

組別Groups FGD5-AS1 OD 值(450 nm)OD value (450 nm)24 h 48 h 72 h 96 h克隆細胞數(n)Number of cloned cells Control 組Control group 1.00±0.06 0.46±0.03 0.75±0.09 1.16±0.13 1.40±0.25 489.52±56.23 si-NC 組si-NC group 0.99±0.05 0.49±0.05 0.78±0.11 1.14±0.15 1.42±0.23 488.94±56.12 si-FGD5-AS1 組si-FGD5-AS1 group 0.21±0.02*# 0.47±0.06 0.53±0.08*# 0.67±0.12*# 0.75±0.16*# 245.61±37.45*#

2.4 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞凋亡、遷移、侵襲的影響

與Control 組和si-NC 組比較,si-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞凋亡率明顯上升,劃痕愈合率明顯降低,侵襲細胞數顯著減少(P＜0.05),見表6 和圖2。

圖2 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞凋亡、侵襲和遷移的影響Figure 2 Interference of FGD5-AS1 on apoptosis, invasion and migration of OSCC cells

表6 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞凋亡、遷移、侵襲的影響(±s,n=6)Table 6 Effect of FGD5-AS1 interference on apoptosis, migration and invasion of OSCC cells

表6 干擾FGD5-AS1 對OSCC 細胞凋亡、遷移、侵襲的影響(±s,n=6)Table 6 Effect of FGD5-AS1 interference on apoptosis, migration and invasion of OSCC cells

注:與Control 組比較,*P＜0.05;與si-NC 組比較,#P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with si-NC group,#P＜0.05.

組別Groups凋亡率(%)Apoptosis rate劃痕愈合率(%)Scratch healing rate侵襲細胞數(n)Number of invasive cells Control 組Control group 3.74±0.13 83.45±9.21 89.26±10.15 si-NC 組si-NC group 3.72±0.17 84.16±9.34 88.47±10.24 si-FGD5-AS1 組si-FGD5-AS1 group 8.69±0.35*# 37.58±2.57*# 28.76±1.89*#

2.5 FGD5-AS1 靶向調控miR-129-5p 表達

Starbase 軟件預測顯示FGD5-AS1 與miR-129-5p 可能存在相互作用關系,具體的結合位點如圖3A 所示。 與NC mimics+WT-FGD5-AS1 組比較,miR-129-5p mimics+WT-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞的相對熒光素酶活性明顯降低(P＜0.05),而NC mimics+MUT-FGD5-AS1組與miR-129-5p mimics+MUT-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞的相對熒光素酶活性無明顯變化(P＞0.05),見圖3B。 與si-NC 組比較,si-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞中miR-129-5p 表達升高(P＜0.05);與pcDNA 組比較,pc-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞中miR-129-5p 表達降低(P＜0.05),見圖3C。

注:A:FGD5-AS1 與miR-129-5p 的結合位點;B:驗證FGD5-AS1 與miR-129-5p 靶向關系的雙熒光素酶活性檢測結果,與NC mimics+WTFGD5-AS1 組相比,*P＜0.05;C:FGD5-AS1 靶向調控miR-129-5p 表達,與si-NC 組相比,*P＜0.05;與pcDNA 組相比,#P＜0.05。圖3 FGD5-AS1 靶向調控miR-129-5p 表達Note.A, Binding site of FGD5-AS1 and miR-129-5p.B, Results of dual luciferase activity detection to verify the targeting relationship between FGD5-AS1 and miR-129-5p.Compared with NC mimics+WT-FGD5-AS1 group,*P＜0.05.C, FGD5-AS1 targeted miR-129-5p expression.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Compared with pcDNA group,#P＜0.05.Figure 3 FGD5-AS1 targeted regulation of miR-129-5p expression

2.6 抑制miR-129-5p 可逆轉si-FGD5-AS1 對OSCC 細胞的影響

與si-FGD5-AS1 組和si-FGD5-AS1+NC inhibitor組相比,si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組CAL-27 細胞中miR-129-5p 表達顯著降低,48 h、72 h 和96 h 的OD 值顯著升高,克隆細胞數明顯增多,細胞凋亡率明顯下降,劃痕愈合率顯著增加,侵襲細胞數顯著增多(P＜0.05),見圖4 和表7。

圖4 抑制miR-129-5p 可逆轉si-FGD5-AS1 對OSCC 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響Figure 4 Inhibition of miR-129-5p can reverse the proliferation, apoptosis, invasion and migration of si-FGD5-AS1 on OSCC cells

表7 抑制miR-129-5p 可逆轉si-FGD5-AS1 對OSCC 細胞的影響(±s,n=6)Table 7 Inhibition of miR-129-5p can reverse the effect of si-FGD5-AS1 on OSCC cells

表7 抑制miR-129-5p 可逆轉si-FGD5-AS1 對OSCC 細胞的影響(±s,n=6)Table 7 Inhibition of miR-129-5p can reverse the effect of si-FGD5-AS1 on OSCC cells

注:與si-FGD5-AS1 組相比,*P＜0.05;與si-FGD5-AS1+NC inhibitor 組相比,#P＜0.05。Note.Compared with si-FGD5-AS1 group,*P＜0.05.Compared with si-FGD5-AS1+NC inhibitor group,#P＜0.05.

組別Groups miR-129-5p OD 值(450 nm)OD value (450 nm)24 h 48 h 72 h 96 h克隆細胞數(n)Number of cloned cells凋亡率(%)Apoptosis rate劃痕愈合率(%)Scratch healing rate侵襲細胞數(n)Number of invasive cells si-FGD5-AS1 3.38±0.32 0.48±0.04 0.55±0.10 0.69±0.14 0.78±0.17 245.74±38.21 8.57±0.29 36.75±2.63 29.46±2.04 si-FGD5-AS1+NC inhibitor 3.36±0.34 0.49±0.03 0.54±0.09 0.68±0.13 0.76±0.18 246.15±38.67 8.61±0.32 36.94±2.59 28.85±1.96 si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 1.21±0.15*# 0.51±0.07 0.81±0.16*# 1.21±0.16*# 1.45±0.27*# 497.89±86.52*# 4.03±0.11*# 84.24±5.62*# 91.26±7.38*#

2.7 FGD5-AS1 通過miR-129-5p 調控HMGB1 蛋白表達

與Control 組和si-NC 組相比,si-FGD5-AS1 組CAL-27 細胞中HMGB1 蛋白表達顯著降低(P＜0.05); 與 si-FGD5-AS1 組 和 si-FGD5-AS1 + NC inhibitor 組相比,si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor組CAL-27 細胞中HMGB1 蛋白表達顯著升高(P＜0.05),見圖5。

注:與Control 組相比,*P ＜0.05;與si-NC 組相比,#P ＜0.05;與si-FGD5-AS1 組相比,&P ＜0.05;與si-FGD5-AS1+NC inhibitor 組相比,△P＜0.05。圖5 各組OSCC 細胞中HMGB1 蛋白表達Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with si-NC group,#P＜0.05.Compared with si-FGD5-AS1 group,&P＜0.05.Compared with si-FGD5-AS1+NC inhibitor group,△P＜0.05.Figure 5 HMGB1 protein expression in OSCC cells of each group

2.8 FGD5-AS1 通過靶向miR-129-5p/HMGB1 促進體內OSCC 進展

結果如圖6 所示,與sh-NC 組相比,sh-FGD5-AS1 組腫瘤重量和腫瘤體積、FGD5-AS1 表達及Ki67、HMGB1 陽性細胞比例顯著降低,miR-129-5p表達顯著升高(P＜0.05),而miR-129-5p inhibitor 組腫瘤重量和腫瘤體積、FGD5-AS1 表達及Ki67、HMGB1 陽性細胞比例顯著升高,miR-129-5p 表達顯著降低(P＜0.05);與sh-FGD5-AS1 組相比,sh-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組和miR-129-5p inhibitor 組腫瘤重量和腫瘤體積、FGD5-AS1 表達及Ki67、HMGB1 陽性細胞比例顯著升高,miR-129-5p表達顯著降低(P＜0.05)。

注:A、B:移植瘤組織中FGD5-AS1 和miR-129-5p 相對表達水平;C:不同組皮下腫瘤的代表性圖像;D:腫瘤重量比較;E:腫瘤體積比較;F:免疫組化方法檢測腫瘤組織中Ki67、HMGB1 陽性表達。 與sh-NC 組相比,*P＜0.05;與sh-FGD5-AS1 組相比,#P＜0.05。圖6 FGD5-AS1 通過靶向miR-129-5p/HMGB1 促進體內OSCC 進展Note.A/B, Relative expression levels of FGD5-AS1 and miR-129-5p in transplanted tumor tissues.C, Representative images of subcutaneous tumors in different groups.D, Tumor weight comparison.E, Tumor volume comparison.F, Positive expressions of Ki67 and HMGB1 in tumor tissues were detected by immunohistochemical method.Compared with sh-NC group,*P＜0.05.Compared with sh-FGD5-AS1 group,#P＜0.05.Figure 6 FGD5-AS1 promotes OSCC progression in vivo by targeting miR-129-5p/HMGB1

3 討論

LncRNA 已被報道與OSCC 有關[15-16]。 有報道顯示FGD5-AS1 為OSCC 的潛在診斷生物標志物,FGD5-AS1 的敲低可抑制OSCC 細胞的增殖、遷移和侵襲。 本研究通過TANRIC 平臺的數據挖掘發現,FGD5-AS1 在OSCC 中呈高表達,且與預后不良相關[10]。 此外,本研究還發現,OSCC 組織樣本和細胞系中FGD5-AS1 表達升高,敲低FGD5-AS1 后,CAL-27 細胞增殖活力、遷移和侵襲能力均受到抑制,細胞凋亡增加,這與以往的研究結果一致,提示FGD5-AS1 可能在OSCC 中起促癌基因作用[10]。

LncRNA 可以海綿吸附調節miRNA 表達,進而調控癌癥進展[17]。 miR-129-5p 可作為抑癌因子阻礙胃癌、肺癌、乳腺癌等發展[18-20]。 在本研究中,miR-129-5p 在OSCC 組織和細胞中的表達均下降,這與Supic 等[14]的研究結果一致,說明miR-129-5p在OSCC 中發揮抑癌作用。 研究證實,在膠質瘤細胞中FGD5-AS1 通過調控miR-129-5p 刺激Wnt/βcatenin 信號通路進而促進細胞生長和侵襲[21]。 本研究發現miR-129-5p 與FGD5-AS1 的表達趨勢相反,Starbase 軟件預測miR-129-5p 可能是FGD5-AS1的靶基因。 本研究通過雙熒光素酶實驗和過表達/敲低FGD5-AS1 實驗證實了FGD5-AS1 和miR-129-5p 的負向調控關系。 此外,抑制miR-129-5p 可減弱敲低FGD5-AS1 的腫瘤抑制作用,提示敲低FGD5-AS1 可能通過上調miR-129-5p 表達,抑制OSCC 細胞的惡性生物學行為。

本研究通過數據庫預測和查閱文獻發現,HMGB1 是miR-129-5p 的靶基因[12],Western blot 證實干擾FGD5-AS1 在上調miR-129-5p 表達的同時可抑制HMGB1 蛋白表達。 為了進一步驗證FGD5-AS1/miR-129-5p/HMGB1 軸在OSCC 中的作用,本研究建立了體內異種移植瘤模型,發現沉默FGD5-AS1 可通過調控miR-129-5p/HMGB1 軸來減弱OSCC 細胞的腫瘤發生,與體外結果一致,提示FGD5-AS1 通 過 調 控 miR-129-5p/HMGB1 促 進OSCC 進展。 但尚需設計HMGB1 過表達以確定FGD5-AS1/miR-129-5p 在異種移植模型OSCC 中的作用。

綜上所述,FGD5-AS1 在OSCC 中表達上調,干擾FGD5-AS1 可通過靶向負調控miR-129-5p 表達,抑制OSCC 細胞增殖、侵襲和遷移并促進凋亡。 本研究為FGD5-AS1 在OSCC 中的機制研究提供新依據,有望為OSCC 患者提供一種潛在的治療策略。然而,miR-129-5p 下游的靶點眾多,FGD5-AS1/miR-129-5p 能否通過其他靶基因參與OSCC 進展尚需進一步探究。 此外,本研究僅使用一種細胞系進行FGD5-AS1 功能研究,后期將通過其他OSCC 細胞來進一步驗證FGD5-AS1 的致癌作用。