用于增強多金屬氧酸鹽抗腫瘤功效的靶向聚合物納米顆粒

萬 冬,張煜英,王 歡,姚田子,郭建輝,劉鈺君,張賽暉,潘 杰

根據世界衛生組織的數據,全世界每年死于癌癥的人數超過700 萬,預計到2030 年將超過1 310萬[1]。 癌癥已成為人類健康和生命的頭號敵人,給世界帶來了巨大的經濟負擔[2]。 為了提高癌癥的治療效率,新型抗癌藥物的研究仍然是一個挑戰。

多金屬氧酸鹽(Polyoxmetalates, POMs)是一組早期過渡金屬氧陰離子團簇,因其在催化、材料科學和醫學等領域的潛在應用而受到越來越多的關注[3-5]。 有趣的是,大多數影響POMs 與目標生物大分子識別和反應性的分子性質,如形狀、酸度、表面電荷分布、氧化還原電位和極性等,都可以通過改變反離子或引入有機基團來調整,這使得它們在醫學領域的應用,特別是在抗癌方面具有極大的吸引力[6,7]。 例如, Yamase 等設計了 [NH3Pri]6[Mo7O24]·3H2O (PM-8)來對抗人類肺部小細胞癌和乳腺癌[8,9]。 此外,根據Azizullah 小組的報告,發現Na12[α-P2W15O56]·24H2O 對Hela 和MCF-7 細胞[5]具有良好的抗腫瘤活性。 盡管POMs 有這些良好的特性和應用,但其水溶性差、毒性高嚴重限制了POMs 作為抗癌劑的發展,導致其治療效果較低,對正常組織器官的毒副作用嚴重[4,10]。 為了解決上述問題,設計一種低毒、高生物相容性和特異性靶向的新型聚合物納米顆粒(NPs) 是一種理想的策略。

近幾十年來,靶向聚合物NPs 在納米醫學領域引起了越來越多的興趣,主要用于治療和診斷癌癥[11]。 它們被認為是具有長循環效應的納米級給藥載體,極大提高了藥物的選擇性,從而減少了毒副作用,提高了治療效率。 一種方法是將聚乙二醇(mPEG1000)、D-α-生育酚聚乙二醇丁二酸(TPGS)等三維生物相容性聚合物移植或結合在NPs 表面,可避免被巨噬細胞的識別和清除[12,13]。 例如,甲氧基聚乙二醇-聚乳酸共聚物(mPEG-PLA)已被合成用于抗腫瘤藥物的臨床管理。 這種負載紫杉醇的NPs在體外表現出良好的立體穩定性,有望在血液循環[14]中實現長周期效應。 同時,通過修飾在NPs 表面的特定配體來實現靶向藥物傳遞,這些配體可以識別癌細胞并介導它們與癌細胞上的受體相互作用[15]。

Sun 等在2017 年描述了近紅外激光激活的帶有葉酸(FOL)修飾的NPs (Pt-IV-FINPs)可以選擇性地向表達葉酸受體的癌細胞傳遞藥物,以克服鉑基化療的缺點[16,15]。

因此,我們設計了POMs 負載FOL 修飾的靶向聚合物NPs,使POMs 具有水溶性,提高POMs 的體外生物相容性和穩定性,并通過將POMs 靶向遞送到腫瘤組織中來提高對腫瘤細胞的敏感性。 我們進一步報道了POMs 負載聚合物NPs 的理化性質,如粒徑、電位、形貌,以及體外對MCF-7 黑色素癌細胞的細胞毒性。 在這項工作中,我們將潛在的新一代金屬藥物(POMs)與聚合物材料(PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL)結合,形成多功能聚合物NPs。 它們將能夠同時實現長循環和靶向治療的功能,成為納米醫學領域的一個新的研究熱點。

1 材料與方法

1.1 材料

D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS3350)、FOL、 戊二酸均購自于 Sigma-Aldrich。 PLAmPEG1000購自于中國山東醫學儀器研究所。 在文獻[17](Inorg.Chem.2002,41,6112-6117)基礎上合成POMs(CTAB)7(TBAB)7[Eu(H2O)3(P2W17O61)]2。N,N′-二環己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)乙二胺均由國藥化學試劑有限公司提供。 二甲基亞砜(DMSO)、乙腈和吡啶由天津密歐化學試劑有限公司提供。三氯甲烷(TCM)、乙二胺由北京化工廠提供。 聚乙烯醇、細胞計數試劑盒-8 測定(CCK-8)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、胎牛血清(FBS)、杜氏改良鷹牌培養基(DMEM)、青霉素-鏈霉素溶液。

1.2 合成TPGS3350-FOL

按照圖1 所示,將FOL 修飾的TPGS3350的制備分為2 個部分。 簡單地說,將TPGS3350與DCC、戊二酸和DMAP 在10 mL DMSO 中反應,n(TPGS3350) ∶n(DCC) ∶n(戊二酸) ∶n(DMAP)= 1.0 ∶2.0 ∶2.0 ∶0.2,反應24 h 后,通過透析收集并凍干,合成TPGS3350-COOH。 然后將1 mmol FOL 溶于30 mL DMSO、2 mmol NHS 和1.2 mmol DCC 中,在避光條件中溶解6 h。 過濾后,進一步向反應體系中加入10 mmol 乙二胺,在吡啶催化下攪拌12 h。 用大量的乙腈沉淀FOL-NH2,離心收集,真空干燥。 最后,在去離子水中利用TPGS3350-COOH、NHS、DCC 和FOL-NH2, 生成 TPGS3350-FOL。 通過透析獲得TPGS3350-FOL 的最終產品,并用TEA 將pH 值調整到8.0 后凍干[18]。 用1H-NMR 在300 MHz 下對溶解于DMSO-d6中的TPGS3350-FOL 進行表征(德國Bruker AVANCE AV 300)。

圖1 TPGS3350-FOL 的合成路線Fig.1 The synthetic route of TPGS3350-FOL

1.3 帶有FOL 裝飾的POMs 負載納米粒子的制備

POMs 負載具有FOL 修飾的NPs 的制備方法為:將10 mg TPGS3350-COOH 和40 mg PLA-mPEG1000混合在3 mL 三氯甲烷中,首先用含5 mg POMs 的2 mL 三氯甲烷活化。 接下來,將上述溶液緩慢倒入60 mL 含0.5%聚乙烯醇的水溶液中,并在25 W 下超聲120 s。 通過旋轉蒸發1 h 去除三氯甲烷。 之后,在10 000 r·min-1下離心15 min,并用蒸餾水洗滌3 次, 真空過濾收集 PLA-mPEG1000/TPGS3350-COOH。 將過量的EDC 和NHS 加入到10 mL 去離子水中,分散20 mg PLA-mPEG1000/TPGS3350-COOH NPs 以激活TPGS3350-COOH 的羧基。 2 h 后,加入FOL-NH2,并用三乙胺調整pH 值至8.0。 最后通過水洗得到POMs 負載的 PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 納米粒子。

此外,POMs 負載的PLA-mPEG1000NPs 的制備與上述方法一致,只是未添加TPGS3350-COOH[18,19]。

1.4 NPs 的表征

將POMs 負載的PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL和PLA-mPEG1000NPs 分別用適量的去離子水稀釋至1 mg·mL-1。 利用Zeta 電位分析儀(ZETASIZER NANO)來測定含有或不含有TPGS3350-FOL 的POMs負載的NPs 的顆粒大小、尺寸分布和Zeta 電位。 同時,通過掃描電子顯微鏡(SEM,日立S4800,日本HITACHI)確認化合物的表面形態[19]。

1.5 POMs 載藥量和POMs 包封率

所有的NPs 都是采用納米沉淀法制備。 NPs 的載藥量和包封率是影響納米藥物遞送系統的重要因素,用熒光光譜法在393 nm 的激發波長下進行測量[18-20]。 POMs 載藥量和POMs 包封率計算如式(1)和式(2)。

式(1)和式(2)中:M為NPs 和POMs 的總質量;Ma為NPs 的質量;Mb為加入的POMs 質量。

1.6 體外細胞毒性實驗

通過細胞計數試劑盒(CCK-8)檢測NPs 的體外細胞毒性,用酶標儀(Perkin-Elmer)進行檢測。 將MCF-7 黑色素癌細胞培養約15 h。 隨后根據1.5 中的藥物負載情況,將負載的PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 和PLA-mPEG1000NPs 分別配制成藥物濃度為1、4 和10 μg·mL-1的溶液。 培養8 h 后,除去孔中含有藥物的培養基,然后用PBS 緩沖溶液洗2 次。之后,加入CCK-8 測定法,將細胞培養2 h,并記錄每孔的吸光度。 細胞存活率按參考文獻[18,19]計算。

2 結果與討論

2.1 TPGS3350-FOL 共聚物的表征

圖2 TPGS3350-FOL 共聚物在DMSO-d6中的1HNMR 譜圖。 可以看到,圖2 中化學位移3.51 處的—CH2—質子的核磁峰是TPGS3350中的mPEG1000。1.09 處的峰顯示了—TOS 的特征峰,TPGS3350-FOL共聚物中戊二酸和乙二胺的甲基和亞甲基的結構分別出現在1.25、1.50 ～1.80、1.90 ～2.10、2.69 和2.85 處。 FOL 的—COOH 特征峰位于11.53 處,這是該化合物的一個重要標志。 共聚物的其他質子位于6.63 和7.59 等處。 結果表明,成功合成了TPGS3350-FOL。

圖2 TPGS3350-FOL 共聚物在DMSO-d6 中的1H-NMR 譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of the TPGS3350-FOL copolymer in DMSO-d6

2.2 NPs 的表征

膠束懸浮液的穩定性是藥物遞送的一個重要指標,它由NPs 的粒徑和Zeta 電位決定。 長鏈PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 作為外層的親水結構,而POMs 作為疏水結構嵌入內層,通過靶向FOL 形成穩定的NPs。

圖3 顯示PLA-mPEG1000NPs 直徑約為200 nm,尺寸分布較窄。 PDI (Polydispersity index) 為0.194。 結果表明PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs的直徑約為220 nm。 PDI 為0.243。 據報道,傳統的抗腫瘤藥物分子在細胞攝取作用下,通過包埋、吸附或共價鍵作用,針對特定的受體和表面被吸收到細胞中。 從而提高化療藥物的水溶性、穩定性,減少其對正常組織和器官的毒副作用[4,10,21]。 此外,抗癌納米藥物的粒徑大小對靶向治療有很大影響。 當粒徑小于5 nm 時,容易被腎臟代謝掉;當粒徑大于250 nm 時,容易在脾臟、肝臟和肺部的毛細血管內蓄積[22,23]。 當平均粒徑在200 nm 左右時,它往往會在體內進行長時間的循環,并通過內皮細胞的活性過程而集中在腫瘤部位[24,25]。 NPs 表面較高的電荷可以產生強大的排斥力,從而阻止NPs在分散溶液中的聚集[26,27]。

圖3 NPs 的粒徑Fig.3 Particle size of NPs

此外,表面電荷是影響NPs 懸浮液穩定性的重要參數。 用粒徑電位儀測量出,PLA-mPEG1000NPs和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 均帶負電荷,它們的Zeta 電位分別為-35.3 和-18.6 mV。 認為NPs 的負電荷在體內長期循環過程中不容易與血紅蛋白結合,進而被癌細胞攝取,減少了機體的毒副作用[28,29]。

同時,用FESEM 檢測的粒度與激光光散射(LLS)測定的粒徑具有良好的一致性(圖4)。 可以看出,NPs 在這個分辨率下呈球形,表面光滑。 如圖4 所示,觀察到的膠束的平均粒徑約為140 nm。 據報道,平均粒徑小于200 nm 的NPs 在血液中的循環時間比粒徑較大的NPs 更長。 它可以保證藥物的長期的療效和在體內更長的循環時間[30]。

圖4 PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL 的POMs加載NPs 的FESEM 圖像Fig.4 FESEM image of POMs-loaded NPs of PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL

2.3 載藥量和包封率

PLA-mPEG1000NPs 和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的載藥量分別為6.523%和6.134%。 藥物包封率分別為(65.31 ± 0.446)% 和(61.45 ±0.586)%。 由此可見,PLA-mPEG1000NPs 表現出更高的載藥量和包封率,說明TPGS3350-FOL 的引入對兩者都有影響。 在本研究中,不同的材料和制備方法以及詳細的給藥參數都對藥物包封率和載藥量有很大影響。 我們選擇了一種簡單的納米沉淀法,NPs 的藥物包封率不高,這可能是由于在制備過程中,一些藥物分子從NPs 中擴散出去,被沖走所致。

2.4 體外細胞毒性

采用CCk-8 法對PLA-mPEG1000NPs 和PLAmPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 進行體外細胞毒性實驗。 圖5 分別顯示了其在4、8 和24 h 的不同藥物濃度下的細胞存活率,可以得出以下幾個結論。

圖5 PLA-mPEG1000 NPs 和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 制劑在不同藥物濃度下培養4 h、8 h、24 h 后MCF-7 小鼠乳腺癌細胞的體外細胞存活率Fig.5 In vitro cell viability of MCF-7 murine breast cancer cells with PLA-mPEG1000 NPs and PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs formulations after 4 h, 8 h, 24 h incubation at various drug concentration

(1) 在相同的POMs 濃度下,PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 對MCF-7 細胞的細胞毒性明顯高于PLA-mPEG1000NPs。 這可能與MCF-7 細胞中存在FOL 受體有關,TPGS3350-FOL 可被FOL 受體靶向識別,NPs 通過受體介導的內吞作用主動靶向癌細胞,導致癌細胞中化療藥物的數量高于未修飾FOL的NPs。 同時,說明合成的納米藥物具有較強的抗癌作用。

(2)我們還清楚地看到,隨著NPs 濃度的逐漸增加,細胞活性逐漸降低,毒性逐漸增強。 例如,當納米顆粒濃度低于50 μg·mL-1時,PLA-mPEG1000NPs 和PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPS 的細胞活性可達50%以上。

(3)培養時間越長,PLA-mPEG1000NPs 和PLAmPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的細胞毒性越高。 此外,PLA-mPEG1000NPs 在150 μg·mL-1培養24 h 的毒性比100 μg·mL-1時的毒性高40.46%。 PLAmPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的效果更為顯著,其在150 μg·mL-1培養24 h 的毒性比在100 μg·mL-1培養的毒性增加了65.05%。 當NPs 在100 μg·mL-1培養24 h,PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 的細胞存活率比PLA-mPEG1000NPs 低1.59 倍。 當NPs 在150 μg·mL-1下培養時,PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 中的細胞存活率比PLA-mPEG1000NPs 低2.71倍。 當PLA-mPEG1000/TPGS3350-FOL NPs 在200 μg·mL-1下培養24 h,存活率為(0.91±0.67)%,毒性很大,細胞幾乎死亡。 此外,圖5 清楚地表明,細胞存活率也呈現出相同的趨勢。 因此,我們可以得出結論,FOL 有助于提高細胞攝取。

3 結論

綜上所述,設計了一種POMs 負載FOL 修飾的靶向聚合物NPs,用于靶向治療癌癥。 這些構建物被充分地表征出來,并對MCF-7 小鼠乳腺癌細胞進行了體外實驗。 本研究設計的聚合物NPs 的結果表明,與傳統的藥物制劑相比,POMs 在腫瘤部位的生物活性靶向性和聚集性得到了改善,細胞內化得到了加強,從而具有顯著的抗癌活性和低毒副作用。 這種新型聚合物NPs 具有廣闊的臨床應用前景。