丹參-葛根提取物對小鼠動脈粥樣硬化的保護作用

張咪,張夢瑤,韓彥弢,趙文文

(青島大學基礎醫學院,山東 青島 266071)

心血管疾病是造成人類疾病死亡的主要原因,其中動脈粥樣硬化(AS)的發病率逐年升高[1]。AS常因冠狀動脈和腦動脈管腔閉塞或管壁破裂造成心肌梗死和腦卒中等嚴重后果,是老年人的主要病死原因之一[2]。目前AS的預防和治療除了運動和飲食以外,多采取他汀類降血脂、抗血小板、擴血管、溶栓和抗凝等藥物治療,以及動脈再通、冠狀動脈旁路移植等手術治療[3-4]。近年來,傳統中藥由于具有毒性低、效果好、安全性高等優勢被廣泛關注。丹參和葛根都是常見的中藥,對心血管疾病均起到很好的治療作用,同時兩者配伍使用還能夠達到氣血同治、生津通脈、活血化瘀等功效[5]。但是丹參和葛根協同治療AS的研究較少。本文研究利用ApoE-/-小鼠構建AS模型,探究丹參-葛根提取物(DG)對AS的影響,以期為DG的臨床應用提供依據?，F將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

丹參和葛根購買自安國市昌達中藥材飲片有限公司(中國,保定)。應用以下方法制備DG:將干燥的丹參、葛根粉碎并研磨成粉,各取100 g粉末置于1 L水中,25 ℃浸泡30 min,100 ℃提取45 min,重復此提取過程,冷凍干燥后制成粉末,4 ℃保存[6]。SPF級7周齡ApoE-/-雄性小鼠24只,購自濟南朋悅實驗動物繁育公司,其飼養與使用均嚴格按照國家動物衛生研究院《實驗動物飼養與使用規定》和青島大學倫理委員會的指導進行。Masson染色試劑盒和油紅O染色試劑盒購買自Solarbio公司(中國,北京)。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京建成生物公司(中國,南京)。

1.2 動物分組

ApoE-/-小鼠適應性喂養1周,隨機分為空白組(A組)、模型組(B組)、DG低劑量組(200 mg/kg,C組)和DG高劑量組(400 mg/kg,D組),每組6只?？瞻捉M小鼠正常飼料喂養16周,每天灌胃生理鹽水;模型組、DG低劑量組、DG高劑量組小鼠高糖高脂飼料喂養16周建立AS不穩定斑塊模型,模型組每天灌胃生理鹽水,DG低劑量組每天灌胃DG提取液200 mg/kg,DG高劑量組每天灌胃DG提取液400 mg/kg。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1標本采集 實驗結束后,將小鼠麻醉進行眼球取血,立即處死并將其固定在手術板上,沿頸部剪開皮膚,暴露右側頸總動脈,剪下管套兩端長度約為0.5 cm的血管。

1.3.2血清血脂水平的檢測 將采集的血液靜置30 min, 4 ℃、4 500 r/min離心20 min,取上清,應用ELISA試劑盒檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3組織學觀察 將離體的頸總動脈用40 g/L多聚甲醛固定2 h,PBS清洗后,置于300 g/L葡萄糖中,隨后加入OTC包埋劑,置于液氮中速凍,使用冷凍切片機切5 μm的薄片,冷凍。應用油紅O染色試劑盒和Masson染色試劑盒對各組小鼠主動脈脂質和膠原水平進行觀察,按試劑盒說明書方法進行操作。

1.3.4血清中氧化應激因子以及炎癥因子的檢測應用ELISA試劑盒,分別檢測各組小鼠血清氧化應激因子血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD),炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素12(IL-12)、可溶性細胞間黏附分子1(sICAM-1)、可溶性血管細胞黏附分子1(sVCAM-1)水平,按試劑盒說明書進行操作。所有實驗至少獨立重復3次。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 各組小鼠血清脂質水平比較

各組小鼠血清脂質水平比較差異具有顯著性(F=180.0～564.6,P<0.001),其中模型組小鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著高于空白組, DG低劑量組和DG高劑量組TG、TC和LDL-C水平較模型組顯著降低, DG高劑量組各指標低于DG低劑量組,差異均有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較

2.2 各組小鼠AS斑塊脂質水平比較

油紅O染色觀察顯示,空白組小鼠主動脈內膜光滑,未見明顯的病理改變;模型組小鼠主動脈內膜增厚、粗糙,能觀察到明顯的斑塊形成,并且紅色的脂質含量顯著升高。與模型組相比,DG低劑量組小鼠主動脈內膜變薄,斑塊形成明顯減少,脂質含量略降低;DG高劑量組小鼠主動脈內膜變光滑,幾乎觀察不到明顯的斑塊形成,厚度顯著變薄,脂質含量顯著降低(圖1)。

A:空白組;B:模型組;C:DG低劑量組;D:DG高劑量組。200倍。

2.3 各組小鼠AS斑塊膠原水平比較

與空白組相比,模型組小鼠冠狀動脈斑塊面積增加,藍色的膠原蛋白含量顯著降低;而DG低劑量組和DG高劑量組小鼠冠狀動脈膠原蛋白含量顯著升高,纖維帽的厚度增加,斑塊穩定性增加(圖2)。

A:空白組;B:模型組;C:DG低劑量組;D:DG高劑量組。Masson染色,200倍。

2.4 各組小鼠血清氧化應激分子水平比較

與空白組相比,模型組小鼠MDA水平顯著升高,SOD和GSH水平顯著降低;與模型組比較,DG低劑量組和高劑量組MDA水平顯著降低,SOD和GSH水平顯著增高,差異均具有統計學意義(F=133.0～194.7,P<0.001);并且DG高劑量組與DG低劑量組比較差異有顯著性(P<0.001)。見表2。

表2 各組小鼠血清中氧化應激相關分子水平比較

2.5 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

與空白組相比,模型組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-12、sICAM-1和sVCAM-1水平顯著升高;與模型組相比,DG低劑量組和DG高劑量組血清中炎癥因子的水平顯著降低,并且DG高劑量組各指標較DG低劑量組降低更明顯,差異有統計學意義(F=247.0～371.0,P<0.001)。見表3。

表3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

3 討 論

AS是一種慢性炎癥性疾病,是多種心腦血管疾病和外周動脈疾病的病理基礎[7]。AS的形成主要是由于血液中脂質成分沉積,導致平滑肌細胞和與A組相比,*F=247.0～371.0,P<0.001;與B組相比,#P<0.001;與C組相比,△P<0.001。

膠原纖維增多,進而形成粥糜樣含脂壞死病灶區,造成血管壁硬化[8]。因此,治療和預防AS的主要策略是降低脂質水平、抑制炎癥反應和氧化應激水平。AS不穩定斑塊一旦破裂就會引起一系列的急性疾病如腦卒中、急性心肌梗死等的發生,因此增加斑塊的穩定性也是一種重要的策略。

DG是經典的臨床配伍藥對,始見于《施今墨藥對》[5]。DG具有很好的抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等作用[9-11],在防治冠心病心絞痛、心肌缺血再灌注損傷、2型糖尿病、急性腦梗死、骨質疏松等方面已經有廣泛應用[12]。鑒于DG具有良好的抗炎抗氧化效果,本文探討其對AS的保護作用。

血液中TG、TC和LDL-C的過量和積累是形成斑塊的首要原因[13-14]。本文研究通過飼喂高糖高脂飼料構建ApoE-/-小鼠不穩定斑塊模型,結果顯示模型組小鼠TG、TC和LDL-C的水平顯著升高,提示AS模型建立成功;應用DG治療能夠降低TG、TC和LDL-C水平,使AS癥狀減輕。巨噬細胞和平滑肌細胞攝取沉積的脂質形成泡沫細胞,泡沫細胞聚集形成脂紋,隨后大量的膠原纖維、少數彈性纖維以及蛋白聚糖形成纖維斑塊[15-16];隨著膠原纖維的進一步聚集,泡沫細胞崩解,釋放溶酶體酶,促進其他細胞壞死,進而形成粥樣斑塊;不穩定斑塊一旦破裂就會導致血管栓塞[17-18]。本研究油紅O染色結果顯示,AS小鼠主動脈脂質水平顯著升高,形成了明顯的AS斑塊;而與模型組相比,DG低劑量組和高劑量組斑塊面積均明顯減少,DG高劑量組幾乎觀察不到斑塊的形成。Masson染色結果顯示,模型組小鼠血管壁內形成明顯的斑塊,并且斑塊中膠原含量很低,說明斑塊不穩定;DG低劑量組和高劑量組小鼠主動脈內斑塊面積減小,斑塊膠原含量高,斑塊穩定。提示DG對AS小鼠主動脈斑塊的形成和穩定性有明顯的抑制和改善作用。

氧化應激產生的ROS不僅對生物大分子如脂質、蛋白質等產生氧化作用,還參與細胞間信號傳導,從多個層面影響AS的發生發展[19]。LDL和氧化修飾LDL的氧化還原失衡會引發自由基的連鎖反應,引起嚴重的氧化應激反應,同時刺激單核細胞分化成巨噬細胞,進一步導致炎癥反應的發生[20-21]。MDA是膜脂質過氧化的最終產物[22],SOD是機體重要的抗氧化酶[23],而GSH是機體重要的過氧化物分解酶[24],這些物質的含量反映機體脂質過氧化的程度[25]。本研究結果顯示,AS模型組小鼠MDA的含量顯著升高,SOD和GSH的活性顯著降低;而經過DG治療后小鼠血清中MDA水平顯著降低,SOD和GSH水平顯著升高,AS小鼠體內的氧化應激水平降低。TNF-α和IL-12是巨噬細胞產生的炎癥因子,可以誘導細胞死亡和炎癥反應,促進AS的發展和易損斑塊的破裂[26]。內皮功能障礙是AS的早期指標,其特征表現為sICAM-1和sVACM-1的過度表達[27-28]。本研究結果顯示,AS小鼠血清中sICAM-1和sVACM-1表達水平升高,炎癥因子TNF-α和IL-12水平顯著增加;應用低劑量和高劑量DG治療后AS小鼠炎癥因子和內皮細胞相關黏附分子的表達降低,表明DG可以抑制AS發生過程的炎癥反應。

綜上所述,DG能夠通過降低脂質過氧化水平、抑制炎癥反應、減少斑塊面積以及提高斑塊穩定性等多種途徑來干預AS斑塊形成的多個重要過程,從而在AS的發生發展中起到保護作用。