METTL5對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響及機制

彭修法,王蕊紅,王曄,劉鳳娟,張春玲

(青島大學附屬青島市中心醫院,山東 青島 266042 1 呼吸與危重癥醫學科; 2 檢驗科)

2021年的統計數據顯示,肺癌位居全球癌癥相關死因之首,每年因肺癌死亡的人數達180萬,我國每年肺癌新發及死亡病人分別占全球的37.0%和39.8%[1-2]。肺癌主要分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌兩種類型,其中NSCLC占總數的85%左右,NSCLC中又以肺腺癌最常見[3]。除常規的放療、化療以及手術治療等手段外,近年來靶向及免疫治療獲得長足發展,使肺腺癌病人生存有了明顯改善,但晚期病人5年總生存率仍不足20%[4]。因此,仍需繼續探究肺腺癌發病機制,尋找新的治療靶點。據報道,近來作為研究熱點的m6A轉錄后修飾在腫瘤發生發展中發揮重要作用[5-7]。我們前期生物信息學研究發現,m6A相關修飾酶甲基轉移酶樣蛋白5(METTL5)在肺腺癌組織中高表達,并且其表達水平與病人總生存率呈負相關。本研究旨在進一步研究METTL5在肺腺癌中的可能作用,探討METTL5對肺腺癌細胞遷移、侵襲的影響及相關機制,從而為肺腺癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肺腺癌A549和H1975細胞系均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。無血清1640培養液(RPMI-1640)購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自Excell公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購自索萊寶公司;青鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶溶液購自Hyclone公司;一步凍存液購自海星公司;2×蛋白上樣緩沖液(2×loading buffer)、電泳轉移緩沖液(即轉膜液)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)緩沖液、TBST緩沖液購自Solarbio公司;40 g/L多聚甲醛固定液、結晶紫染液購自碧云天公司;Matrigel基質膠購自美國Corning公司;Anti-human METTL5多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG購自武漢愛博泰克公司;兔抗人E-Cadherin、Vimentin、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;METTL5的干擾慢病毒購自上海吉瑪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1生物信息學分析 首先在基因表達數據集(GEO)數據庫中搜索肺腺癌數據,下載數據集,分析METTL5的表達情況。利用GEPIA軟件根據METTL5的表達差異對肺腺癌病人進行生存分析,繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.2.2細胞培養、轉染及穩轉株篩選 A549及H1975細胞系使用RPMI-1640完全培養液(內含體積分數0.10 FBS和體積分數0.01的青鏈霉素雙抗)培養,培養箱條件為37 ℃、內含體積分數0.05的CO2。當細胞匯合度達到90%左右并處于對數生長期時,消化并重懸兩種細胞后接種于6孔板中,分別使用Control及LV3-METTL5-shRNA干擾慢病毒按照說明書進行轉染,分為Control組及shMETTL5組,72 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光。重新鋪板,加入嘌呤霉素使終質量濃度為5 mg/L,篩選METTL5敲低的穩轉株。

1.2.3Western blot法檢測 取經嘌呤霉素篩選后、鏡下可見熒光的兩組細胞,使用蛋白裂解液2×loading buffer裂解細胞提取蛋白樣品,并在95 ℃條件下金屬浴10 min使蛋白變性。吸取8 μL的樣品加入上樣孔中,140 V電泳60 min,200 mA轉膜90 min,用50 g/L脫脂牛奶進行封閉。1 h后以TBST清洗PVDF膜3次,分別與一抗Anti-human METTL5多克隆抗體(1∶1 000)和Anti-human GAPDH單克隆抗體(1∶2 000)室溫孵育2 h。用TBST清洗3次后將PVDF膜放于HRP標記的Anti-rabbit IgG二抗(1∶2 000)中孵育1 h。以TBST清洗后使用超敏發光液進行顯影。

1.2.4TranswellTM實驗檢測 在檢測遷移能力時,將處于對數生長期的Control組、shMETTL5組A549和H1975細胞消化并離心重懸,計數并將細胞密度調至1×108/L,向上室中每孔加入200 μL細胞懸液,并在下室中加入800 μL的RPMI-1640(含體積分數0.20 FBS),置于培養箱中培養24 h。棄上層液體,以PBS清洗2次,用棉簽拭去上室內的細胞,將小室置于多聚甲醛固定液中固定20 min,棄去固定液。清洗后將小室置于1 g/L結晶紫染液中染色15 min,再次清洗并晾干,放于顯微鏡下拍照計數。檢測侵襲能力時,先將Matrigel基質膠與RPMI-1640培養液以1∶20均勻混合后,向上室內每孔加入100 μL混合液,置于培養箱中過夜。其他條件同遷移能力檢測。

1.3 統計學方法

采用Graph Pad Prism 8.0.2軟件進行統計學分析。Western blot檢測所得的平均灰度值比值及TranswellTM實驗所得的細胞數均以x±s表示,兩組均數比較采用t檢驗;多組均數比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 生物信息學分析

對提取的GEO數據庫數據進行分析,結果顯示,肺腺癌組織中METTL5的表達顯著高于癌旁正常肺組織,差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1A)。使用GEPIA繪制Kaplan-Meier曲線,分析結果顯示,METTL5表達水平高的病人具有更短的生存期(P<0.05)(圖1B)。

A:METTL5在肺腺癌組織和癌旁正常組織中的表達;B:METTL5表達與肺腺癌病人生存之間的關系。

2.2 METTL5在肺腺癌細胞系中的表達

Western blot檢測結果表明,BEAS-2B、A549及H1975細胞中METTL5蛋白表達水平差異具有統計學意義(F=16.53,P<0.05)。與BEAS-2B細胞相比,A549及H1975細胞中METTL5蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);而A549細胞和H1975細胞中METTL5蛋白表達水平差異無統計學意義(P<0.05)(圖2)。

A:3種細胞系中METTL5蛋白表達的Western blot檢測;B:3種細胞系METTL5蛋白相對表達量比較。

2.3 敲低METTL5表達對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響

為研究METTL5在肺腺癌細胞中的作用,使用慢病毒敲低A549及H1975細胞中METTL5基因(圖3A)。Western blot檢測顯示,METTL5敲低后shMETTL5組兩種細胞METTL5蛋白表達水平較Control組顯著下調(t=8.403、4.222,P<0.05)(圖3B、C)。細胞遷移和侵襲實驗結果顯示,METTL5敲低后shMETTL5組兩種細胞遷移細胞數和侵襲細胞數均較Control組明顯減少(t=7.803～14.430,P<0.05),表明METTL5顯著促進A549、H1975細胞的遷移、侵襲(圖3D～G)。

A:慢病毒轉染后熒光效果圖;B:A549和H1975細胞的METTL5蛋白表達;C:慢病毒轉染后各組細胞METTL5蛋白相對表達量;D:TranswellTM遷移實驗用于驗證兩種肺腺癌細胞(A549、H1975)的遷移能力(結晶紫染色);E:A549和H1975細胞遷移能力的半定量分析;F:TranswellTM侵襲實驗用于驗證兩種肺腺癌細胞(A549和H1975)的侵襲能力(結晶紫染色);G:A549和H1975細胞侵襲能力的半定量分析。

2.4 敲低METTL5對肺腺癌細胞Vimentin和E-Cadherin表達的影響

本文Western blot檢測結果顯示,Control組和shMETTL5組兩種肺腺癌細胞Vimentin蛋白表達差異具有顯著性(F=155.40,P<0.05);與Control組相比,shMETTL5組兩種肺腺癌細胞Vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。Control組和shMETTL5組兩種肺腺癌細胞E-Cadherin蛋白表達差異具有顯著性(F=73.75,P<0.05);與Control組相比較,shMETTL5組兩種肺腺癌細胞的E-Cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖4。

A:各組兩種細胞Vimentin和E-Cadherin蛋白表達的Western blot檢測;B:各組兩種細胞Vimentin和E-Cadherin蛋白相對表達量比較。

3 討 論

近年來隨著肺癌篩查手段、靶向及免疫治療的不斷進步,肺癌病人的生存不斷改善,但肺癌病人死亡數仍高居惡性腫瘤死亡數之首,且轉移和復發的肺癌病人預后更差[8-9]。到目前為止,手術仍然是根治早期肺癌的唯一方法[10]。隨著分子生物學及靶向治療的發展,針對kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因(Kras)、表皮生長因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)等靶點突變及程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡受體-配體1(PD-L1)通路的新型靶向藥物層出不窮,肺癌的治療取得了長足進步[11-14]。但肺腺癌的靶向治療仍處于發展階段,因此尋找肺腺癌治療的新靶點具有重要意義。

m6A RNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾方式,是真核生物中最豐富的RNA修飾[15]。該修飾早在20世紀70年代就被發現,但其確切功能和調控機制在很大程度上仍然不清楚[6]。研究發現,m6A修飾在各種RNA中均豐富而保守,表明它能夠廣泛調控基因表達[16-17]。隨著研究的深入,m6A修飾在肺腺癌進展中的作用及機制也逐漸被揭示。YIN等[18]發現,線粒體RNA核糖核酸內切RNA組分(RMRP)在NSCLC中高表達,METTL3通過提高RMRPRNA的m6A水平增強其穩定性,通過調節轉化生長因子β受體1(TGFBR1)/SMAD蛋白2(SMAD2)/SMAD蛋白3(SMAD3)途徑促進NSCLC進展。因此,識別m6A相關基因、闡明它們在肺腺癌發生發展中的作用及調控機制對于肺腺癌治療至關重要。

METTL5是m6A甲基轉移酶家族中新發現的一個成員,與其他家族成員參與mRNA甲基化修飾不同,METTL5可以與tRNA甲基轉移酶112(TRMT112)結合形成異二聚體以獲得代謝穩定性,負責18S rRNA 1832位腺苷甲基化[19]。RONG等[20]應用公開數據庫及乳癌樣本分析METTL5表達與乳癌病人生存之間的關系,結果顯示乳癌病人METTL5高表達與較差的生存之間存在顯著相關性。METTL5基因敲除的乳癌細胞中多聚核糖體形成減少,細胞整體翻譯能力減弱,細胞周期發生停滯,細胞凋亡增加,表明METTL5可促進乳癌細胞生長。HUANG等[21]研究發現,METTL5可通過調節c-Myc水平提高胰腺癌細胞遷移、侵襲能力從而促進胰腺癌惡性進展。PENG等[22]的研究表明,METTL5通過靶向?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)促進肝細胞肝癌(HCC)細胞從頭脂肪生成并導致游離脂肪酸水平增加,使HCC細胞發生代謝重編程而促進HCC進展。然而,METTL5在肺腺癌中發揮的作用仍不清楚。我們在前期生物信息學分析中,通過對TCGA數據庫中肺腺癌的差異表達mRNA進行分析,篩選出與腫瘤分期相關樞紐基因METTL5,首次發現METTL5在肺腺癌組織中高表達并與肺腺癌病人的不良預后顯著相關。本研究結果顯示,METTL5在肺腺癌細胞系中的表達水平明顯高于正常肺上皮BEAS-2B細胞系,提示METTL5在肺腺癌中發揮促癌作用。為進一步探究METTL5在肺腺癌中的作用,本研究使用shMETTL5慢病毒轉染肺腺癌A549和H1975細胞系,檢測肺腺癌細胞的行為。體外細胞實驗結果顯示,轉染shMETTL5的肺腺癌細胞遷移、侵襲能力顯著降低,表明敲低METTL5基因能明顯抑制肺腺癌的進展。

EMT過程與癌癥進展密切相關,EMT發生時上皮細胞形態改變,細胞間連接消失,細胞失去極性轉變為具有轉移和侵襲能力的間質細胞,促進腫瘤的轉移與復發并使腫瘤細胞表現出明顯的治療抗性[23-24]。EMT過程中細胞發生了特征性的分子變化,具體表現為上皮標記物E-Cadherin表達降低,間質標記物Vimentin表達上調[25-26]。本文研究結果顯示,敲低METTL5基因表達能夠顯著抑制肺腺癌細胞的EMT,表明METTL5通過促進肺腺癌細胞EMT進程促進肺腺癌進展。在后續研究中我們將探討METTL5促進肺腺癌細胞EMT進程的具體分子機制。

綜上所述,METTL5在肺腺癌中高表達,其表達水平與病人預后呈明顯負相關;敲低METTL5基因表達可顯著抑制肺腺癌細胞遷移、侵襲,其機制可能是METTL5促進肺腺癌細胞EMT進程。本研究結果表明,METTL5可能在肺腺癌進展中發揮重要作用。因此,METTL5有望成為肺腺癌治療的潛在靶點及評估肺腺癌發生發展的重要標志物。