馬克斯克魯維酵母β-半乳糖苷酶合成條件的優化及其酶學性質表征

劉嬌嬌,孟金浩,梁權耀,曾婷靖,左恩輝,龐宗文,李樹波*

1(廣西大學 輕工與食品工程學院,廣西 南寧,530004)2(廣西大學 生命科學與技術學院,廣西 南寧,530004)

作為一種食品添加劑,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23)能夠水解乳糖為葡萄糖和半乳糖[1-2],被廣泛用于降低乳制品中乳糖含量,進而解決消費者中的乳糖不耐受問題[3]。近年來,隨著乳糖不耐受癥狀逐漸大齡化,β-半乳糖苷酶的需求也逐年增加[4-6]。β-半乳糖苷酶廣泛存在于動物、植物和微生物,而微生物源β-半乳糖苷酶具有周期短、產量高、不受季節氣候影響等特點而被廣泛應用于β-半乳糖苷酶的工業生產[7-9]。不同微生物源β-半乳糖苷酶酶學性質的差異性為其在不同環境中的應用奠定了基礎[10]。目前,微生物生產工業中主要使用的菌種包括:(1)乳酸克魯維酵母、脆壁酵母等酵母菌;(2)米曲霉、黑曲霉等霉菌,其酶最適溫度較高、最適pH偏酸性,適合面包及酸奶等酸性環境下使用[11-12]。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)常見于發酵乳制品當中,與乳酸克魯維酵母同為克魯維酵母屬,也是β-半乳糖苷酶的優質來源。它具備比乳酸克魯維酵母更強的耐熱性,使其在較高溫度的應用環境中更具有優勢。與此同時,馬克斯克魯維酵母作為生長速率最快的真核生物,其在β-半乳糖苷酶的生產過程中具備更高的效率[13]。雖然當前已報道的研究中有很多利用廉價碳源進行生產的研究,但對廉價氮源的利用卻少之又少,且產酶量不穩定。

本研究對馬克斯克魯維酵母GX-UN120最適產酶條件進行優化,選取幾種廉價氮源進行嘗試,并進一步對β-半乳糖苷酶的酶學性質進行表征,以期為不同環境中的工業應用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養條件

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)GX-UN120為廣西大學生命科學與技術學院龐宗文教授惠贈。馬克斯克魯維酵母接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)(10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖)中,40 ℃、150 r/min培養12～16 h,固體培養基則在37 ℃恒溫培養箱倒置培養。

1.2 試劑及儀器

蛋白胨、瓊脂粉、PBS、鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside,ONPG),北京索萊寶科技有限公司;酵母粉、胰蛋白胨,英國Oxoid公司;葡萄糖,上海滬試試驗器材股份有限公司;NaCl、乳糖、麥芽糖,成都金山化學試劑有限公司;FeCl2、FeCl3、CaCl2、MnCl2、MgCl2、CuCl2,天津歐博凱化工有限公司;大豆蛋白胨、玉米漿干粉,北京鴻潤寶順科技有限公司。

MQL-61R恒溫搖床,上海晏泉儀器有限公司;DHP-9082恒溫培養箱,上海齊欣科學儀器有限公司;BT103S分配型蠕動泵,保定雷弗科技有限公司;XO-400SD細胞破碎儀,南京先歐儀器制造有限公司;M200PRO光柵型酶標儀,瑞士TECAN公司;MINIC-100金屬浴,德譽實驗室設備。

1.3 最適產酶條件單因素優化

以YPD為初始培養基對GX-UN120產β-半乳糖苷酶的主要影響因素進行單因素優化,培養36 h獲得粗酶液的單位酶活力為指標。將培養基中碳源等量替換為蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖;培養基中氮源等量替換為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿干粉、(NH4)2SO4;發酵溫度分別為25、30、35、40、45 ℃(pH 6.5, 200 r/min);初始pH分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8(40 ℃、200 r/min);搖床轉速分別為0、50、100、150、200 r/min(40 ℃, pH 6.5)。

1.4 粗酶液的提取

將供試菌液以2%(體積分數)接種量接種于YPD液體培養基中,200 r/min,40 ℃培養36 h。取30 mL菌液離心10 min(4 ℃、8 000 r/min),棄去上清液,收集菌體。用pH 7.0,10 mmol/L的PBS重懸洗滌菌體。然后加入30 mL PBS并將其置于冰上進行超聲波細胞破碎(250 W, 5 s/5 s,20 min),細胞破碎液經8 000 r/min離心10 min后取上清液,經0.22 μm濾膜抽濾后即為粗酶液。

1.5 β-半乳糖苷酶的純化

1.5.1 (NH4)2SO4分級沉淀

將9個裝有10 mL粗酶液的燒杯置于冰水浴中,在磁力攪拌條件下緩緩向其中加入研磨后的(NH4)2SO4粉末,分別添加至不同飽和度(20%～90%)。繼續攪拌20 min后在4 ℃下靜置30 min。靜置后離心(4 ℃、8 000 r/min、15 min)取上清液,測定酶活力,以確定沉淀所用最佳的(NH4)2SO4飽和度。依照測定獲得的最佳(NH4)2SO4飽和度,緩緩向粗酶液中添加(NH4)2SO4粉末,取最佳(NH4)2SO4飽和度范圍內析出的沉淀物,于PBS中復溶后待后續實驗使用。

1.5.2 透析脫鹽

將1.5.1節中所獲得的復溶酶液裝入透析袋中,然后將其置于4 ℃冰柜中透析,每5 h換1次超純水直至粗酶液中電導率不再改變。

1.5.3 DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析

預先將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱用pH 6.5的PBS沖洗平衡4個柱體積,再將透析獲得的粗酶液上樣15 mL。分別使用濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl緩沖液進行沖洗,流速1 mL/min,洗脫180 min,每6 min收集1管洗脫液。最后將收集的洗脫液依次在280 nm下測定其吸光度并繪制洗脫曲線。對收集獲得的每一個洗脫峰進行乳糖酶活力檢測,將具有活性的洗脫液經透析脫鹽、凍干復溶后得到純化酶。

1.5.4 蛋白濃度檢測

粗酶液及純化酶中的蛋白濃度采用BCA法測定其質量濃度。

1.6 β-半乳糖苷酶的活性測定

采用ONPG試驗法測定[14]。以10 mmol/L,pH 6.5的PBS為溶劑配制質量濃度為1 mg/mL的ONPG溶液。取400 μL上述溶液于2 mL離心管中,35 ℃預熱10 min后,加入200 μL稀釋后的β-半乳糖苷酶酶液,于35 ℃反應15 min后加入2.5 mL,0.15 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,靜置5 min后,用酶標儀測定反應液在420 nm波長處的吸光度。將35 ℃條件下,1 min催化ONPG反應生成1 μmol鄰硝基苯酚(o-nitrophenol,ONP)的酶量定義為一個標準酶活力單位[15]。

最適溫度及熱穩定性測定:分別將200 μL酶液加入到400 μL提前預熱的ONPG溶液中,于25、30、35、40、45 ℃的金屬浴中反應15 min后測定其相對酶活力;將200 μL酶液于20、30、40、50、60 ℃的金屬浴中熱處理30 min后再測定其酶活力。

最適pH及pH穩定性測定:分別用pH 4、5、6、7、8、9的PBS溶液配制ONPG溶液,再加入200 μL酶液于40 ℃的金屬浴中反應15 min后測定其相對酶活力。將純化后的酶分別溶于pH 4、5、6、7、8、9的PBS中,30 min后取200 μL加入到對應pH的ONPG溶液中測定相對酶活力。

金屬離子對酶活力影響:用含有10 mmol/L不同金屬鹽的(CaCl2、CuCl2、MgCl2、ZnCl2、FeCl2、FeCl3、MnCl2)PBS配制ONPG溶液,再加入200 μL酶液后于40 ℃的金屬浴中反應15 min后測定其相對酶活力。

酶促動力學測定:以10 mmol/L,pH 6.5的PBS為溶劑分別配制質量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的ONPG溶液。分別取400 μL上述溶液與200 μL酶液于40 ℃的金屬浴中反應15 min后測定其相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 馬克斯克魯維酵母最適產酶條件單因素優化

2.1.1 碳源及氮源對菌株產酶量的影響

如圖1所示,不同碳源下GX-UN120的β-半乳糖苷酶產量呈現出顯著差異,以半乳糖和乳糖為碳源時的產酶量分別為21.8和19.5 U/mL,是以葡萄糖為碳源的7.7和6.9倍,這可能表示該菌株表達β-半乳糖苷酶的相關基因受乳糖操縱子調控。此外,除去常見的有機無機氮源外還選擇了2種廉價氮源,其中玉米漿干粉效果最佳產酶量達到了3.1 U/mL,推測為玉米漿干粉中的維生素及無機鹽對酵母產酶產生了促進作用。

a-碳源組;b-氮源組

2.1.2 培養基初始pH及溫度對菌株產酶量的影響

溫度通過影響菌體內相關催化酶的活性來影響菌體的生長和繁殖速率,從而影響其產酶量。如圖2所示,GX-UN120在40 ℃時產酶量最高,當溫度偏離40 ℃,產酶量與溫度的改變值均成負相關。此外,不同的初始pH對菌株產酶量也有類似的影響。pH為6.5時,菌株產酶量達到最大值,這表明菌株更偏好中性環境。

a-溫度;b-pH

2.1.3 搖床轉速對菌株產酶量影響

搖床轉速通過影響搖瓶發酵的溶氧量來影響菌株的代謝。由圖3可知,轉速<150 r/min時菌株的產酶量較低且轉速的改變對產酶量幾乎沒有影響。而轉速150 r/min時,菌株的產酶量最高。推測為β-半乳糖苷酶的表達需要一定量的O2激活,在未達到一定量的溶氧環境下以低水平進行本底表達。

圖3 轉速對菌株產酶量的影響

2.2 β-半乳糖苷酶的純化

2.2.1 (NH4)2SO4分級沉淀

由圖4可知,當(NH4)2SO4飽和度由300 g/L提高到400 g/L時,上清液的相對酶活力降低了61.01%,這表明大部分酶在300～400 g/L的飽和度間被沉淀了下來。因此,后續實驗中選擇保留300～400 g/L所獲得的沉淀,用10 mmol/L,pH 6.5的PBS復溶后于4 ℃冰箱保存待后續實驗使用。

圖4 添加不同濃度(NH4)2SO4后上清液的相對酶活力

2.2.2 DEAE-FastFlow陰離子交換柱層析

根據前期對該酶基因序列的測序結果,預測該酶的等電點小于7,因此選用DEAE-FF陰離子交換柱對該酶進行純化[16]。如圖5所示,分別在0.3、0.5、0.7 mol/L濃度的NaCl洗脫得到3個蛋白峰,檢測其洗脫液的乳糖酶活性發現0.3 mol/L NaCl洗脫獲得的活性峰具有β-半乳糖苷酶活性。純化結果如表1所示,純化后粗酶液比酶活力由1.41 U/mg提升至124.09 U/mg,純化倍率達到88.01倍,粗酶液中大量雜蛋白被除去,酶液得到了很大程度的純化。

表1 馬克斯克魯維酵酵母GX-UN120 β-半乳糖苷酶純化結果

圖5 馬克斯克魯維酵母β-半乳糖苷酶純化曲線

2.3 β-半乳糖苷酶性質表征

2.3.1 溫度對β-半乳糖苷酶影響

如圖6所示,從耐熱菌株GX-UN120中獲得的β-半乳糖苷酶的最適溫度為40 ℃,且在20～40 ℃該酶均表現出良好的熱穩定性,30 min熱處理后活力均可維持在90%以上。因此該酶能夠適應溫度跨度較大的工業環境,具備相應的工業應用潛力。

a-活性;b-熱穩定性

2.3.2 pH對β-半乳糖苷酶影響

pH影響酶的構象以及催化相關關鍵基團的解離狀態來改變酶活性。如圖7所示,來自GX-UN120的β-半乳糖苷酶最適pH為6;在偏酸和偏堿的環境下酶活力均較低;特別是在pH=4時酶活力下降至41.8%,可能是由于環境中H+的增加影響活性基團的解離。此外,該酶在中性環境下穩定性較高,30 min內酶活力能保持在90%以上。

a-活性;b-穩定性

2.3.3 金屬離子對β-半乳糖苷酶影響

不同的金屬離子與酶結合或改變酶的構象來影響酶的活力。如圖8所示,來自GX-UN120的β-半乳糖苷酶受到Cu2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+的抑制作用,其中Zn2+、Ca2+、Fe3+的抑制率均達90%以上。盡管Mg2+對該酶具有促進作用,但僅提高了6.97%,因此Mg2+可能不是作為其活性中心存在,而是幫助穩定酶蛋白的構象而起作用。

圖8 金屬離子對β-半乳糖苷酶的活性影響

2.3.4 酶促動力學常數

根據不同濃度底物濃度下酶促反應的反應速率,繪制Lineweaver-Burk雙倒數圖如圖9所示。根據其線性方程y=1.508 5x+0.285 5,可計算得到該酶的Km為5.28 mmol/L,Vmax為0.29 mmol/min。再根據公式Vmax=kcat[E0]可以計算得到kcat=4.74 s-1。

圖9 不同底物濃度酶促反應速率雙倒數圖

3 結論與討論

本研究對具有良好乳糖水解活力的馬克斯克魯維酵母GX-UN120進行了發酵條件的優化,在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米漿干粉、40 ℃、初始pH 6.5、150 r/min的條件下使其產酶量最高達到26.3 U/mL。鄭義等[15]對馬克斯克魯維酵母ZX-5的發酵條件進行了優化,在碳源優化上獲得了類似的結果;但以乳糖為碳源產酶量僅能達到最高產量的一半。本研究中以乳糖為碳源的條件下,可達最高產酶量的89.3%,因此考慮到底物成本等因素,在工業生產當中乳糖或許比半乳糖更具有優勢。同時,得益于這一性質,GX-UN120或許可以利用一些富含乳糖的工業副產物(如乳清等)來進行β-半乳糖苷酶的生產,從而進一步降低工業生產過程中的成本[17]。

對酶進行純化后進一步探究其酶學性質,其最適溫度為40 ℃,最適pH 6,Km為5.28 mmol/L、kcat為4.74 s-1、受到Mg2+的促進作用并且受到Ca2+、Zn2+、Fe3+的完全抑制作用達90%以上。酵母來源的β-半乳糖苷酶一般最適pH偏中性,因此適用范圍廣泛,但其最適溫度會受酵母種類的影響而產生較大差異[18]。黃倩等[19]研究的馬克斯克魯維酵母XL-B36所產乳糖酶受到Mg2+、Mn2+的促進作用,熱穩定性與GX-UN120性質類似但最適溫度為47 ℃。同樣的,鄭義等[15]研究的馬克斯克魯維酵母ZX-5受Mn2+的促進,但最適溫度為35 ℃。正是由于β-半乳糖苷酶性質的多樣性,使其在不同環境中的應用提供了選擇空間。本研究中所表征的β-半乳糖苷酶適用于中性環境,適用溫度范圍較廣,可在20～40 ℃保持穩定,具備良好的應用前景。