蘿卜泡菜母水中乳酸菌分離鑒定與發酵特性比較

胡此海,楊絮,郭全友*,李保國,鄭堯,黃海潮,范逸文

1(中國水產科學研究院 東海水產研究所,上海,200090)2(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)

泡菜是中國傳統發酵食品,是將蔬菜浸泡在質量分數6%～8%的鹽溶液中,在密閉環境中自然發酵數天所得,因其質地爽脆、香氣宜人和健康益處而深受消費者歡迎,被譽為“國粹”[1-2]。泡菜主要通過乳酸菌發酵產酸降低pH值,與食鹽的高滲透壓共同抑制有害微生物的生長繁殖。

目前,在泡菜中已經鑒定和報道了幾十種乳酸菌,主要為乳酸桿菌、魏斯氏菌、腸球菌和片球菌等菌屬[3-4]。乳酸菌通常被認為是安全的微生物,無論是天然存在菌群,還是添加直投式發酵劑,都在食品發酵和保存中發揮著重要作用[5]。泡菜微生物的研究主要集中在縮短泡菜成熟期[6],減少亞硝酸鹽[7-8],延長保質期,抑制致病菌[9-10],實現功能特性,改善感官質量[11]。母水發酵泡菜中丙二醇、甘油、甘露醇、乳酸和草酸等含量較高,且氨基酸種類更豐富,比自然發酵和接種發酵具有更好的風味和口感[12]。因泡菜母水中含有豐富的微生物,這些微生物是多輪使用后重新選擇出來的,具有更好的發酵性能。接種發酵可縮短泡菜發酵周期、降低亞硝酸鹽含量,但是發酵風味欠缺。已有文獻在篩選優勢發酵菌株時缺乏對菌株產風味物質的研究[6-8]。頂空-氣相色譜-離子遷移譜(headspace gas chromatography-ion mobility spectroscopy,HS-GC-IMS)可以提高風味檢測的準確性和靈敏度,有效解決GC-MS分析速度慢和前處理導致揮發性物質損失的問題[13]。近年來,GC-IMS已廣泛應用于食品風味分析和質量檢驗等許多領域[14-15]。

本課題組前期利用高通量測序技術對傳統發酵四川泡菜母水中的優勢微生物群落進行了研究,結果發現乳桿菌屬和片球菌屬是泡菜中的優勢微生物。本研究從四川傳統發酵泡菜母水中分離純化出來的乳酸菌株中篩選出優勢菌株,并探究其生長性能、產酸能力、耐鹽能力、耐亞硝酸及發酵產香的能力,以篩選出有可能用于泡菜發酵的乳酸菌,為其工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌株均分離自四川成都傳統發酵風味較好的蘿卜泡菜母水,蘿卜泡菜母水信息見表1。類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)CICC 24392購買于中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),作為標準菌株W0。

MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、細菌 DNA 試劑盒,北京索萊寶公司;NaOH標準滴定溶液,上海麥克林生化科技有限公司;酚酞、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaNO2等化學試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BX53光學顯微鏡,日本奧林巴斯株式會社;Bioscreen C微生物生長曲線分析儀,芬蘭Bioscreen公司;PHSJ-3F pH計,上海雷磁儀器廠;UV9100紫外可見光分光光度計, 北京萊伯泰科有限公司;FlavourSpecc?氣相色譜-離子遷移譜聯用儀,德國G.A.S.公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

取泡菜母水加入到MRS肉湯培養基中,37 ℃恒溫培養24 h進行富集。取菌株富集液10 mL于無菌錐形瓶中,加入90 mL生理鹽水,振蕩混勻后,進行梯度稀釋,吸取100 μL涂布于含有CaCO3的MRS培養基平板上,37 ℃培養48 h。挑取有溶鈣圈的菌株多次劃線純化,按照菌落形態學進行分類,三代劃線分離后得到純菌株[16]。經生理生化實驗,篩選出過氧化酶實驗、吲哚實驗、硫化氫實驗均為陰性的革蘭氏陽性菌株,4 ℃保藏待用。

1.3.2 16S rDNA分子鑒定

使用細菌基因組DNA提取試劑盒,按照說明書進行操作。使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增條件:35個循環(94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min),72 ℃末端延伸10 min,終止反應(4 ℃,∞)。吸取10 μL的PCR產物,加入2 μL 6×Loading Buffer混勻進行2%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳,將出現目標條帶的PCR樣品純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序。測序結果提交至GenBank數據庫中,利用BLAST比對并進行序列同源性分析,構建發育樹(MEGA 11軟件)。

1.3.3 發酵特性

1.3.3.1 菌株生長曲線

將活化菌株接種無菌微孔板中每孔加入180 μL MRS肉湯培養基,取106CFU/mL菌懸液20 μL接種至孔中并吹打混勻,每株菌平行5次實驗,無菌MRS肉湯作為對照。將微孔板放入微生物生長測定儀中37 ℃靜置培養,每1 h測定其OD600nm值,測量前振蕩60 s使菌體懸浮。Gompertz模型擬合按參考文獻[17]方法。

1.3.3.2 產酸性能測定

將活化菌株以體積分數為2%的接種量接種于MRS肉湯中,37 ℃培養72 h。間隔一定時間采用pH計測定發酵液pH值,總酸含量測定按照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》。

1.3.4 耐受性實驗

參考FESSARD等[18]的方法并修改,耐受性實驗結果以lg (OD24/OD0)表示:+++表示lg (OD24/OD0)>0.5為高速增長;++ 表示0.3

1.3.4.1 耐鹽能力測定

將活化菌株以體積分數為2%的接種量,接入含有2%、4%、6%、8%、10%、12%(質量分數,下同)NaCl的MRS肉湯中,加入到無菌微孔板中,每孔300 μL,無菌MRS肉湯作為對照,將微孔板放入微生物生長測定儀中37 ℃靜置培養,測量前振蕩60 s,測定0和24 h的OD600nm值。

1.3.4.2 耐亞硝酸鹽能力測定

將活化菌株以體積分數為2%的接種量,接入含有5、10、15、20、25、30 mg/L NaNO2的MRS肉湯中,加入無菌微孔板中每孔300 μL,無菌MRS肉湯作為對照,將微孔板放入微生物生長測定儀中37 ℃靜置培養,測量前振蕩60 s,測定0和24 h的OD600nm值。

1.3.5 降解亞硝酸鹽能力測定

將活化菌株以體積分數為2% 的接種量,接種到含有200 mg/L NaNO2的MRS肉湯中,在37 ℃下培養48 h后,發酵液待測。

按照 GB /T 5009.33—2010《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法測定并繪制亞硝酸鹽含量標準曲線,根據標準曲線計算亞硝酸鹽含量。

參考熊蝶等[19]的方法,亞硝酸鹽降解率按公式(1)計算:

(1)

式中:X,亞硝酸鹽的降解率,%;m1,菌株發酵48 h后培養基中NaNO2的質量,mg;m0,初始培養基中的NaNO2的質量,mg。

1.3.6 揮發性風味物質測定

將菌株以體積分數為2%的接種量接種于MRS肉湯培養基中37 ℃厭氧培養48 h,以8 000 r/min離心2 min,取上清液待測[20]。利用GC-IMS檢測菌株發酵后產生的揮發性風味物質[21]。

自動進樣條件:準確吸取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,孵育溫度40 ℃,孵化轉速500 r/min,孵育時間15 min,采用頂空自動進樣的方式,進樣量500 μL,進樣針溫度65 ℃,不分流模式進樣。

GC條件:采用強極性色譜柱MXT-WAX(30 m×0.53 mm, 1 μm),柱溫60 ℃,載氣N2(≥99.999%),載氣的流速程序:起始流速2 mL/min,保持2 min,8 min內升至10 mL/min,然后10 min內升至100 mL/min并保持10 min,運行時間30 min。遷移管溫度45 ℃,分析時間30 min。

數據分析:使用HS-GC-IMS儀器內置的NIST數據庫和IMS數據庫對揮發性化合物進行定性分析,運用Gallery Plot插件生成指紋圖譜。采用半定量的方法計算各揮發性物質相對占比。

1.4 統計分析

實驗重復測定3次,結果以平均值±標準差表示。通過統計軟件SPSS 26中進行方差分析及顯著性分析(置信區間為95%),利用Origin 2022b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離純化與初篩結果

從5種泡菜母水中共分離出36株菌株。通過含有CaCO3的MRS 固體培養基對富集液中的菌株進行初篩,挑取有溶鈣圈的菌株多次劃線純化,以篩選疑似乳酸菌。對疑似菌株進行形態學分類,革蘭氏染色及部分生理生化實驗,結果見表2。共發現過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、H2S實驗均為陰性和革蘭氏陽性菌株30株,初步鑒定為乳酸菌,編號為L1～L30。乳酸菌初篩分為5個類別,每種取代表性菌株進行分析,其中1種球菌和4種桿菌。

2.2 菌株的16S rDNA鑒定結果

將5株代表性菌株的16S rDNA部分基因序列提交至NCBI數據庫進行BLAST同源性比對,選取相似性高于99%的菌株序列構建系統發育樹(見圖1)。由圖1可知,L2、L3、L7、L15和L24分別與布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarun)和鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)的親緣關系最近。

2.3 乳酸菌生長能力與產酸能力

為了直觀評價5株目標乳酸菌的發酵性能,選擇中國工業微生物菌種保藏管理中心中推薦的傳統泡菜發酵菌種類腸膜魏斯氏菌作為對照菌株,編號為W0。由圖2-a可知,W0和L15菌株對數期為0～10 h,在10 h后進入穩定期;L7和L15對數期為0～15 h,在15 h后進入穩定期;L2和L3對數期為0～21 h,在21 h后進入穩定期。在達到穩定期后,5株目標菌株的OD值均高于標準菌株W0,其中L15和L24的OD值較高分別為1.5和1.8。通過修正Gompertz模型進行擬合,結果見圖2-b。L15和L24的最大比生長速率最高可達0.07 h-1左右,但L24有較長的遲滯期(3.04 h)。L15的遲滯期為1.32 h,比W0的遲滯期(1.18 h)長,但顯著短于其余菌株(P<0.05)。因此,5株乳酸菌生長能力均較好,L15和L24具有最大生長比速率和較短遲滯期,更適合作為泡菜發酵菌株。

a-生長曲線;b-模型擬合

乳酸菌可以利用碳水化合物產生乳酸等有機酸,帶來泡菜獨特的酸爽風味,并使pH值快速下降,從而達到抑制有害微生物的作用[22]。從圖3可看出,菌株處于生長對數期時,微生物含量不斷增加,并持續產酸,使總酸含量快速增加,pH值持續下降。乳酸菌生長進入穩定期后,pH值趨于平緩。L7、L15和L24產酸能力較強,發酵至48 h時pH 值降至3.75,產總酸在72 h后可達到2.00 g/100 mL;L2和L3與W0產酸能力接近,pH發酵至穩定期時pH值降至4.20,但因它們生長速率慢于W0,產酸速率也較慢。結果表明,L7、L15和L24具有較強的產酸能力,其中L24產酸能力最強,可能因為生長速度較快,這有利于乳酸等有機酸的快速積累,以抑制有害微生物生長繁殖。ZHU等[23]利用高通量測序手段從多種傳統發酵食品中篩選一批產酸菌株,發現鼠李糖乳酪桿菌產酸能力較好,與本研究結果一致。

a-pH值;b-總酸含量

圖4 GC-IMS指紋圖譜

2.4 乳酸菌耐受性

2.4.1 耐鹽能力

鹽含量使泡菜具有較高的滲透壓,抑制腐敗菌的生長,有利于泡菜的保存,因此發酵菌株對鹽含量的耐受性非常重要[24-25]。由表3可知,隨著鹽含量的不斷升高,各菌株生長速度也隨之減少。菌株L15和L24的耐鹽能力較好,8%鹽含量時菌株生長速度可達到中等增長,但在10%和12%條件下,菌株耐受性能力開始顯著下降。L3在6%鹽含量時可以較好生長,但8%時增長速度顯著下降。L2和L7在6%鹽含量時生長狀態為低速增長,對鹽含量的耐受能力較差。W0的耐受性最差,在4%鹽含量時只能低速增長。目標菌株具有較好的鹽含量耐受性,可能因為泡菜母水中高滲透壓環境的馴化。歐雪等[26]采用不同鹽含量(2%、5%、8%,質量分數)接種發酵泡菜,結果8%鹽含量的微生物生長較差且風味較差,與本實驗研究結果一致。

表3 菌株對NaCl的耐受性

2.4.2 耐亞硝酸鹽能力

泡菜發酵過程中會產生亞硝酸鹽,因此泡菜發酵菌株需對亞硝酸鹽有一定耐受性。對不同菌株在5～30 mg/L的NaNO2耐受性進行研究,結果見表4。隨著亞硝酸鹽含量的增加,各菌株的生長量均無變化,可見各菌株對亞硝酸鹽均具有較好的耐受性。在同一濃度亞硝酸鹽的脅迫壓力下,只有L7菌株中速增長,與其他菌株的耐受性存在差異性。

表4 菌株對亞硝酸鹽的耐受性

表5 各菌株培養48 h后對NaNO2的降解率

2.5 降亞硝酸鹽能力

泡菜發酵過程中由于雜菌所含的硝酸還原酶導致亞硝酸鹽含量的增加[27],根據GB 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》對于蔬菜及其制品(腌漬蔬菜)的規定,亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg,因此菌種對亞硝酸鹽的降解能力非常重要。實驗結果表明5株目標菌株和1株對照菌株均具有較高的降解 NaNO2的能力,降解率都達到90.00%以上,其中L2和L3降解能力更強,與其余菌株存在顯著性差異(P<0.05)。

2.6 揮發性風味物質測定

揮發性風味是衡量泡菜品質的一個重要指標,故研究泡菜發酵菌種產揮發性風味物質能力是篩選泡菜發酵菌種的重要指標。通過 GC-IMS 技術在接種菌株培養48 h的發酵液中共定性了27種揮發性風味物質(包括單體和二聚體),其中酸類1種、醇類9種、酯類8種、酮類4種、醛類4種和其他物質1種。為對比不同菌株發酵液產生的揮發性風味物質區別,采用Gallery Plot插件生成指紋圖譜。在指紋圖譜中,每一列代表同一揮發性有機物在不同樣品中的信號峰,每一行代表一個樣品中的全部揮發性風味物質。為了方便觀察比較,將變化規律相似的物質排在一起比較。由圖5可知,5種目標菌株都比對照菌株W0產生揮發性物質種類更多。L2的特征揮發性物質主要有乙酸乙酯二聚體、丙烯腈、乙酸和環己酮等物質,其中環己酮具有薄荷香氣。L3特征揮發性物質是2-丁酮單體、叔丁醇、2-甲基丁醛二聚體、乙酸和乙偶姻等物質。2-甲基丁醛二聚體和1-戊醇代表L7菌株發酵液的特征揮發性物質。異戊烯醛、反-2-己烯醛、庚醛和甲酸乙酯單體是L15的特征風味物質。1-丁醇、乙酸異丙酯二聚體、甲酸乙酯二聚體、3-甲氧基-3-甲基丁醇、異丁醇、1-丙醇單體、乙酸丁酯是L24菌株發酵后所具有的特征揮發性物質。丙酮、2-甲基丁醛單體、乙醇、乙酸乙酯單體、乙酸甲酯為6株菌株發酵所共有揮發性物質。

為進一步研究6株菌株產揮發性物質的差異性,通過峰體積歸一化法對各樣品中揮發性風味物質的組成進行分析,詳細見電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035228)。從化合物類別來看,W0樣品中醛類物質占比最高,具有水果特征香氣;L3樣品中酮類物質占比最高,顯著高于其他樣品(P<0.05),可以產生薄荷香氣等刺激性氣味;L15樣品中醇類物質占比最高,其中乙醇相對含量顯著高于其他組別(P<0.05);L24樣品中酯類物質的占比最高,主要是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯和乙酸異戊酯的相對含量顯著高于其他組,酯類物質提供香蕉、菠蘿蘋果等香氣。這表明菌株產風味物質的能力具有差異性。各菌株所產特征揮發性物質也存在差異。W0可以產生更多2-甲基丁醛單體(9.23±0.10)%和丁酸乙酯(1.02±0.05)%,顯著高于其他組別,可以產生果子香氣;L2樣品中檢測到乙酸異丙酯單體含量高(1.46±0.09)%;L3菌株可以產生更多叔丁醇、環己酮和乙偶姻;L7菌株的1-戊烯-3-醇、丙烯腈和1-戊醇含量最高;L15菌株產1-丙醇、乙醇、1-丁醇、3-甲氧基-3-甲基丁醇、異丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸異丙酯二聚體、2-丁酮的相對含量顯著高于其他菌株(P<0.05);L24菌株可以產生更多乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、1-丙硫醇單體、丙烯腈等物質,其中2-甲基丁酸甲酯相對含量為(16.06±1.23)%顯著高于其他菌株(P<0.05),具有青蘋果樣香氣。

3 結論

為豐富傳統四川泡菜發酵菌種庫,對四川成都地區泡菜發酵母水優勢菌株篩選,分離得到30株菌,經過16S rDNA序列同源性分析,得到2株布氏乳桿菌、1株短乳桿菌、7株乳酸片球菌、12株植物乳植桿菌和8株鼠李糖乳酪桿菌。進一步對5種乳酸菌生長曲線和產酸曲線測定以及對NaCl和亞硝酸鹽的耐受性實驗,與標準菌株W0進行對比。結果發現,L7、L15和L24具有更好的生長繁殖和產酸能力;L3、L15和L24對NaCl的耐受性強,其中L24在10%(質量分數)NaCl還能保持低速增長;L7對亞硝酸鹽的耐受性較差與其他菌株存在顯著性差異;5株乳酸菌均具有90%以上的亞硝酸鹽降解能力。從菌株發酵液中共檢測出27種揮發性成分,其中L3樣品中酮類物質含量最高;L15樣品中醇類物質含量最高;L24樣品中酯類物質的含量最高,主要是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯和乙酸異戊酯的相對含量顯著高于其他組,酯類物質提供香蕉、菠蘿、蘋果等香氣。綜上所述, L15和L24具有良好的發酵特性和產揮發性物質種類豐富,L2和L3可以產較多酮類物質,L7可以產生較多的1-戊烯-3-醇和1-戊醇,因此5種乳酸菌具有發酵泡菜潛能,可作為發酵泡菜功能菌株資源。