識別α-synuclein N端結構域的單克隆抗體鑒定及免疫應用

賈煥珍 焦 潔 高 歌#* 楊 慧#*

(1.首都醫科大學燕京醫學院中心實驗室,北京 101321;2.首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系 北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所 北京市神經再生修復重點實驗室 神經變性病教育部重點實驗室, 北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是第二大神經退行性疾病,其主要病理特征是黑質致密部多巴胺能神經元變性、丟失及殘存神經元中路易體的形成。PD除了出現肌僵直、運動遲緩、靜止性震顫、姿勢步態異常等運動癥狀外,還出現嗅覺障礙、便秘、快速動眼睡眠障礙等非運動障礙,并且非運動癥狀出現早于運動癥狀10～20年,當患者出現運動癥狀后,其疾病已經到不可挽回的地步,因此對于PD的早期診斷和治療顯得尤為重要。α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)是PD患者腦中路易體的主要成分,對疾病的發生發展起到關鍵作用。在生理條件下,α-syn不僅存在于黑質、丘腦、皮質和海馬以及神經膠質細胞,也在心臟、肌肉等外周組織中表達。它能結合突觸囊泡并調節神經遞質的釋放,在突觸功能和可塑性中起重要作用[1],它能促進囊泡與細胞膜結合,維持線粒體內鈣穩態,增強內質網和線粒體膜之間的相互作用[2]。而在病理狀態下,α-syn失去其天然結構并聚集成富含β片的原纖維殘基, 第5～8、14～31和50～57氨基酸決定原纖維生長速率[3]。許多因素會影響α-syn聚集,包括環境、點突變、C末端截斷和翻譯后泛素化、磷酸化和硝化等修飾[4],其聚集和傳播在疾病的發生發展中起到重要作用。因此,α-syn可以作為PD的潛在診斷生物標志物、治療靶點以及疾病進程的判斷標準。

針對α-syn的特異性抗體是用于α-syn作為生物標志物的試劑盒的制備、PD的免疫治療,以及發病機制的探索必不可少的。α-syn由140個氨基酸組成,由于其N端有一個跨膜序列,能與膜結構結合,因此,被認為是其發揮毒性作用的關鍵結構域。此外,由于α-syn的C端結構域的129絲氨酸的磷酸化作為PD的毒性形式,增加毒性α-syn聚集和傳播[5],針對N端的抗體可以避開129位磷酸化的位點,可以用作雙抗夾心酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)中的捕獲抗體捕獲α-syn,為識別129 位絲氨酸磷酸化的抗體留出抗原識別表位。本實驗室已經成功研發針對129位絲氨酸磷酸化的單克隆抗體[6]。因此,本課題組制備了針對其N端的α-syn抗體,并進行了抗體效價的初步篩選和鑒定,為PD的發病機制的研究和治療提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Thy1-α-syn轉基因小鼠(Line 15)購于美國Jackson實驗室,實驗動物許可證編號:0214AX18,雄性,月齡:9個月。小鼠采用數字表法隨機分為2組:轉基因小鼠組(Thy1-α-syn transgenic mice,TG)及同窩對照野生小鼠組(wild-type mice, WT)。動物倫理審查文件編號(AEEI-2020-017)。

1.2 抗體制備

根據實驗室前期制備單克隆抗體的方法[6],篩選出克隆號為1C16、2B8、2P21、3O18和1J6這5種單克隆抗體。簡述如下:使用N端序列內肽段(Ac-TKEGVVHGVAT-NH2)行皮下免疫BALB/c小鼠,選擇小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞(Sp2/0)融合成雜交瘤細胞,采用間接酶聯免疫吸附法初步篩選出5株可識別免疫肽段的單克隆抗體用于后續驗證。

1.3 試劑

大腸桿菌BL21感受態細胞購于中國Tiangen公司;抗α-syn抗體購于美國Santa cruz公司; 抗β-actin抗體購于中國華安生物公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購于美國Pierce公司;考馬斯亮藍染液購于美國Biotium公司;SepharoseTM4B Beads購于美國GE公司;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)、硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)和超濾管購于美國Millipore公司;5×上樣緩沖液、放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay, RIPA)全細胞裂解液購于中國普利萊公司;人凝血酶購于中國Solarbio公司;異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)購于美國Abcam公司;明膠購于北京化工廠。

1.4 蛋白純化

實驗室前期已經成功構建了人源谷胱甘肽S 轉移酶(glutathione S-transferase, GST)-α-syn蛋白(human-α-syn,h-α-syn)的融合蛋白重組質粒 pEGX-4T-1-h-α-syn[7],以及鼠源α-syn蛋白(mouse-α-syn,m-α-syn)、β-syn蛋白、人源α-syn/N蛋白、人源α-syn/ΔN端蛋白重組質粒,根據文獻[8-9]的方法對這5種蛋白重組質粒進行體外純化。簡述如下:IPTG誘導大腸桿菌表達質粒,裂解菌體后提取重組蛋白,使用人凝血酶行GST標簽切割,經純化柱洗脫,收集蛋白樣品,分別得到單體h-α-syn純蛋白、m-α-syn純蛋白、β-syn純蛋白、h-α-syn/N純蛋白、h-α-syn/ΔN端純蛋白,經濃縮柱濃縮。

1.5 考馬斯亮藍染色

將體外純化后的5種蛋白加入Loading buffer后,行12%(質量分數)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),結束后的凝膠浸沒在裝有考馬斯亮藍染液的暗盒中,水平搖床上孵育1 h,隨后用洗脫液洗去非特異結合,使用Gel DocTMEM Imager儀器(美國Bio-Rad公司)拍攝結果。

1.6 斑點印跡法(Dot blotting)檢測

使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)將各種重組蛋白稀釋成100 ng/μL,取1 μL滴于0.3%(質量分數)明膠包被的NC膜上,常溫晾干,用5%(質量分數)脫脂牛奶封閉1.5 h,三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽(triethanolamine buffered saline,TBS)/tween 20(T)洗膜3次,每次5 min。加入一抗,于孵育盒內4 ℃ 孵育過夜,TBS/T洗膜3次,加入熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBS/T洗膜3次,Odyssey掃描儀(美國LI-COR公司)成像。

1.7 蛋白印跡法檢測蛋白質表達

冰上取小鼠皮質,加入RIPA裂解液后冰上孵育30 min,行超聲裂解。4 ℃ 12 000g離心30 min,取上清使用BCA法測蛋白質濃度,進行12%(質量分數) SDS-PAGE電泳,半干轉法將蛋白轉移至PVDF膜,5%(質量分數)脫脂牛奶孵育1 h,一抗于4 ℃ 孵育過夜,TBS/T洗膜3次,加入熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBS/T洗膜3次,Odyssey掃描儀成像。

2 結果

2.1 制備h-α-syn、m-α-syn、β-syn、α-syn/N、α-syn/ΔN蛋白

α-syn分為3個結構域(圖1A),N端是指1～60氨基酸(1～60 aa),非β淀粉樣結構(nonamyloid component,NAC)區是61～90氨基酸(61～90 aa);C端是指91～140氨基酸(91～140 aa)。在大腸桿菌BL21感受態細胞表達h-α-syn質粒、m-α-syn質粒、β-syn質粒、α-syn/N質粒和α-syn/ΔN質粒后,誘導表達后提純的蛋白進行考馬斯亮藍染色(圖1B),結果顯示,在m-α-syn、h-α-syn和β-syn組的相對分子質量17 000位置出現蛋白條帶,說明α-syn蛋白和β-syn蛋白純化成功。α-syn/N和α-syn/ΔN蛋白條帶的相對分子質量分別在9 000和13 000。結果說明這5種形式的蛋白純化成功,可以用作標準抗原檢測抗體的效價。

圖1 體外制備不同的α-syn蛋白全長及結構域Fig.1 Preparation of full length and different domains of α-syn protein in vitro

2.2 初步篩選識別h-α-syn全長和α-syn/N蛋白的抗體及效價檢測

免疫小鼠的肽段序列為:TKEGVVHGVAT(圖2A),其位于α-syn的第44～54個氨基酸,即N端結構域內序列。取h-α-syn(100 ng/μL)、m-α-syn(100 ng/μL)、β-syn(100 ng/μL)、α-syn/N-1(100 ng/μL)和α-syn/N-2(150 ng/μL)蛋白,各1 μL滴于NC膜上。Dot blotting結果顯示了篩選出的單克隆抗體的識別區域。結果顯示,市售的商品化抗體Santa Cruz (sc-69977)作為陽性對照抗體僅識別h-α-syn和m-α-syn,而不識別α-syn/N肽段(圖2B膜1)。在不同的稀釋比例下(1∶5 000和1∶10 000)單克隆抗體1C16(1.5 mg/mL)只識別h-α-syn蛋白全長,不識別m-α-syn和β-syn(圖2B膜2和3)。單克隆抗體2B8(1.5 mg/mL)在1∶5 000的比例下識別h-α-syn、m-α-syn和α-syn/N,而在1∶10 000的比例下不再識別m-α-syn(圖2B膜4和5)。在2種不同的稀釋比例下,單克隆抗體2P21(1.5 mg/mL)也只識別h-α-syn蛋白全長(圖2B膜6和7)。單克隆抗體3O18(1.5 mg/mL)在1∶5 000的比例下對h-α-syn、m-α-syn的識別比較弱,但是對α-syn/N的識別比較強,而在1∶10 000的比例下僅對α-syn/N有微量識別(圖 2B膜8和9)。在1∶5 000的比例下,單克隆抗體1J6(1.5 mg/mL)識別h-α-syn、m-α-syn、β-syn和α-syn/N蛋白,而增加稀釋比例后在1∶10 000的稀釋比例下,1J6僅識別h-α-syn、m-α-syn和α-syn/N蛋白(圖 2B膜10和11)。結果顯示1C16只能識別h-α-syn蛋白全長,1J6是特異性識別N端α-syn的蛋白,而抗體2B8雖然有類似的結果,但是它的識別效率比較低。

圖2 使用Dot blotting方法篩選識別h-α-syn全長和α-syn/N蛋白的抗體Fig.2 Using Dot blotting to detect the antibodies that could recognize the full length of h-α-syn and α-syn /N protein

2.3 篩選識別α-syn/N蛋白和α-syn/ΔN蛋白的抗體

取1 μL的h-α-syn、β-syn、α-syn/N和α-syn/ΔN純蛋白(100 ng/μL)加于NC膜上,用于進一步驗證各個抗體的識別區域。Dot blotting 結果顯示:在1∶10 000的稀釋比例下,1C16(1.5 mg/mL)抗體不識別α-syn/N蛋白,而識別α-syn/ΔN純蛋白。2B8抗體既識別全長α-syn,也識別α-syn/N蛋白和α-syn/ΔN純蛋白。2P21抗體識別全長α-syn和α-syn/ΔN純蛋白。3O18抗體與2B8類似,既識別全長α-syn,也識別α-syn/N蛋白和α-syn/ΔN純蛋白,只是效價更低。1J6抗體識別全長α-syn和α-syn/N蛋白,不識別α-syn/ΔN蛋白,對β-syn有比較低的識別效價(圖3)。

圖3 篩選識別α-syn/N結構域和α-syn/ΔN結構域的抗體Fig.3 Screening antibodies to recognize α-syn/N domain and the α-syn/ΔN domain

2.4 在動物腦組織中驗證1C16和1J6是否能用于Western blotting

Dot blotting實驗初步驗證了1C16和1J6能識別非變性狀態下的純蛋白。接下來驗證其是否能識別變性蛋白。使用1C16檢測變性處理后的α-syn、β-syn、α-syn/N、 α-syn/ΔN純蛋白(各1 μg)和 TG、WT(各10 μg)小鼠皮質提取蛋白,Western blotting結果顯示,抗體1C16(1∶10 000)孵育后,α-syn純蛋白和TG小鼠樣品組均在17 000的位置出現條帶,在13 000的α-syn/ΔN純蛋白組也出現條帶(圖4A),不識別變性后的β-syn純蛋白,同一張PVDF膜進行β-actin抗體孵育,作為上樣內參(圖4B)?？贵w1J6(1∶10 000)僅能識別變性狀態下的9 000的α-syn/N純蛋白(圖4C),為了驗證上樣量的準確性,同一張PVDF膜進行1C16(1∶10 000)和β-actin抗體孵育,結果顯示,α-syn純蛋白和TG小鼠樣品組均有存在α-syn(圖4D)。這提示,抗體1C16可以識別變性的人源的α-syn,而1J6不識別變性后的全長α-syn純蛋白。

圖4 使用Western blotting 方法驗證1C16和1J6對變性蛋白的識別情況Fig.4 Using 1C16 and 1J6 to verify the recognition of denatured proteins by Western blotting

3 討論

α-syn是由140個氨基酸組成的蛋白質,其結構分為N端(1～60 aa),該結構域內含有7個KTKEGV不完全重復序列,使α-syn與磷脂具有較高的親和性而易于與富含磷脂的細胞膜結合;高度疏水性的NAC區(61～90 aa),該結構域在介導α-syn聚集過程中纖維結構的形成中起到重要作用; C端(91～140 aa)富含酸性殘基和脯氨酸,產生無序而靈活的結構域。PD患者腦中路易體內主要由全長α-syn組成,其中90%為129位絲氨酸磷酸化形式的α-syn[10],此外還有少量約10 000～15 000的α-syn各種截短體[11]。α-syn的幾種天然C-末端截短形式(1～119或1～122)可能在促進α-syn聚集中及體內的纖維生成中起關鍵作用。在PD患者腦和α-syn轉基因小鼠中,發現C端截短的α-syn積聚在軸突,這與神經元功能障礙相關[12]。

研究者根據不同的研究目的設計了不同的抗體,比如syn-O1、 -O2、 和 -O4和Syn-10H能識別α-syn的寡聚體,Syn-F1 及Syn-F2是針對識別α-syn的纖維而設計的抗體[13],1H7、5C1、CT(A1-A6)是識別α-syn的C端的抗體,值得一提的是,PRX002是第一個被用于治療PD的抗體藥物[14],NAC32和VH14是針對NAC區研發的抗體,NAC32能降低A53T細胞株的神經毒性[15]。由于N端能與膜結構結合,因此針對它的抗體比較少。也有針對α-syn單一位點的抗體,比如針對129絲氨酸的磷酸化抗體[6]。本課題組研發針對N端的特異性單克隆抗體除了可以探討α-syn引起PD的發病機制、免疫治療,還可以用于開發PD早期診斷試劑盒。N端抗體對α-syn的特異性捕捉,可以留出引起聚集的NAC結構域和C端結構域,針對這2個區域的大量的抗體可以作為捕獲抗體,可以應用在檢測α-syn和p-α-syn的ELISA診斷試劑盒中。

由于α-syn/N端的TKEGVVHGVAT有更高的表位活性,因此,使用此序列進行免疫用于制備單克隆抗體。為了篩選出特異性識別N端的抗體,不僅純化了人源α-syn全長蛋白,也純化了m-α-syn蛋白、β-syn蛋白、h-α-syn/N和h-α-syn/ΔN純蛋白,其中α-syn/N(9 000)的條帶與電泳前沿雖然沒有形成明顯的分離,但是膠前沿的條帶是在α-syn/N的下方,因此能證明α-syn/N純蛋白制備成功。在鑒定α-syn/N蛋白的時候,電泳前沿著色是溴酚藍作為跑膠的指示劑加入到需要鑒定的蛋白質內的,而在后期鑒定中Dot blotting實驗并不加入溴酚藍,同樣在Western blotting實驗中使用特異性抗體檢測目的蛋白,溴酚藍也不會著色。因此不會影響其專一性,也不會出現交叉反應。結果提示,1J6 可以作為識別 α-syn /N 的抗體,1C16 和2P21 可以用于識別 α-syn /ΔN 的抗體,2P21 的效價較1C16 低。 2B8 和 3O18 抗體不能用于 α-syn 檢測。Dot blotting 結果篩選出抗體1J6可以作為識別α-syn/N,1C16可以用于識別α-syn/ΔN的抗體。Western blotting 進一步驗證了這2種抗體對變性蛋白的識別情況。結果提示,抗體1C16可以識別非變性的人源α-syn純蛋白和小鼠腦組織中的變性的人源α-syn蛋白,不識別鼠源的α-syn和β-syn?？贵w1J6僅識別非變性的人源的α-syn及α-syn/N純蛋白, 不識別變性后的全長α-syn純蛋白和小鼠腦組織中的變性人源α-syn蛋白,可以用于雙抗夾心的ELISA的捕獲抗體。

綜上,本課題組初步篩選出2種可以應用于ELISA和Western blotting檢測的特異性識別α-syn/N端結構域的單克隆抗體及初步效價檢測,將進一步驗證其在ELISA檢驗及免疫治療中的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明賈煥珍:提出研究思路,研究過程的實施,整理數據,撰寫論文;焦潔:研究過程的實施,數據整理;高歌、楊慧:提出研究思路,研究的可行性分析,負責文章質量控制及論文審定。