呼吸道遲緩愛德華菌不同組分對肺部炎癥作用的對比分析

李 琴 胡 悅 秦嘯峰 馮志紅 王 煒 孫 英*

(1. 首都醫科大學燕京醫學院檢驗學學系,北京 101300;2. 首都醫科大學基礎醫學院免疫學系,北京 100069;3. 首都醫科大學宣武醫院呼吸內科,北京 100053)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種異質性肺部疾病,以持續、進行性氣流受限為特征[1]。COPD已成為全球第三大死因,預計到2040年死亡人數將達到每年440萬[2],其發病機制仍舊不明,但越來越多的證據[3-4]表明COPD的發生發展與肺部微生態相關?！皭盒匝h假說”認為細菌定植到呼吸道,誘導肺部細胞產生炎性細胞因子,破壞肺組織和損傷免疫防御機制,進一步有利于細菌的定植,從而形成一個不斷放大的正反饋循環,促進COPD的發生和發展[5]。有研究[6-7]顯示,80% COPD患者急性加重期與感染因素有關,其中大約50%是細菌來源的。急性加重不僅大大降低患者生活質量、增加醫療衛生負擔和患者死亡風險,而且頻繁的急性發作可引起肺功能快速下降[8-9]。

筆者課題組前期應用16S核糖體核糖核酸(16S ribosomal ribonucleic acid,16S rRNA)基因測序技術檢測發現變形菌門腸桿菌科遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)僅在COPD急性加重期患者誘導痰中檢出。該菌極少感染人類,感染者患有慢性疾病是重要的易感因素,最常見的是腸胃炎,腸外感染罕見,如菌血癥、敗血癥、膿腫、軟組織感染等,但腸外感染患者癥狀表現嚴重,病死率接近50%[10]。目前,遲緩愛德華菌感染僅局限于臨床病例的發現,機制研究少有文獻報道。本文研究以遲緩愛德華菌為研究對象,分別采用遲緩愛德華菌體組分及代謝物構建急性肺損傷小鼠模型和體外細胞刺激實驗,探討呼吸道遲緩愛德華菌誘導的肺部炎癥反應,為進一步深入研究COPD的發展機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

野生型C57BL/6J小鼠,SPF級、雌性、6～8周齡、體質量為18～20 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXY(京)2021-0006。動物實驗通過首都醫科大學動物實驗及實驗動物管理委員會審查批準(AEEI-2021-117)。

1.1.2 細胞系

A549細胞(ATCC CCL-185,人肺泡基底上皮細胞),MLE12細胞(ATCC CRL-2110,小鼠肺上皮細胞系),THP-1細胞(ATCC TIB-202,人單核細胞系),及RAW264.7細胞(ATCC SC-6003,小鼠巨噬細胞系)均為本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理

應用SPF級野生型C57BL/6小鼠構建遲緩愛德華菌滴鼻急性肺損傷模型,設立磷酸緩沖鹽液(phosphate buffer saline,PBS)對照組(Control組)、滅活菌體組(Body組)、細菌裂解物組(Lysate組)和細菌培養上清或代謝物組(Supernatant組)。每只小鼠于第1至3天連續滴鼻3 d,每次滴鼻50 μL細菌作用物,細菌作用物劑量是以相同細菌數下的產生量進行計算。第4天殺鼠取材分析。

1.2.2 細菌培養及其成分制備

遲緩愛德華菌(CICC 10630)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心,用腦心浸液肉湯培養基常規培養,待細菌生長至對數生長期,離心過濾收集細菌培養上清;細菌沉淀經0.2%(質量分數)的甲醛溶液處理后制備滅活菌體;細菌沉淀超聲裂解至菌液透明清澈,離心收集上清,測定細菌裂解物的蛋白濃度。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞分類計數

小鼠經過量麻醉致死后行氣管插管,用無菌PBS進行肺泡灌洗,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)經離心后,細胞懸液制備涂片,瑞氏染色進行細胞分類計數。共計數300個細胞,分別計算巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞細胞的數量。

1.2.4 肺組織中嗜酸性粒細胞和白細胞介素(interleukin,IL)33陽性細胞的檢測

肺組織切片經剛果紅染色后,進行嗜酸性粒細胞的計數;經免疫組織化學染色檢測肺組織中IL-33的表達。

1.2.5 遲緩愛德華菌及其成分作用于細胞實驗

A549細胞、MLE12細胞和RAW264.7細胞為貼壁生長的細胞,用含10%(體積分數)胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 的DMEM培養基;THP-1細胞為懸浮生長的細胞,用含10%(體積分數)FBS的PRMI 1640培養基,用于細胞刺激實驗前需加入100 ng/mL的佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)誘導分化,成為貼壁細胞;以上細胞均在37℃、5%(體積分數)CO2條件下培養。將計數后的細胞懸液接種于24孔細胞培養板內培養24 h后,更換無血清培養基饑餓處理12 h,分別加入遲緩愛德華菌滅活菌體、細菌裂解物和細菌培養上清進行刺激,作用12 h和24 h后收集細胞培養上清,進行細胞因子檢測。

1.2.6 酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測BALF和細胞培養上清中炎性細胞因子的含量

BALF和細胞培養上清按適宜比例稀釋后,應用商品化ELISA試劑盒檢測炎性細胞因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的含量,按照試劑說明書操作,全波長酶標儀(Perkin Elmer,美國)檢測450 nm波長下的吸光度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 遲緩愛德華菌引起氣道內炎癥反應

遲緩愛德華菌菌體、裂解物和培養上清分別作用于呼吸道,檢測BALF中炎性細胞數量和促炎細胞因子的濃度,結果顯示四組間各炎性細胞數量和促炎細胞因子水平差異均有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示,與對照組相比,裂解物和培養上清刺激組中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞數均顯著增加(P<0.05),而滅活菌體組未見明顯改變(P>0.05)(圖1A、B、D);只有裂解物組嗜酸性粒細胞顯著增加(P<0.05)(圖1C);同時,裂解物組和培養上清組促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05),滅活菌體組未見顯著升高(P>0.05)(圖1E、F、G)。

圖1 BALF炎性細胞和細胞因子檢測Fig.1 Differential counting of cells and detecting proinflammatory cytokines in BALF

2.1 遲緩愛德華菌刺激小鼠肺部表達IL-33細胞變化

在BALF細胞因子的檢測中,各組均未檢出IL-33。為進一步探討肺組織中表達IL-33的細胞是否會增加,應用免疫組織化學法檢測肺部IL-33的表達情況。結果顯示,四組間肺組織中IL-33+細胞數量和百分比差異均有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,與對照組相比,滅活菌體可刺激肺組織中IL-33+細胞數量和百分比明顯增加(P<0.05);裂解物組IL-33+細胞數量和百分比均有下降(P>0.05),培養上清組IL-33+細胞數量有增加的趨勢(P>0.05),但百分比略有下降趨勢(P>0.05)(圖2B、C),可能與肺組織大量炎癥細胞浸潤有關。

圖2 遲緩愛德華菌誘導肺組織IL-33+細胞變化Fig.2 Variation of IL-33+ cells in the lung tissue induced by Edwardsiella tarda

2.3 遲緩愛德華菌刺激肺部嗜酸性粒細胞浸潤

肺組織中IL-33的表達增加,是否會引起肺組織中嗜酸性粒細胞的浸潤。結果顯示,四組間肺組織中嗜酸性粒細胞浸潤情況差別有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,與對照組相比,滅活菌體組和培養上清組嗜酸性粒細胞浸潤顯著增加(P<0.05),裂解物刺激組則未見明顯改變(P>0.05)(圖3A、B、C)。

圖3 遲緩愛德華菌誘導肺組織嗜酸性粒細胞浸潤Fig.3 Infiltration of eosinophil in the lung tissue induced by Edwardsiella tarda

2.4 遲緩愛德華菌刺激小鼠氣道細胞炎性細胞因子產生增多

為進一步明確BALF中炎性細胞因子的產生來源,應用遲緩愛德華菌作用于呼吸道上皮細胞和巨噬細胞。結果顯示,作用于小鼠呼吸道上皮細胞(圖4A、B、C),細菌裂解物刺激組細胞培養上清中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達均明顯增加,且顯著高于其他刺激組(P<0.05);滅活菌體不能刺激MLE12細胞產生促炎細胞因子(P>0.05);細菌培養上清僅能上調小鼠上皮細胞IL-6的表達(P<0.05)(圖4B)。作用于小鼠巨噬細胞,細菌裂解物刺激組促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均增加且IL-1β顯著高于其他各組(P<0.05);細菌培養上清刺激組IL-6和TNF-α表達顯著增加(P<0.05);滅活菌體刺激組細胞上清中未檢測到IL-1β和IL-6,但TNF-α的表達異常顯著(P<0.05)(圖4D、E、F)。

圖4 遲緩愛德華菌對小鼠氣道細胞炎性細胞因子表達的影響Fig.4 Effects of Edwardsiella tarda on expression of proinflammatory cytokines by murine airways epithelial cells and macrophages

2.5 遲緩愛德華菌刺激人氣道細胞炎性細胞因子產生增多

為明確遲緩愛德華菌對小鼠模型及細胞的炎癥作用在人源細胞也存在,應用遲緩愛德華菌滅活菌體、裂解物和培養上清作用于人肺泡上皮細胞和人單核-巨噬細胞。結果顯示,在上皮細胞受到作用后,各刺激組細胞培養上清中細胞因子IL-6表達均顯著增加(P<0.05),細菌裂解物刺激組細胞上清中IL-6表達增加明顯高于其他各組(P<0.05)(圖5A);各組均未能檢測到IL-1β的表達。作用于人巨噬細胞,各刺激組細胞培養上清中細胞因子IL-1β和IL-6表達均增加(P<0.05)(圖5B、C)。

圖5 遲緩愛德華菌對人氣道細胞炎性細胞因子表達的影響Fig.5 Effects of Edwardsiella tarda on expression of proinflammatory cytokines by human airways epithelial cells and macrophages

3 討論

COPD是我國第三大死亡原因,是近年國家重點關注的重大慢病之一。該疾病具有高度的異質性,不同臨床類型的患者具有不同的病理生理改變、治療反應及疾病進展,慢性阻塞性肺疾病全球倡議2023年版(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease,GOLD2023)[11]提出了基于危險因素的COPD分型,將感染相關COPD單列一類。COPD急性加重主要與感染因素有關。目前已報道[12],從COPD患者呼吸道標本最常檢出的細菌是變形菌門流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等和厚壁菌門肺炎鏈球菌等。筆者課題組前期研究發現變形菌門遲緩愛德華菌僅在COPD急性加重期患者中檢出。遲緩愛德華菌是一種革蘭陰性兼性厭氧菌,屬腸桿菌科愛德華菌屬,宿主廣泛,多感染水生魚類、爬行動物、兩棲動物等[13],且是其菌屬中唯一能夠感染人類的細菌[14],但有關人類疾病的研究多局限于病例報道,少有深入的機制研究。為此,本研究初步探討了遲緩愛德華菌不同組分對肺部炎癥的作用。

COPD以肺部持續性炎癥反應為主要特征。氣道中中性粒細胞和巨噬細胞數量以及促炎細胞因子水平的增加與COPD的急性加重和嚴重程度直接相關[12, 15]。已有研究[16]報道肺炎鏈球菌經鼻感染香煙煙霧暴露小鼠,可進一步誘導肺損傷和導致肺氣腫發展。研究[17]表明流感病毒和流感嗜血桿菌合并感染誘導COPD小鼠急性加重,促進巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和CD4+T細胞在肺部募集。金黃色葡萄球菌慢性定植的肺氣腫小鼠的肺功能下降、組織損傷及中性粒細胞浸潤程度比其他呼吸道條件致病菌更顯著且其代謝產物同型半胱氨酸加速COPD肺功能下降[18]。本文研究結果可見遲緩愛德華菌不同組分作用有所差異,其中裂解物和代謝物滴鼻組可明顯誘導小鼠氣道中性粒細胞和巨噬細胞增加。值得注意的是遲緩愛德華菌菌體和代謝物可引起肺部嗜酸性粒細胞的增加,而細菌裂解物刺激可誘導BALF中嗜酸性粒細胞的數量增加。有研究[19]表明COPD患者急性加重期氣道嗜酸性粒細胞水平升高尤為明顯,嗜酸性粒細胞計數升高是與哮喘和COPD患者預后較差相關的炎癥標志物[20],與頻繁急性加重和疾病嚴重程度顯著相關[21]。研究[22-23]表明炎癥介質驅動的嗜酸性粒細胞炎癥在COPD中發揮作用,且嗜酸性粒細胞可通過組織蛋白酶L促進肺基質破壞和肺氣腫。因此,遲緩愛德華菌引起肺部及氣道嗜酸性粒細胞增加可能參與COPD進展。IL-33可誘導嗜酸性粒細胞增加[24],筆者課題組已發表數據[25]顯示,IL-33可促進抗自身肺組織抗體的產生。本文研究顯示遲緩愛德華菌僅滅活菌體滴鼻可引起肺部IL-33+細胞的增加,但嗜酸性粒細胞的增加是否與肺部IL-33表達增加相關,以及IL-33產生是否可誘導此條件下的自身抗體產生,繼而參與COPD的發生發展,尚待進一步深入研究。

已知IL-1β、IL-6和TNF-α在COPD患者肺部持續性炎癥反應和疾病的惡化中發揮著重要的作用[26-27]。IL-1β和IL-6可以通過促進抗原呈遞、炎癥細胞活化和參與基質降解酶的表達來激活免疫系統并促進急性炎癥反應[28]。本文研究顯示滴注遲緩愛德華菌不同組分可刺激小鼠氣道促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達增加。體外實驗也證明遲緩愛德華菌菌體、裂解物和代謝物可刺激人和小鼠呼吸道上皮細胞和/或巨噬細胞不同程度表達IL-1β、IL-6和TNF-α。因此,遲緩愛德華菌可誘導氣道細胞產生促炎細胞因子參與肺部炎癥反應。

已有研究[16]報道肺炎鏈球菌經鼻感染香煙煙霧暴露小鼠,可進一步誘導肺損傷和導致肺氣腫發展。本文研究通過體內外實驗證明遲緩愛德華菌能夠造成肺部急性損傷,可能通過中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎性細胞以及多種促炎細胞因子介導,在COPD的發生發展中發揮作用。結果也顯示,不同成分誘導的炎癥反應存在差異。因此,進一步深入研究遲緩愛德華菌何種自身菌體成分或代謝產物主要誘導肺部炎癥損傷及其損傷機制,有助于揭示呼吸道遲緩愛德華菌在COPD加重中的作用,可能為COPD的診斷提供一個新的檢測指標,同時也為COPD急性加重的治療提供新的證據和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李琴:設計實驗,實驗研究,數據分析,撰寫文章;胡悅:實驗研究,分析數據,文章撰寫;秦嘯峰、馮志紅:技術支持;孫英、王煒:設計實驗,審訂論文。