大秦艽湯治療類風濕關節炎:可能的分子機制和生物研究

鄭若男,齊笑笑,李建輝,呂雪姣,姜 穎

(黑龍江中醫藥大學 基礎醫學院, 哈爾濱 150040)

類風濕性關節炎(RA)是一種全身性自身免疫性疾病,主要具有侵襲性,多發性和慢性性質[1-2].全球RA的患病率為0.5%～1%,女性患該病的幾率約是男性的4倍[3].RA的主要病理表現是滑膜慢性炎癥,血管混濁的形成,關節軟骨損傷,韌帶和肌腱的持續炎癥,導致關節畸形和功能喪失[4-5].這些并發癥可能伴有全身癥狀,如體重減輕,體溫過低和疲勞[6].目前RA的發病機制并不明確,多種藥物聯合使用治療,但有些藥物治療效果有限且有很大的不良反應.

大秦艽湯,出自劉完素的《素問病機氣宜保命集·中風論第十》[7],在現代實驗研究及臨床中,涌現出諸多古方新用的情況,其中大秦艽湯作為古代中風-中經絡之代表方劑,因具有清熱補虛、祛風通絡、除濕等諸多功效,可廣泛用于很多疾病[8].

1 材料與方法

1.1 大秦艽湯中藥物活性成分的篩選

大秦艽湯是由黃芩,獨活,羌活,秦艽,甘草,防風,白芍,熟地黃,生地黃,白芷,白術,川芎,當歸,石膏,茯苓,細辛十六位中藥組成.以漢語拼音或拉丁詞大秦艽湯為檢索詞,在中醫藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)中檢索大秦艽湯的化學成分,并根據藥代動力學(ADME)進行篩選:類藥性質(DL)≥0.18,口服生物利用度(OB)≥30%. 因此得到大秦艽湯的有效成分和相應的靶蛋白,最終通過Uniprot數據庫對靶基因名稱進行了標準化.Uniprot數據庫也被用來標準化目標基因名稱.

1.2 活性成分靶點的預測及藥物-疾病靶點

使用“類風濕性關節炎”作為檢索詞,從基因卡(Gene Cards)(https://www.genecards.org/)、基因疾病關聯數據庫(DisGeNET)(https://www.disgenet.org/)、藥物銀行(Drug Bank)(https://www.drugbank.com/)和人類在線孟德爾遺傳(OMIM)(http://omim.org/)中檢索RA相關靶點.將其靶點通過UniProt數據庫轉換為相應標準的蛋白質基因名稱(https://www.uniprot.org/).整理藥物和疾病的靶基因名,排除無法對應靶蛋白和重復項的基因名,從而獲得結果為藥物大秦艽湯和疾病類風濕關節炎活性成分的靶點.

1.3 藥物-疾病共同靶點蛋白

將獲得的大秦艽湯和RA靶標基因名稱上傳到在線網址Venny(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),大秦艽湯和類風濕關節炎的交叉靶點.

1.4 藥物-活性成分-疾病-作用靶點網絡圖

構建大秦艽湯活性成分及治療RA的潛在作用靶點相互作用關系的文檔,并導入到Cytoscape 3.9.1軟件中,得到藥物-活性成分-疾病-作用靶點網絡圖.

1.5 蛋白-蛋白相互作用網絡構建與關鍵靶點篩選

1)所選靶點被添加到STRING 11.0數據庫可在(https://string-db.org )獲得以創建PPI網絡,使用“智人”作為物種,“最高置信度>7.0”作為最小相互作用閾值.2)Cytoscape軟件用于可視化這些網絡.3)利用CytoHubba插件以Degree值為指標進行排序篩選,得到互作性前8強的蛋白,即是大秦艽湯治療RA的關鍵靶點.4)取其最強8個蛋白,用Cytoscape 3.9.1軟件繪畫成蛋白相互作用圖.

1.6 GO 和 KEGG 富集分析

GO功能與KEGG通路富集分析,利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/,Version6.8)進行,GO分析預測了各種生物過程,細胞成分和分子功能.KEGG通路富集分析主要信號通路,P<0.05代表富集結果顯著.通過在線軟件,進行GO功能富集和KEGG通路富集分析,結果以氣泡圖或條形圖來表示.

1.7 分子對接

分子對接用于驗證活性成分與關鍵靶點之間的結合活性.AutoDockVina(Vina,版本1.1.2)是一個采用半柔性對接方法運行的程序,對接精度高達78%,被用來作為本研究的分子對接程序.從RCSB數據庫下載PDBID分別為3o0i、4zzn、2zoq和5ax3的HSP90AA1、MAPK1、MAPK3和STAT3蛋白.將4個蛋白分別與小分子阿魏酸甲酯、豆甾醇和山奈酚進行對接.將小分子指定為配體,將蛋白指定為受體.受體經Pymol處理以去除水分子、小分子配體和氫化,然后使用AutoDock Tools 5.6.6轉換配體形式并鑒定相應的活性口袋(Grid Box).最后,使用AutodockVina軟件進行分子對接.通過Vina對接后,計算小分子與蛋白兩兩組合最低結合能的分數,并使用Pymol和Discovery Studio軟件進行三維和二維角度的作用力分析和可視化.

2 實驗結果

2.1 大秦艽湯篩選活性成分結果通過

通過TCMSP數據庫、化源網、UniProt、SwissTargetPrediction以及文獻檢索,整理數據(除檢索無有效成分靶點的活性成分),并進行篩選,以藥物代謝動力學(ADME)為參數,類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%,生石膏在數據庫以及文獻檢索中均無有效活性成分和靶點的記錄,最終通過數據庫得到其有效成分,秦艽、羌活、獨活、防風、白術、甘草、黃芩、白芍、川芎、熟地黃、生地黃、當歸、白芷、石膏、茯苓、細辛十六位中藥的有效成分分別為:10個、15個、9個、18個、7個、98個、36個、13個、7個、2個、9個、2個、22個、1個、15個、8個,因此統計出有效成分為272個.再通過TCMSP獲得大秦艽湯中活性成分的有效靶點為408個.部分活性成分信息見表1.

表1 大秦艽湯部分活性成分基本信息

2.2 大秦艽湯治療RA潛在靶點預測結果通過

以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞檢索RA的疾病靶點,利用OMIM、GeneCards、DisGeNET以及DrugBank數據庫,去重后共有5 875個有效靶點.收集其藥物和疾病有效靶點進行注釋,通過韋恩圖(圖1)結果得出,將408個藥物有效靶點和5 875個RA疾病靶點進行匹配,獲得301個交集靶點.其交集靶點是大秦艽湯治療RA的潛在靶點.圖中右側方框中展示部分交集靶點的名稱.

圖1 大秦艽湯與類風濕關節炎疾病交集靶點venn圖

2.3 “大秦艽湯活性成分-交集靶點”網絡圖

通過2.2節得到交集靶點,篩選大秦艽湯的活性成分,刪除不含共同靶點的活性成分,獲得作用于類風濕關節炎的相關活性成分30個.歸納出大秦艽湯治療類風濕關節炎的作用靶點、活性成分以及對應的中藥,利用Cytoscape 3.9.1軟件得出“大秦艽湯活性成分-交集靶點”的網絡構建(圖2).左側上方三角紫色形狀代表桃紅四物湯的共同活性成分,其中細辛、白芍、甘草共有MOL000422,白芍、熟地黃、羌活、防風、秦艽、川芎、黃芩、甘草共有MOL000359,白芍、羌活、防風、秦艽、當歸、獨活、白芷、黃芩共有MOL000358,MOL001941羌活、防風、獨活、白芷,MOL001942羌活、防風、白芷、獨活, MOL002644羌活、防風、白芷, MOL001494防風、川芎、白芷, MOL000449熟地黃、當歸、白芷、黃芩、生地黃, MOL004792羌活、獨活, MOL001956羌活、白芷, MOL003588防風、白芷, MOL007514防風、白芷,MOL000173防風、黃芩,MOL000211白芍、甘草 ,左側下方八邊形橙色形狀代表多個組方的化學成分;右側方塊代表大秦艽湯與類風濕關節炎交集有效靶點,連線代表活性成分與靶點間的相互作用,節點越大代表與之相關的藥物成分越多.從藥物活性成分分析,有MOL006212阿魏酸甲酯、MOL000449豆甾醇、MOL000422山奈酚、MOL000173渭黃花素、MOL001987β- 谷甾醇;從藥物靶點角度分析,靶點與藥物成分發生相互作用較多,有PTGS2、PTGS1、ADRB2、NOS2、AR、HSP90AB1、DPP4、SCN5A、ESR1.

圖2 大秦艽湯活性成分-交集靶點

2.4 構建“藥物成分-靶點”網絡

將2.2節得到的交集靶點上傳至STRING數據庫,篩選獲得大秦艽湯治療RA的核心靶點蛋白,見圖3,并將所得潛在目標靶點導入Cytoscape 3. 9. 1軟件制作PPI 網絡圖,顏色由深到淺,顏色越深、節點越大表示節點越重要,見圖4.得到301個關鍵靶點(節點代表靶點),1 246條邊(邊代表靶點間相互作用),平均節點值8.28.節點的大小與Degree數值呈正相關,數值越大, 節點越大.度值排名前20位的有STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、PIK3R1、FOS、TNF、EGFR、ESR1、IL6、MAPK8、MYC、MAPK14、RXRA、STAT1、CAV1、VEGFA,表明這些靶點在大秦艽湯治療RA中有重要作用,見圖5,前8核心靶點蛋白互作圖(Degree≥80).見圖6.

圖3 大秦艽湯治療RA的核心靶點蛋白

圖4 PPI共同核心靶點網絡圖

圖5 前20 degree核心靶點柱狀圖

圖6 前8核心靶點蛋白互作圖

2.5 GO功能富集與通路富集分析

通過Daviod數據平臺以P值作為篩選條件,進行富集分析對大秦艽湯治療類風濕關節炎的301個共有靶點,GO富集分析分別選取分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cell composition,CC)的前10條通路進行展示(見圖7).根據富集分析結果,GO條目共為1 462個,BP條目1 098個:主要涉及對藥物的反應、基因表達的正向調節、對外源性刺激的反應、對脂多糖的反應、對缺氧的反應、炎癥反應、變老、細胞增殖的正向調節等;CC條目119個,主要涉及細胞外區,突觸前膜的組成部分,細胞外間隙,胞質溶膠,膜筏,大分子復合物,內質網膜,線粒體等;MF條目245個:主要涉及酶結合,相同蛋白結合,蛋白結合,蛋白激酶結合,類固醇結合,血紅素結合,轉錄因子結合等.

圖7 以P值作為篩選條件共同靶點GO功能富集分析

2.6 KEGG富集通路分析

以lgP值為標準,從小到大排序,選取富集最顯著的前20條通路.由圖5可知,大秦艽湯與類風濕關節炎的301個共有靶點主要富集在脂質、動脈粥樣硬化、膽固醇代謝、癌癥、和AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路等等(見圖8).

注:右側 水平坐標表示以對數為 10 的 P值,垂直坐標表示路徑名稱;顏色代表豐富意義,顏色越深,豐富度越高

2.7 分子對接結果通過

通過分子對接術對篩選出的度值較高的成分及靶點進行活性成分對接,根據網絡藥理學分析結果,篩選出阿魏酸甲酯、豆甾醇、山奈酚等小分子配體(Degree>40),STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1等大分子受體.最低結合能越低結合能力越強,最低結合能是評價成分與靶點結合能力的一項重要指標.分子對接的結果顯示,最低結合能最差的是-6.1 kJ/mol,平均最低結合能是-7.4 kJ/mol,最穩定的是山奈酚與HSP90AA1最低結合能是-9.4 kJ/mol,配體小分子山奈酚可通過2條分別為4.48?和4.79?的疏水作用力均結合至受體蛋白HSP90AA1的107號LEU氨基酸殘基中,通過2條分別為3.97?和4.09?的疏水作用力均結合至受體蛋白HSP90AA1的138號PHE氨基酸殘基中,通過2條分別為7.87?的疏水作用力和2.89?的碳氫鍵分別結合至受體蛋白HSP90AA1的162號TRP氨基酸殘基和52號SER氨基酸殘基中.通常,如果配體與靶蛋白的結合能小于0,則配體和受體蛋白可以自發結合,如果結合能<-20.934 J/mol,表明活性成分與靶點具有較強的親和活性,因此,小分子阿魏酸甲酯、豆甾醇和山奈酚與目標蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3和STAT3之間均結合穩定.以上數據可以看出大秦艽湯活性成分與蛋白質之間有較強烈的結合關系,也說明大秦艽湯對類風濕關節炎具有直接的治療效果.靶點與配體結合圖(見表2),部分藥物活性成分與核心靶點示意圖(見圖9).

注:在三維圖中,綠色虛線表示氫鍵,淡綠色虛線表示碳氫鍵,粉色和棕色虛線表示疏水作用力.

表2 大秦艽湯核心成分與核心治療靶點的結合情況

3 討 論

網絡藥理學是探索疾病和藥物復雜機制的智能策略[9].分子對接是一種基于結構計算機建模的方法[10].近年來被廣泛用于中藥有效成分和作用機制的預測,為中藥新藥的開發提供了有力的輔助[11-13].因此,本文通過網絡藥理結合分子對接探索大秦艽湯治療RA的機制.

通過網絡藥理學研究得出,大秦艽湯共有272個有效化學組分,對應靶點共408個,大秦艽湯與類風濕關節炎的交集靶點共301個.關鍵的化學組分包括:阿魏酸甲酯、豆甾醇、山奈酚、渭黃花素、β- 谷甾醇等.大秦艽湯治療類風濕關節炎的核心靶點為STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、PIK3R1、FOS、TNF等.

阿魏酸甲酯即4-羥基-3-甲氧基肉桂酸甲酯,是阿魏酸的衍生物,具有抗氧化、抗菌、抗炎活性[14-15].豆甾醇和β- 谷甾醇都為植物甾醇,植物甾醇是一類在植物中廣泛存在的、具有環戊烷多氫菲骨架的甾體類化合物,是植物細胞膜的重要組成部分[16].有研究表明,β- 谷甾醇可以降低急性肺損傷大鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS水平,提高抑炎因子IL-4和IL-10水平,降低炎癥反應[17].研究發現,豆甾醇作為犀牛的活性成分,可抑制RA的破骨細胞分化、炎癥反應和組織病理損傷,并下調NFKB1、NCF4和NCF1的表達.豆甾醇的活性成分,肉豆甾醇有利于改善類風濕性關節炎的關節損傷[18].山奈酚(kaempferol, KAE)是一種生物類黃酮,具有抗炎、抗癌、抗微生物、抗糖尿病等多種功能[19].山奈酚可抑制RA-FLS遷移,調節AKT1、P-AKT1、JUN、P-JUN、CASP3、TNFR1和TNFR2蛋白的表達.用山奈酚干預后,IL-6和TNF-α的濃度降低[20].

通過GO生物功能的分析,大秦艽湯主要通過對炎癥反應、脂多糖的反應、對缺氧的反應、細胞增殖的正向調節等多個生物過程,達到治療類風濕關節炎的作用.通過KEGG通路富集分析得出:大秦艽湯主要通過調控脂質、膽固醇代謝、癌癥和動脈粥樣硬化和AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路等來治療類風濕關節炎.結合GO生物功能和KEGG通路富集分析,大秦艽湯治療類風濕關節炎主要有:1)抗炎,在RA細胞因子相互作用中,介導炎癥反應的重要成分有IL-6、TNF-α、IL-1、IL-2等炎性細胞因子,可誘導其他炎癥細胞因子的釋放,從而介導滑膜炎癥及軟骨破壞,因此抑制滑膜組織的炎癥反應是治療RA的關鍵[21].2)抑制脂多糖,脂多糖(LPS)是一種炎癥調節因子[22].LPS作為革蘭氏陰性細菌的外膜多糖,可以通過與細胞表面TLR4受體結合來激活下游NF-κB和MAPK信號通路,從而刺激細胞產生炎性細胞因子,趨化因子和介質[23-24].3)高壓氧治療.①HIF-1α的表達與VEGF的表達呈正相關,增加HIF-1α加速滑膜血管生成并導致關節炎癥[25-26].②在缺氧條件下,RA中的成纖維細胞樣滑膜細胞(RA-FLSs)轉化為上皮間充質,HIF-1α通過STAT3 / HIF-1α/ fascin-1軸促進細胞的遷移和侵襲[27-28].③NF-κB與HIF-1α相互作用,促進基質金屬蛋白酶2(MMP2)和MMP9的酶活性,進而破壞組織學屏障,破壞骨物質[29].④在RASF中,HIF-1α過表達誘導Th1和Th17細胞擴增并增加INF-γ和IL-17的表達[30-31].⑤HIF-1α抑制劑吡啶甲酰胺化合物AMSP-30m促進滑膜細胞凋亡[32].

從分子對接結果分析,大秦艽湯有3個活性成分阿魏酸甲酯、豆甾醇和山奈酚和4個蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3和STAT3,最穩定的是山奈酚與HSP90AA1,熱休克蛋白90α家族A類成員1(HSP90AA1)HSP90AA1可參與調節自噬,促進Pg-LPS誘導HGF產生炎癥損傷[33].MAPK1和MAPK3是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員,MAPK主要涉及炎癥和癌癥類疾病.目前,關于RA和MAPK較為充分的研究,MAPK不僅在關節組織中能對促炎細胞因子的產生進行調節,而且在IL-17、IL-1和TNF-α受體下游的信號級聯中起著重要作用[34].STAT3是STATs家族的成員之一.在細胞因子和生長因子等配體的刺激下,上游激酶激活STAT3(Tyr705或Ser727位點的磷酸化),磷酸化STAT3形成二聚體后進入到細胞核中,介導相應基因如抗凋亡基因Bcl-xL、Mcl-1及細胞周期調節基因c-myc、cyclinD1和促血管生成基因等表達的調控[35-36].作為神經炎性反應的正向調節因子-STAT3介導的信號傳導通路能夠激活小膠質細胞,調節多種特異炎性基因如IL-1β、IL-6和TNF-α等的轉錄和表達[37].通過與酪氨酸激酶(tyrosine kinas,JAK)組成 JAK/STAT 信號通路,參與細胞內的信號傳導,調控腫瘤的炎癥、增殖和侵襲[38].

4 結 語

本文利用網絡藥理學和動物實驗進一步探討了其在RA治療中的作用機制.通過網絡藥理學和分子對接分析與預測的結果得出大秦艽湯藥物的活性成分和核心靶點蛋白,明確知道大秦艽湯治療類風濕關節炎主要通過抗炎、抑制脂多糖、高壓氧治療和抗細胞凋亡等多種治療手段.從最低結合能得出最有的治療途徑,研究結果為大秦艽湯藥物對治療RA提供了重要的實驗和臨床理論基礎.