基于SPME-GC/MS 技術鑒別三種南五味子屬藥材

陳明權 ，商雪瑩，覃仁安，何風雷，農根林，楊永成

（廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東 廣州 510288）

黑老虎、地血香、紅木香均為木蘭科南五味子屬常用的三種中藥材，分別為南五味子屬植物厚葉五味子Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith.，異型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb.) Craib 和長梗南五味子Kadsura longipedunculataFinet et Gagnep的干燥根[1-3]。因其屬于同科同屬藥材，不僅外觀性狀有較高的相似性，且具有祛風、行氣、止痛等功效，化學成分也以木脂素、三萜類化合物為主[1-3]，但三者不可代替使用。其中，黑老虎為中華跌打丸、壯腰健腎丸等中成藥的原料藥材，紅木香為當歸赤芍湯、經驗秦艽湯等中醫經典方劑的重要藥味，而在市場流通領域，有黑老虎、地血香、紅木香三者混用的情況出現。

目前，關于南五味子屬藥材的研究，主要集中在生物學特性、化學成分及藥理藥效等方面[4-7]。雖然南五味子屬藥材揮發油成分研究也有相關文獻[8-13]報道，但其采用的提取方法均為傳統的水蒸氣蒸餾法，且未見南五味子屬類藥材鑒別研究的報道。因此，本試驗將采用固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用技術（SPME-GC/MS）對上述三種藥材的揮發性成分進行研究，通過相關性分析與聚類分析，達到區分黑老虎、地血香、紅木香三種藥材的目的，為南五味子屬藥材的鑒定與質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

TQ 8040N 型氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司）；75 μm PDMS/DVB 型固相微萃取儀-纖維頭（灰色），25 mL SPME 專用采樣瓶（美國SUPELCO公司）；BS110S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試驗樣品

本研究將樣品分別編號為S1 ～ S15，均為采集于野生環境的藥用植物的根。其中，樣品S1 ～ S9 經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為木蘭科南五味子屬植物厚葉五味子Kadsura coccinea(Lem.)A.C.Smith.的干燥根，即藥材“黑老虎”，樣品S10 ～ S13 經鑒定為木蘭科南五味子屬植物異型南五味子Kadsura heteroclita(Roxb.) Craib 的干燥根，即“地血香”；樣品S14 ～ S15 經鑒定為木蘭科南五味子屬植物長梗南五味子Kadsura longipedunculataFinet et Gagnep 的干燥根，即“紅木香”，樣品信息詳見表1。

表1 15 批樣品信息Tab.1 15 batches of sample information

1.3 數據處理

樣品揮發性成分通過質譜數據NIST14 數據庫進行鑒定，按峰面積歸一化法計算出各揮發性成分的相對百分含量，并采用SPSS 19.0 統計學軟件對各樣品進行相關性與聚類分析。

2 方法與結果

2.1 供試品制備

稱取0.50 g 樣品粉末（過10 目），置于25 mLSPME 專用萃取瓶中，在80 ℃砂浴鍋中平衡10 min，將SPME 萃取纖維直接插入萃取瓶中，萃取30 min；然后將SPME 插入GC 進樣口，230℃ 解吸3 min 進樣。

2.2 GC 色譜條件

采用安捷倫 HP-5 MS（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱，載氣為高純氮，流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為230℃，分流比為50 : 1；采用程序升溫模式，柱初始溫度為50℃，保持2 min；以5℃/min 的速率升至100℃，保持2 min；以2℃/min 的速率升至130℃，保持10 min；以2℃/min 的速率升至180℃，保持2 min。

2.3 MS 質譜條件

離子源溫度為230℃；電子能量為70 eV；掃描質量范圍(m/z)為20 ～600 。

黑老虎藥材及其同屬品種的樣品GC/MS 總離子流圖，見圖1。

圖1 三種藥材GC/MS 總離子流圖Fig.1 GC/MS total ion current diagram of three medicinal materials

2.4 方法學考察

2.4.1 重復性試驗 精密稱取同1 供試樣品（S2）6 份，按“2.1”項下方法制備供試品，按“2.2”“2.3”項下條件進行分析，測得各揮發性成分峰面積積分值，計算參考峰（S）的相對百分含量及其相對標準偏差，結果顯示，該參考峰的RSD 為2.38%，表明方法重復性良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密稱取同1 供試樣品（S2），分別在0、2、5、9、17、24 h，按“2.1”項下方法制備供試品，并按“2.2”“2.3”項下條件進行分析，測得各揮發性成分峰面積積分值；計算參考峰（S）的相對百分含量及其相對標準偏差。結果，該參考峰的RSD 為2.76%，表明供試品在24 h 內穩定。

2.5 樣品測定結果

15 個試驗樣品，按“2.1”項下方法制備供試品，按“2.2”“2.3”項下條件進行分析，測得的質譜數據與NIST14 數據庫進行匹配，各成分的匹配度＞80；根據各揮發性成分峰面積積分值，計算各成分的相對百分含量，三種南五味子屬藥材共檢出74 個揮發性成分，其中，黑老虎樣品中相對含量較高的成分為β-石竹烯（17.85% ～ 44.24%）、a-蒎烯（6.54% ～10.08%）、δ-杜松烯（2.22% ～ 9.87%）、α-律草烯（2.54% ～ 5.68%），地血香的則為δ-杜松烯（6.61% ～17.06%）、左旋龍腦（2.08% ～ 8.40%）、T-杜松醇（4.29% ～ 24.61%）、a- 蒎烯（4.49% ～ 9.05%），紅木香的則為1，2，3，5，6，8a-六氫-4，7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘（9.97% ～ 17.78%）、4-萜品醇（8.83% ～ 8.90%）、1-乙酸冰片酯（3.79% ～ 8.63%）、δ-欖香烯（6.20% ～ 9.21%），以上結果表明三種南五味子屬藥材之間的揮發性成分存在明顯差異。此外，三種南五味子屬藥材揮發性成分中存在共有成分31 個（見表2），表明三者之間也存在一定相似性。

表2 31 種共有成分相對百分含量測定結果（n = 2）Tab.2 Determination results of relative percentage content of 31 common components (n = 2)

2.6 相關性分析

采用SPSS 19.0 對15 個樣品中31 種共有成分的相對百分含量為數據進行Pearson 相關性分析，結果顯示，黑老虎、地血香、紅木香三種南五味子屬藥材種內的Pearson 相關系數范圍分別為0.741 ～0.997、0.520 ～ 0.862、0.815；對于其品種之間的相關性而言，黑老虎與地血香樣品之間的Pearson 相關系數均≤0.381，黑老虎與紅木香樣品之間相關系數均≤0.097，地血香與紅木香樣品之間相關系數均≤0.267，即種內Pearson 相關系數均遠大于種間。表明南五味子屬藥材種內的差異性較小，而種間的差異性較大。

2.7 聚類分析

運用 SPSS 19.0 軟件對表2 中15 個樣品31 個共有成分的相對百分含量為數據進行聚類分析，采用組間聯接分析法，以Pearson 相關性系數作為樣品相似度的距離公式，結果見圖2。當判斷距離為15 時，結果顯示15 個樣品被分為三類：第Ⅰ類黑老虎為（S1 ～S9），第Ⅱ類為地血香（S10 ～ S13），第Ⅲ類紅木香為（S14 ～ S15）；即黑老虎歸為一類；地血香歸為一類；紅木香歸為另外一類。

3 討論

3.1 GC 升溫程序的優選

本研究比較了以下四種升溫程序：① 柱初始溫度為50 ℃，保持2 min；以9 ℃/min 的速率升至140 ℃，保持3 min；以2 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持3 min。② 柱初始溫度為50 ℃，保持2 min；以2 ℃/min的速率升至110 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持2 min。③ 柱初始溫度為60 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 的速率升至100 ℃，保持2 min；以2 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持2 min。④ 柱初始溫度為50 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 的速率升至100 ℃，保持2 min；以2 ℃/min 的速率升至130 ℃，保持10 min；以2 ℃/min 的速率升至180 ℃，保持2 min。結果顯示，第④種升溫程序所測得的色譜峰數量最多，分離效果好且時間短，因此，本研究選擇第④種升溫程序作為最佳的GC 升溫程序。

3.2 SPME 萃取條件的優選

本研究采用單因素試驗方法，考察不同萃取溫度（60、80、100、120 ℃）、不同萃取時間（15、30、45 min）及不同取樣量（0.25、0.50、1.0 g）對黑老虎揮發性成分的影響，從而篩選出最佳的萃取條件。結果顯示，在萃取溫度方面，四個萃取溫度所測得的色譜峰個數基本一致，但主要色譜峰的分離度大小依次為80 ℃、100 ℃、60 ℃、120 ℃，表明最佳的萃取溫度為80 ℃；在萃取時間方面，主要色譜峰的響應值大小依次為30、45、15 min，表明最佳的萃取時間為30 min；在取樣量方面，不同取樣量對應的色譜峰響應值大小依次為0.50 g、1.0 g、0.25 g，從節約樣品量的角度出發，本研究選擇0.50 g 作為最佳的取樣量。

與常用的揮發性成分提取技術相比，固相微萃取技術具有小型化、操作簡單、高通量、用時短及溶劑消耗低的特點，既克服了水蒸氣蒸餾法提取溫度過高而破壞揮發性成分的缺陷，又避免了超臨界萃取技術成本高而無法普及的問題[14-15]。因此，本研究對固相微萃取條件參數進行優化，充分提取樣品中的揮發性成分，以適用于南五味子屬藥材。

3.3 藥材特征性成分的確定

梁海玲等[16]采用SPME-GC/MS 方法對番石榴果實的揮發性成分進行了研究，結果顯示其主要成分為β-石竹烯（7.34%）、a-蒎烯（2.61%），與具有“嚼碎有生番石榴味”特征的黑老虎中主要揮發性成分（β-石竹烯17.85% ～ 44.24%、a-蒎烯6.54% ～10.08%）結構相似，提示β-石竹烯、a-蒎烯可作為黑老虎的特征性成分，同時考慮到a-蒎烯在地血香中的相對百分含量也高達4.49% ～ 9.05%。因此，可確定將成分β-石竹烯作為區分黑老虎與地血香、紅木香的依據。地血香藥材中存在具有“嚼碎有清涼感”氣味特征對應的揮發性成分左旋龍腦（2.08% ～8.40%），因此，也可以將其作為區分地血香與黑老虎、紅木香的特征性成分。

4 結論

本研究建立的SPME-GC/MS 方法較全面地反映了木蘭科南五味子屬藥材的揮發性成分，分析方法簡便、準確、可靠。通過聚類分析以及特征性成分β-石竹烯和左旋龍腦可以有效區分黑老虎、地血香與紅木香三種藥材，為南五味子屬藥材的真偽鑒別提供了一種新的方法。