NO2 脅迫對三角梅幼苗生理特性的影響

宋 爽，蔡宇軒，梁宇翔，圣倩倩，祝遵凌

（南京林業大學 a. 風景園林學院；b. 南方現代林業協同創新中心；c. 金埔研究院；d. 數字化創新設計研究中心；e. 藝術設計學院，江蘇 南京 210037）

氮氧化物（NOx）是近地面O3與二次顆粒物（PM10和PM2.5等）生成的最重要的共同前體物，在大氣化學過程中可同時生成二次氣溶膠與O3[1]，其中NO2是大氣中的主要氮氧化物[2]，主要來源于機動車尾氣、工業廢氣以及能源工廠的排放。隨著我國城市現代化發展水平的不斷提升，機動車尾氣排放成為城市大氣重要污染源之一[3]。我國環境空氣質量標準規定，NO2年均濃度限值為40 μg/m3，24 h 平均濃度限值為80 μg/m3?！?021年中國生態環境狀況公報》指出，2021 年339 個城市NO2年均濃度為23 μg/m3（達到國家一級標準），與2020 年相比下降4.2%。但仍存在以NO2為首要污染物超標現象，其中長三角地區大氣污染物平均超標（空氣質量指數＞100）天數比例為13.3%，NO2超標天數占總超標天數的1.7%，對城市生態環境和人體健康造成影響。

園林植物是城市生態環境的重要組成部分，植物葉片是吸收大氣污染物、進行光合作用的主要器官，研究表明，高濃度短時間（0 ～7 d）的污染氣體處理一般導致急性傷害，在植物對脅迫的應答初期便顯現出色斑、褪綠、失水、葉脈畸形、干枯老化等癥狀[4]。如果污染物濃度高于植物的忍受閾值，就會對植物產生傷害。彈性的傷害是可逆的，但污染物長時間的壓力可能會導致不可逆的損害[5]。低濃度長期（超過30 d）的污染氣體處理通常導致慢性傷害，隨著脅迫時間或程度的增加，植物表現出衰老加速、發育不良、矮化和產量降低等。上述處理均會出現不同程度的光合速率下降、活性氧產生、代謝酶活性改變、滲透物質積累等生理響應[6]。已有學者[7-9]較為系統地研究了NO2脅迫對園林植物形態特征、質膜過氧化及抗氧化系統、細胞膜結構、光合作用過程、葉綠素合成、氣孔動態、氮素積累及氮代謝酶活性的影響。目前研究表明，低濃度大氣NO2（0.10 ～1.00 μL·L-1）能夠調節植物的營養生長和生殖生長，不但可以通過控制細胞的增殖來促進植物的生長，還可以通過細胞的增大提高植物生物量[2,10]。

三角梅Bougainvilleaglabra為紫茉莉科Nyctaginaceae 葉子花屬Bougainvillea藤狀灌木，在海南、貴州、福建、云南、廣東、廣西、重慶等省市區，三角梅累計種植面積超過9.3×104hm2，從業人員超過7.3 萬，年產值已達84 億元，是中國華南地區生產栽培和景觀應用規模最大的園藝植物之一[11]，被廣泛應用于城市道路綠化、園林綠化及庭院綠化。但關于三角梅對大氣污染物的響應機理系統性研究尚未見報道，在實驗室控制條件下探究三角梅對不同濃度NO2的響應差異的研究更少之又少。因此本研究通過開展人工熏氣試驗，研究不同濃度梯度NO2對三角梅生理生化過程的影響效益。在城市大氣污染環境下，以期為發揮園林植物的生態效益提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗場地為南京林業大學國家園林實驗中心。本實驗選用長勢基本相同，健壯、無病蟲害的三角梅2 ～3 年生嫁接苗，移入實驗中心進行基質栽培。栽培基質的配比為紅壤土∶營養土=1∶1，其中營養土包括55%草炭土、30%珍珠巖、10%稻殼及5%黃土，用規格為上徑口（17 cm）×下徑口（15 cm）×高（17 cm）塑料花盆盆栽，盆底有排水孔并置于托盤中，每盆裝500 g 干土，每盆1 株。常規管理培養2 個月后，將植物的花盆及盆土用保鮮膜密封包纏處理置于空白熏氣裝置中，進行適應性培養2 周，準備進行NO2脅迫試驗。

1.2 試驗設計

1.2.1 裝置

采用本課題團隊自主研發的遠程實時監測NO2濃度的熏氣裝置，如圖1 所示，包括熏氣箱、氣體發生模塊、氣體濃度檢測模塊及云平臺數據處理中心。熏氣箱體由無機玻璃制作，規格為長1.2 m×寬0.8 m×高1.2 m，氣瓶的進氣端連接帶有減壓閥的微量氣體電磁閥及其控制器，以控制氣體的進入與停止，可通過手機小程序實時查看NO2的濃度變化來監測NO2動態變化，提高人工控制NO2氣體濃度的精確度。

圖1 NO2 熏氣裝置及工作流程Fig. 1 NO2 fumigation device and work flow

1.2.2 植物處理

試驗共設置4 個處理：CK（空白對照組，0 μL·L-1）、T1（1 μL·L-1）、T2（4 μL·L-1）、T3（8 μL·L-1），每處理組6 盆，共24 盆。于2022年4月30日—5月2日進行熏氣試驗，持續熏氣3 d，每日熏氣8 h（9:00—17:00）。熏氣室環境為光照時間13 h，光照強度26 000 ～29 000 lx，環境溫度25 ～28 ℃，空氣相對濕度60%～70%，大氣壓力99.3 ～99.5 kPa。于每日熏氣結束后進行相關指標測定。

1.3 指標測定

在NO2脅迫第1 ～3 天，分別在每個處理中隨機選取3 盆，于當天熏氣結束后采集中上部（從頂端數第5 至第7 片）陽生葉片，裝入貼有標簽的密封袋中，用于后續生理指標測定。

1.3.1 葉色測定

參照蘇金[12]的方法，每日上午8:30 將植株擺放在同一位置，用分光測色儀在同一葉片分別采集3 次，計算平均值。取色統一在背陰但光線良好的環境下進行。

1.3.2 水分生理指標測定

參照李合生[13]的方法，測定相對含水量（RWC）和水分飽和虧缺（WSD）。

1.3.3 逆境生理指標測定

每個處理隨機選取9 片成熟葉片，采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定MDA 含量；脯氨酸（Pro）含量參照李合生[13]的磺基水楊酸提取法測定；可溶性蛋白（SP）含量采用考馬斯亮藍G-250 比色法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定；還原型抗壞血酸（AsA）含量采用二聯吡啶法測定。以上指標均以葉片鮮質量計算。

1.3.4 光合生理指標測定

參照李合生[13]的95%乙醇浸提法測定葉綠素a、葉綠素b 及類胡蘿卜素的含量。

1.4 數據分析

利用SPSS 25.0 和Origin 2021 軟件，比較三角梅對不同處理時間及處理濃度的響應時采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA），比較各生理生長指標在不同NO2處理下的差異時采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用Tukey 法；各指標相關性采用Pearson 相關性分析；采用主成分分析（PCA）探究NO2脅迫下三角梅的生理響應特征。數據以均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 三角梅幼苗對不同處理時間及處理濃度的響應

雙因素方差分析可知（表1），處理時間及其和處理濃度的交互作用對三角梅幼苗的影響顯著（P＜0.05），其中處理時間達到極顯著水平（P＜0.01），但處理濃度對三角梅幼苗的影響不顯著，可見三角梅能耐受短期高濃度NO2脅迫。

表1 處理時間及NO2 處理濃度的雙因素方差分析Table 1 Two-factor variance analysis of treatment time and NO2 treatment concentration

2.2 NO2 脅迫對三角梅葉色的影響

脅迫第1 天，T2 的A 值與同期CK 相比有所增加。脅迫第2 天，各處理組的A 值與同期CK相比有所增加。脅迫第3 天，除T2 外，各處理下的A 值與同期CK 相比有所下降。其中，L 代表亮度，a 代表從洋紅色至綠色的范圍，b 表示從黃色至藍色的范圍[14]。方差分析結果表明（表2），各處理間的葉片L 值和B 值無顯著差異，NO2脅迫對三角梅葉片Lab 值無顯著影響。

表2 不同NO2 處理下三角梅葉片Lab 的變化?Table 2 Changes of Lab in B. glabra leaves under different NO2 treatments

2.3 NO2 脅迫對三角梅葉片含水量的影響

如表3 所示，T1 和T2 的相對含水量（RWC）變化趨勢一致，與CK 相比均呈先增加后降低，其中在脅迫第2 天，T1 和T2 的RWC 與CK 相比分別增加了7.04%和9.15%。隨著脅迫時間延長，與CK相比，T3 處理下的RWC 逐漸升高，而水分飽和虧缺（WSD）均呈現相反的變化趨勢。方差分析結果表明，NO2脅迫對三角梅葉片含水量影響不顯著。

表3 不同NO2 處理下三角梅葉片含水量的變化Table 3 Changes of water content in B. glabra leaves under different NO2 treatments

2.4 NO2 脅迫對三角梅丙二醛含量的影響

如圖2 所示，脅迫第1 天，T1、T2 和T3 處理下的MDA 含量均低于同期CK，分別下降了15.93%、6.70%、14.95%。脅迫第2 天，T1、T2和T3 處理下的MDA 含量均高于同期CK，分別上升了72.30%、99.84%、75.29%。脅迫第3 天，各處理組的MDA 含量相比同期CK 有所增加。各處理組在脅迫期間MDA 含量與CK 相比整體呈現下降的趨勢。方差分析結果表明，T1、T2 和T3組間差異不顯著。

圖2 不同NO2 處理下三角梅MDA 含量的變化Fig. 2 Changes of MDA content in B. glabra under different NO2 treatments

2.5 NO2 脅迫對三角梅脯氨酸含量的影響

如表4 所示，隨著脅迫時間延長，T1 處理下的Pro 含量與CK 相比呈先降低后增加的趨勢，T2 及T3 的Pro 含量變化趨勢相同，均為先增加后降低，其中T2 相較CK 分別增加了20.15%、45.33%、30.95%，T3 相較CK 分 別增加了88.37%、77.25%、30.10%。方差分析結果表明，各處理組對三角梅Pro 含量的影響不顯著。

表4 不同NO2 處理下三角梅脯氨酸含量的變化Table 4 Changes of proline content in B. glabra under different NO2 treatments

2.6 NO2 脅迫對三角梅可溶性蛋白含量的影響

如圖3 所示，隨著脅迫程度的增加，SP 含量總體呈現下降趨勢，而在脅迫第1 天及第3 天，T1 處理下SP 含量相較同期的CK 分別增加了5.33%和6.06%。T2 及T3 處理下的SP 含量較同期的CK 均有所下降，其中T2 處理在脅迫第1 和第2 天時相較CK 分別降低了10.29%、22.91%，脅迫第3 天與CK 基本持平，T3 相較CK 分別下降了14.89%、19.49%、3.25%。方差分析結果表明，各處理組對三角梅SP 含量的影響不顯著。

圖3 不同NO2 處理下三角梅可溶性蛋白含量的變化Fig. 3 Changes of soluble protein content in B. glabra under different NO2 treatments

2.7 NO2 脅迫對三角梅超氧化物歧化酶活性的影響

如圖4 所示，各處理組與CK 相比大致呈現下降趨勢，但T1 處理下的SOD 活性在脅迫第1天相比CK 增加了5.37%。脅迫第2 天，各處理組的SOD 活性相較同期的CK 分別下降了14.40%、13.37%、9.10%。脅迫第3 天，T2 處理下的SOD活性相比同期CK 下降了10.09%，T1 和T3 處理下的SOD 活性與CK 基本持平。方差分析結果表明，各處理組對三角梅SOD 活性的影響不顯著。

圖4 不同NO2 處理下三角梅SOD 活性的變化Fig. 4 Changes of SOD activity in B. glabra under different NO2 treatments

2.8 NO2 脅迫對三角梅還原型抗壞血酸含量的影響

如圖5 所示，隨著脅迫時間的延長，T1 及T2的AsA 含量均呈現先增加后降低的趨勢，T3 處理的AsA 含量逐漸增加。脅迫第1 天，各處理組的AsA 含量與CK 相比無明顯變化。脅迫第2 天，各處理組與同期CK 相比分別下降了36.81%、28.12%、45.90%，其中T3 與CK、 T1、T2 處理間差異顯著（P＜0.05）。脅迫第3 天，T1 與T2 的AsA 含量相較CK 分別下降了12.37%、40.44%，T3 處理的AsA 含量相較CK 無明顯變化。方差分析結果表明，脅迫期間各處理間差異不顯著。

圖5 不同NO2 處理下三角梅抗壞血酸含量的變化Fig. 5 Changes of ascorbic acid content in B. glabra under different NO2 treatments

2.9 NO2 脅迫對三角梅光合色素含量的影響

如圖6 所示，在NO2脅迫期間，葉綠素a、葉綠素b 與類胡蘿卜素含量的變化趨勢基本相同。脅迫第1 天，各處理組的葉綠素a、葉綠素b 與類胡蘿卜素含量與CK 相比有所升高，但差異不顯著。脅迫第2 天，各處理組的葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素含量與CK 相比均有所下降，其中T1 處理下的葉綠素a 及類胡蘿卜素含量相比CK差異顯著（P＜0.05），T3 處理下的葉綠素a 含量相比CK 差異顯著（P＜0.05）。脅迫第3 天，T1 和T3 處理減少了三角梅的葉綠素a、b 含量，T2 處理下的葉綠素a、b 與CK 相比分別增加了13.79%、13.67%，并且T1 和T2 對三角梅幼苗類胡蘿卜素的形成有一定的積極作用，與CK 相比分別增加了17.65%、29.48%。方差分析結果表明，脅迫期間各處理間差異不顯著。

圖6 不同NO2 處理下三角梅光合色素含量的變化Fig. 6 Changes of photosynthetic pigment content in B. glabra under different NO2 treatments

2.10 NO2 脅迫下三角梅各項生理指標間的相關性

對三角梅各項生理指標進行相關性分析可知（表5），各指標之間存在一定的相關性。RWC與WSD呈極顯著負相關，前者與SP呈顯著負相關，后者與SP 呈顯著正相關。AsA 與MDA 呈極顯著負相關，與葉綠素a 呈顯著正相關。光合色素之間呈極顯著正相關。其余指標相關性不顯著。

表5 各生理指標相關性分析?Table 5 Correlation analysis of each physiological index

2.11 主成分分析

由主成分分析圖可知（圖7），第一主成分的貢獻率是32.8%，第二主成分的貢獻率是22.7%，累計貢獻率為55.5%。第一主成分與葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、SP、SOD、AsA 及RWC 正相關，且葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的變量系數較大，為正向主導變量，主要反映NO2脅迫下三角梅的光合能力。第二主成分與WSD、SP、Pro、SOD、MDA、葉綠素a、葉綠素b 及類胡蘿卜素正相關，且WSD 及SP 的變量系數較大，為正向主導變量，主要反映NO2脅迫下三角梅的水分利用能力及滲透調節能力。

圖7 不同NO2 處理下三角梅各指標的主成分分析圖Fig. 7 Principal component analysis of B. glabra under different NO2 treatments

3 討 論

3.1 NO2 對三角梅幼苗葉片顏色及光合色素的影響

植物長期暴露在大氣污染的環境中，大氣污染物首先對植物內在的生理組織結構（如細胞器、細胞膜、葉綠體等）產生不可見性傷害，當傷害達到一定程度后，才會在植株的外在形態結構上（如葉片、枝條、花、果等）表現出不同類型的可見性傷害癥狀[15]。植物（主要指葉片）受害癥狀與大氣污染物的種類、質量濃度和接觸時間有相關性，葉片傷害癥狀是反映植物對污染物敏感反應的直觀指標[16]。NO2對植物的傷害癥狀一般呈水漬狀，然后出現褪綠現象，也有部分樹種出現各種色素斑（呈暗紫色、紫褐色棕褐色），或失綠與褐色相間成斑駁狀[17]。目前已有眾多學者結合高光譜[18]、可見光、熱成像[19]等手段預測植物體內葉綠素含量，用于評估植物生長、健康狀況、生產力、病蟲害等。本研究發現，不同濃度NO2脅迫下，三角梅葉片的Lab 色度具有一定程度的變化，但對葉片顏色的影響不顯著。表明三角梅對NO2（8 μL·L-1及以下）的耐受能力較強，短期脅迫不會顯現出較大的形態差異。

葉綠素是植物進行光合作用最重要的一類色素，其含量可受多種逆境的脅迫而下降[20]，其含量的變化往往與葉片的生理活性、植物對環境的適應性和抗逆性有關[21]。有研究表明，低濃度NO2短期脅迫（5 ～15 d）可增加葉綠素含量，從而導致光合當濃度超過傷害閾值葉綠素含量開始下降，不同植物的閾值不同，如豌豆NO2閾值為1 μL·L-1[22]，而大豆為0.1 μL·L-1[23]。這可能是由于植物在遭受NO2脅迫時，通過增加自身的葉綠素含量提高光合作用的效率，從而為碳同化提供更充足的能量以耐受NO2脅迫，在超過自身能力承受范圍后，較高濃度NO2脅迫會破壞葉片的保護層，光合色素合成受到抑制，使葉片光合色素含量降低[24]。本研究發現，三角梅葉綠素及類胡蘿卜素含量隨著脅迫程度的增加呈先上升后下降的趨勢，其中4 μL·L-1NO2處理對三角梅光合色素含量的促進作用更明顯，8 μL·L-1NO2在脅迫后期則對光合色素起到一定的抑制，表明三角梅在受到說明三角梅的耐受閾值在4 ～8 μL·L-1之間，與前人研究結果類似[7-8]。研究表明低濃度NO2可誘導PsbO 和PsbP 放氧增強蛋白發生硝化作用，蛋白質酪氨酸硝化改變了葉片細胞蛋白質的生理功能，從而促進植物生長，適當的光照可以催化硝化作用[25]，因此NO2脅迫對三角梅光合能力與植物生長速率的影響及其二者之間的相互作用有待進一步探討。此外有研究認為，在脅迫環境中，主要起輔助保護作用的葉綠素b 與對植物光合起主要作用的葉綠素a 相比更容易分解，以減少捕光色素蛋白復合體的含量，降低光系統對光能的捕獲，使得葉綠素a/b 值升高，而部分研究則得出相反結論[7]。本研究中，三角梅的葉綠素a、b 含量變化基本趨于一致，可能是由于植物處于逆境時，其葉綠素含量的變化趨勢與植物本身的抗逆性、光照條件、脅迫時間有關[26-27]。

3.2 NO2 對三角梅葉片含水量及滲透調節系統的影響

在大氣污染脅迫條件下，細胞內溶物質（Pro、SP 等）發生主動積累，并引起細胞滲透勢的下降促使植株吸收更多水分，維持一定的膨壓，有助于維持細胞正常代謝提高植物的抗性。因此，滲透調節物質的含量與植物抗性密切相關[4]。其中Pro 作為細胞內部滲透調節劑和保護劑，在植物遭受外界空氣污染脅迫時，能夠穩定細胞膜系統并且降低膜脂過氧化，Pro 積累量越多，說明植物抗性越強[28]。本研究表明，隨著脅迫程度的增加，脅迫初期三角梅Pro 含量總體呈先上升后下降的趨勢；而SP 含量總體呈下降趨勢，與前人研究成果類似[29]。葉片RWC 上升后下降，WSD 則相反，并且SP 含量與葉片RWC 呈顯著負相關性（P＜0.05），與WSD 則呈顯著正相關（P＜0.05）。這一結果可能是植物在可接受脅迫范圍內做出的適應性反應，通過綜合調節滲透調節物質來進行生長補償效應[30]，以維持植物體內滲透壓平衡，體現了植物對環境變化的可塑性[31]。SP 含量逐漸降低與歐陽澤怡等[29]、王麗華等[32]的研究成果相似，原因可能是脅迫破壞了其本身的蛋白和逆境蛋白合成機制。葉片含水量由多種滲透調節物質調控，本研究主成分分析結果表明SP 為三角梅在NO2脅迫下滲透調節系統的主導因素。Takahashi等[25]利用15N 同位素發現植物體內的NO2-N 僅占總氮含量的5%，因此NO2更可能作為植物的信號分子而不是氮源調節植物的各項生理功能，目前已發現了多種信號分子，如NO、SO2、Ca2+等，NO2在增強滲透調節系統、抗氧化系統，驅動次生代謝，合成脅迫蛋白等方面的作用仍需進一步探究。

3.3 NO2 對三角梅ROS 自由基清除系統的影響

植物體在脅迫環境下會產生大量活性氧自由基（ROS），誘發一系列應激反應[33-34]。植物在長期進化過程中形成了相應的保護機制，主要分為酶促（超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD 和過氧化氫酶CAT）系統和非酶促（抗壞血酸AsA、谷胱甘肽還原酶GR）系統。SOD 作為植物抗氧化系統的第一道防線，催化超氧陰離子（O2.-）生成和 H2O2，在清除ROS 自由基、維持膜結構和功能完整性方面起著重要作用[35-36]。Teklemariam等[37]發現葉片AsA 含量較高的植物一般具有較強的NO2吸收能力，其中質外體AsA 含量可能是決定植物耐受能力的主要因素[38]，當空氣中NO2濃度較低時，AsA 還參與植物體內NO2轉換為NO的代謝過程[2]，可見AsA 水平在一定程度上可以反映植物吸收抵抗NO2的能力。丙二醛（MDA）是由活性氧積累誘發的脂質過氧化作用的最終產物，因此MDA 含量的變化可以反映細胞膜的氧化損傷程度[39]，MDA 積累越多表明植物受傷害越嚴重[40]。本研究表明，AsA 與MDA 存在極顯著負相關性（P＜0.01），三角梅AsA 含量在高濃度NO2處理下呈現上升的趨勢，MDA 含量與CK 相比整體呈現下降趨勢，這與前人研究成果相似[7,41-42]。說明三角梅在NO2脅迫下可以維持植株體內較高水平的AsA 含量，保證了ASA-GSH 代謝途徑的高效運行，從而抑制MDA 的積累，降低膜脂過氧化程度[43]。本研究中SOD 含量基本保持穩定，原因可能是三角梅已通過非酶促保護系統或其他的適應性應激機制或保護機制緩解了NO2對植株的氧化損傷，表明植物體內激活一個或以上ROS 清除系統就可以最大限度地減少植物體內的氧化脅迫程度[44]。然而Pellegrini 等[38]研究發現，AsA 雖是櫟屬植物抵御O3氧化損傷的第一道防線，AsA 自由基清除系統仍未緩解ROS 對細胞膜的不利影響。因此有關三角梅的不同自由基清除途徑之間的關系有待進一步探究。

本研究由于試驗材料及條件的限制，僅針對三角梅幼苗在NO2脅迫下的形態、光合及部分生理響應進行了研究，并且人工控制環境與實際道路環境差異較大。下一步將針對三角梅抵抗NO2脅迫的表達基因、代謝通路等進行研究，揭示其分子響應機制，并在實際道路綠地和實驗室控制兩種環境條件下，進行不同種園林植物對NO2污染物的響應差異研究，為城市道路綠地定向治理NO2污染提供理論依據。

4 結 論

高濃度短期NO2脅迫下三角梅基本可以維持正常生長，AsA 和光合色素含量在脅迫期間具有顯著差異（P＜0.05），其他生理性狀差異不顯著，其中RWC 與WSD 呈極顯著負相關，并與SP 呈顯著相關；AsA 與MDA 呈極顯著負相關；光合色素之間呈極顯著正相關。主成分分析表明三角梅可通過調控自身光合能力、水分利用能力及滲透調節能力等耐受短期高濃度NO2急性脅迫，其中葉綠素a、b 含量及類胡蘿卜素含量可作為三角梅響應脅迫的主要指標，WSD 和SP 可作為脅迫響應的輔助指標。