內皮抑制素抑制RhoA/ROCK信號通路減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷實驗研究

岳 淵，張 濤，柳朝陽，張鵬霞，肖 漓，張 娟

1 佳木斯大學基礎醫學院，微生態-免疫調節網絡與相關疾病重點實驗室，黑龍江佳木斯 154007；2 佳木斯大學第一附屬醫院神經四科，黑龍江佳木斯 154003；3 解放軍總醫院第八醫學中心呼吸與危重癥醫學部研究所，北京市器官移植與免疫調節重點實驗室，北京 100091

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指在感染、休克、創傷和燒傷等非心源性疾病過程中，肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質和肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，是常見的極危重癥疾病之一，病死率高達35% ~ 40%[1-4]。RhoA/ROCK通路是鈣敏感的信號通路，該通路通過影響肌球蛋白ATP 酶的活性對細胞骨架收縮反應進行調控[5]。ROCK參與多種細胞活動，如增殖、分化、凋亡以及細胞骨架蛋白的合成、降解和運動調控等[6-7]。在細胞骨架收縮反應中，ROCK引起肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC) 的磷酸化，磷酸化的MLC促進肌球蛋白 ATP酶激活，導致細胞骨架蛋白的重組、張力纖維成型和細胞收縮[8]。因此，RhoA/ROCK信號通路在細胞屏障通透性增加中起重要作用，在調節炎癥反應中也有明顯效果[9]。ROCK有ROCK1和ROCK2兩種形態，ROCK1主要在肺中表達[10-11]。內皮抑制素(endostatin，ES)是人基底膜膠原ⅩⅧ水解而來的蛋白質小片段，分子量為20 ~ 28 kU，具有抑制血管內皮細胞增殖與遷移，進而抑制血管生成的功能[12-13]。近年來，對于內皮抑制素的探索主要集中在腫瘤治療領域，其在急性肺損傷中作用的研究未見報道[14]。本研究擬探討內皮抑制素在脂多糖誘導的急性肺損傷中的作用及可能機制。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠共36只，雄性，6周齡，體質量(20.15 ± 2.29) g，由軍事科學院軍事醫學研究院動物實驗中心提供。小鼠飼養于恒定濕溫、12 h晝夜循環的SPF級標準動物房內，可自由飲食飲水，適應性喂養1周后再開始實驗。實驗經軍事醫學研究院醫學倫理委員會批準(編號：IACUC-DWZX-2022-712)，實驗動物許可證編號：SCXK(京)2021-0006。

2 主要藥物、試劑及儀器 肺部液體定量霧化器(HRH-MAG4)和小動物喉鏡(HRH-HAG5)購于北京慧榮和科技有限公司；LPS固體粉末購于美國默克Sigma生物公司(L2880-10MG)；ES注射液(恩度)購于山東先聲生物制藥有限公司；TUNEL試劑購于瑞士Roche生物公司(11684817910)；含DAPI防熒光淬滅封片劑購于北京中杉金橋有限公司(ZLI9557)；小鼠細胞因子流式試劑Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Inflammation Kit購于美國BD公司(552364)；小鼠VEGF ELISA試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司(emc103.96)；兔抗小鼠RhoA多克隆抗體(ab187027)、鼠抗小鼠ROCK1單克隆抗體(ab134181)購于美國Abcam公司；小鼠單克隆抗體β-actin購于Affinity Biosciences生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(p0012s)購于碧云天生物有限公司。酶標儀(M200-PRO，瑞士Tecan)，流式細胞儀(FACSCⅡTM，美國BD公司)，熒光顯微鏡(Nikon，日本)，電泳儀(DYY-7C)、垂直電泳槽(DYCZ-24DN)與電轉儀(DYCZ-40)均購于北京六一儀器廠。

3 動物模型建立及分組 采用隨機數法將36只小鼠分為對照組(n=6)、模型LPS組(n=6)和內皮抑制素干預組(LPS＋ES，n=24)，其中內皮抑制素干預組又根據不同的給藥劑量和治療時間分為4組，分別為ES干預組A (LPS + 1 mg/kg ES 6 h，n=6)、ES干預組B (LPS + 1 mg/kg ES 12 h，n=6)、ES干預組C (LPS + 5 mg/kg ES 6 h，n=6)和ES干預組D (LPS + 5 mg/kg ES 12 h，n=6)。將LPS溶液按照15 mg/kg的劑量使用肺部液體定量霧化器對LPS組和內皮抑制素干預組的小鼠進行氣管內霧化，造模時間為24 h。內皮抑制素干預組各組在氣管內霧化LPS 24 h后，腹腔注射內皮抑制素注射液。如前所述，按照1 mg/kg和5 mg/kg的干預劑量分別作用6 h與12 h。對照組在相同時間點采用同樣方式遞送等體積0.9%氯化鈉注射液。所有實驗小鼠均采用過量麻醉法處死(將戊巴比妥鈉按照3倍以上常規麻醉劑量對小鼠進行腹腔一次性注射)，留取標本備用。

4 肺組織形態學觀察 取出小鼠完整雙肺，肉眼觀察雙肺顏色、光澤、彈性、淤血和腫脹程度，并拍照留存。

5 肺系數檢測 取出小鼠完整雙肺后，0.9%氯化鈉注射液沖洗肺組織表面血漬，用紗布小心吸干表面水分，置于電子秤稱取雙肺重量并記錄，計算肺系數值(%)=肺濕重(g)/體質量(g) × 100%。

6 肺組織病理學檢查 新鮮肺組織用4%多聚甲醛固定48 h。經脫水、浸蠟和包埋后用病理切片機4 μm連續切片，HE染色后用顯微鏡采集圖像。用半定量標尺進行評分，雙盲法評估肺損傷程度。

7 ELISA檢測血清中VEGF含量 取材時，先用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，摘取小鼠單側眼球取血，靜置離心后取上層血清。按照深圳欣博盛生物科技有限公司生產的小鼠VEGF ELISA試劑盒說明書進行操作，實驗重復3次。

8 流式細胞術檢測TNF-α和IL-6水平 取BALF時，麻醉并固定好小鼠后暴露出氣管，在氣管分叉處插入氣管插管，用預冷的無菌PBS緩慢灌洗小鼠肺部，每次0.7 mL，重復灌洗3次，回收后混勻，立即4℃離心(1 500 r/min，15 min)并取上清。取血方法同上段。流式細胞術檢測小鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6水平。依據美國BD公司的Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit說明進行操作，實驗重復3次。

9 TUNEL檢測肺部細胞凋亡 實驗小鼠肺部未經染色的石蠟切片按瑞士Roche生物公司TUNEL試劑盒中的說明書操作，完成后用含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡采集圖像，采用隨機法計數凋亡細胞數，每組切片隨機選取1張，每張隨機選取10個視野，計數凋亡細胞個數。

10 Western blot檢測肺組織RhoA和ROCK1蛋白表達 取少量實驗小鼠肺組織樣品剪碎勻漿，冰上裂解后4℃離心，BCA法測定蛋白濃度。將制備好的膠固定于電泳槽，蛋白樣品及Marker加入上樣孔，確定目的蛋白徹底分離時停止電泳。TBST封閉2 h，一抗孵育過夜后，加入二抗，孵育2 h。顯影定量分析。

11 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。正態分布的連續變量以表示，計數資料以數值表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗進行分析，多組間比較正態分布的連續變量采用方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠肺組織形態學觀察 經肉眼觀察，對照組小鼠肺組織呈淡粉紅色且濕潤，表面光滑，未出現出血灶和出血點；LPS組小鼠肺組織顏色加深，呈深紅色且腫脹明顯，局部出現明顯出血灶和散在出血點；ES干預組各組隨著給藥劑量和時間的增加，小鼠肺組織呈現不同程度的變化，肺組織腫脹程度減小，表面顏色變淺。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織形態學觀察Fig.1 Lung morphology observation of mice in each group

2 各組小鼠肺系數結果 與對照組相比，LPS組肺系數增大[(0.64 ± 0.06)%vs(1.15 ± 0.16)%，P＜0.01]；與LPS組相比，ES干預組D肺系數減小[(1.15 ± 0.16)%vs(0.81 ± 0.03)%，P＜0.01]；4個ES干預組之間兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠肺系數結果Fig.2 Lung coefficient of mice in each group

3 各組小鼠肺組織病理學改變 對照組肺泡結構清晰，肺泡間隔未增寬，肺泡腔內無出血且無炎性細胞浸潤；LPS組肺泡間隔增寬并伴有大量炎性細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡結構呈現不同程度的破壞；ES干預組各組肺組織中的炎性細胞浸潤和炎性滲出逐漸減少，肺間質增寬程度減小，肺間質水腫程度有所減輕；見圖3A。與對照組相比，LPS組肺損傷評分升高(0.29 ± 0.49vs9.9 ±0.69，P＜0.01)；與LPS組相比，ES干預組C、D的肺損傷評分降低(9.9 ± 0.69vs5.9 ± 0.69，P＜0.05；9.9 ± 0.69vs3.4 ± 0.53，P＜0.01)；與ES干預組A相比，ES干預組D肺損傷評分降低(8.71 ± 0.76vs3.4 ± 0.53，P＜0.05)；見圖3B。

圖3 各組小鼠肺組織病理學檢查(A)及肺損傷評分比較結果(B)Fig.3 Lung histopathology (A) and lung injury score (B) of mice in each group

4 各組小鼠肺組織細胞凋亡的改變 與對照組相比，LPS組小鼠肺組織凋亡細胞數增多(0.70 ±0.95vs13.40 ± 5.13，P＜0.01)；與LPS組相比，ES干預組A、B、C、D小鼠肺組織凋亡細胞數均減少(13.40 ± 5.13vs2.30 ± 0.95，P＜0.05；13.40 ±5.13vs2.00 ± 0.82，P＜0.01；13.40 ± 5.13vs2.40 ±1.35，P＜0.05；13.40 ± 5.13vs1.30 ± 1.16，P＜0.01)；4個ES干預組之間兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖4A、圖4B。

圖4 各組小鼠肺組織細胞凋亡情況 A：各組小鼠肺組織細胞凋亡TUNEL染色；B：各組小鼠肺組織TUNEL染色陽性細胞數Fig.4 Apoptosis of lung tissue cells of mice in each group A: TUNEL staining of apoptotic cells in lung tissue of mice in each group;B: The numbers of TUNEL positive cells in lung tissue of mice in each group

5 各組小鼠血清VEGF水平 與對照組相比，LPS組小鼠血清中VEGF表達上調(32.92 ± 7.85vs219.80 ± 20.77，P＜0.05)；與LPS組相比，ES干預組D血清VEGF表達下調(219.80 ± 20.77vs30.41 ± 6.35，P＜0.01)；4個ES干預組之間兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖5。

圖5 各組小鼠血清中VEGF含量Fig.5 VEGF content in serum of mice in each group

6 各組小鼠細胞因子水平 與對照組相比，LPS組小鼠血清TNF-α水平升高 [(3.01 ± 1.78) pg/mLvs(49.71 ± 9.24) pg/mL，P＜0.01]；與LPS組相比，ES干預組D小鼠血清TNF-α水平下降[(49.71 ±9.24) pg/mLvs(6.17 ± 3.81) pg/mL，P＜0.01]；與對照組相比，LPS組小鼠BALF TNF-α水平升高[(10.58 ± 18.33) pg/mLvs(299.70 ± 45.66) pg/mL，P＜0.01]；與LPS組相比，ES干預組各組小鼠BALF TNF-α的水平差異均無統計學意義(P＞0.05)；4組ES干預組的血清與BALF TNF-α的水平兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見圖6A。與對照組相比，LPS組小鼠血清IL-6水平升高[(10.72 ±11.65) pg/mLvs(749.90 ± 135.80) pg/mL，P＜0.05]；與LPS組相比，ES干預組B、D小鼠血清IL-6水平降低[(749.90 ± 135.80) pg/mLvs(19.05 ±16.95) pg/mL，P＜0.05；(749.90 ± 135.80) pg/mLvs(10.22 ± 9.00) pg/mL，P＜0.01]；與對照組相比，LPS組小鼠BALF IL-6水平升高[(3.64 ± 6.31) pg/mLvs(161.30 ± 12.16) pg/mL，P＜0.01]；與LPS組相比，ES干預組各組小鼠BALF IL-6的水平差異均無統計學意義(P＞0.05)；4組ES干預組的血清與BALF IL-6的水平兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見圖6B。

圖6 小鼠血清與BALF中TNF-α (A)和IL-6 (B)的含量Fig.6 Levels of TNF-α (A) and IL-6 (B) in serum and BALF of mice

7 各組小鼠肺組織RhoA和ROCK1的蛋白表達與對照組相比，LPS組小鼠肺組織RhoA和ROCK1蛋白表達增加(0.65 ± 0.06vs1.67 ± 0.46，P＜0.05；0.42 ± 0.03vs1.91 ± 0.74，P＜0.05)；與LPS組相比，ES干預組D小鼠肺組織RhoA和ROCK1蛋白表達下降(1.67 ± 0.46vs0.67 ± 0.15，P＜0.05；1.91 ± 0.74vs0.44 ± 0.03，P＜0.05)；4組ES干預組的RhoA和ROCK1蛋白表達分別兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見圖7。

圖7 各組小鼠肺組織RhoA和ROCK1表達水平Fig.7 Expression levels of RhoA and ROCK1 in lung tissues of mice in each group

討 論

一直以來，急性肺損傷都是臨床面臨的難題，且尚未建立有效防治方法[14]。目前普遍認為急性肺損傷的病理機制與肺部炎癥失控有關，以促炎介質增加、炎性細胞浸潤、肺毛細血管內皮細胞通透性增高和肺組織細胞凋亡為主要病理特征[15]。因此，控制異常炎癥反應可以有效改善預后。LPS是建立急性肺損傷動物模型常用的誘導劑，可激活中性粒細胞，誘導機體產生大量炎性因子，釋放炎性介質，觸發炎癥反應[16]。

肺為高度血管化器官，整個肺血管系統由單層內皮細胞構成，內皮細胞外包裹著富含ⅩⅧ型膠原蛋白的基底膜。內皮抑制素是由ⅩⅧ型膠原蛋白水解而來的蛋白片段，其在人體循環系統中的含量為120 ~ 130 μg/L，在肝、腦、骨骼肌、心、腎等組織提取液中的含量為0.3 ~ 2 mg/L。內皮抑制素可特異性抑制血管內皮細胞生長，主要用于治療非小細胞肺癌等腫瘤，但其在急性肺損傷中的作用及機制研究未見報道[17-19]。

肉眼觀察小鼠肺組織，發現對照組小鼠肺組織呈淡粉紅色且表面光滑，未見出血點；LPS組小鼠肺組織腫脹明顯，肺表面存在出血灶或出血點，且有液體滲出。肺系數是衡量肺水腫的重要指標，值越高代表肺水腫程度越高。與對照組相比，LPS組肺系數顯著升高，表明急性肺損傷小鼠肺水腫嚴重。HE染色結果顯示，對照組小鼠肺組織結構正常，未見明顯病理改變，但LPS組小鼠肺間質和肺泡腔內有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，部分肺泡壁相連間斷，呈不規則塌陷狀，肺泡間隔充血水腫、明顯增寬。與對照組相比，LPS組肺損傷評分顯著升高。經不同劑量ES作用不同時間后，小鼠肺組織腫脹程度減輕，肺表面出血點減少或消失，肺組織中炎細胞浸潤與炎性滲出減少，肺間質水腫程度減輕，肺泡間隔增厚現象也有明顯改善。與LPS組相比，ES干預組D (5 mg/kg，12 h)肺系數值和肺損傷評分均顯著降低，證明劑量5 mg/kg的ES干預12 h可顯著改善急性肺損傷小鼠的肺水腫和損傷程度。由此初步判斷內皮抑制素可以發揮減輕急性肺損傷的作用，驗證了研究初期的假設。

細胞因子是炎癥反應中的重要炎性介質，在急性肺損傷發病機制中占主導地位，急性肺損傷導致免疫過度激活引發細胞因子風暴[20]。TNF-α和IL-6是細胞因子風暴的關鍵因子，其在血清和BALF中的水平能反映炎癥的嚴重程度[21]。本研究結果顯示，與對照組相比，LPS組血清和BALF中TNF-α、IL-6水平升高；與LPS組相比，ES干預組D血清中該兩種因子的水平均下降，提示內皮抑制素可減輕急性肺損傷的炎癥反應。ES干預組各組BALF與LPS組相比，TNF-α和IL-6水平降低，但差異無統計學意義。深入分析發現，在小鼠急性肺損傷模型中，內皮抑制素在外周血和肺部區域產生的作用不同，在外周血循環中的作用有顯著差異，而肺部區域炎性因子水平變化較小。我們推測與內皮抑制素的作用可及范圍有關，本研究遞送內皮抑制素的方式為腹腔注射，內皮抑制素經腹膜進入靜脈血管，隨血液流動發揮作用，一部分到達肺組織后起效緩慢，因此外周血中炎性因子水平降低，而肺部區域差異顯著[22-23]。

VEGF是調節血管生成的重要因子，與內皮抑制素相拮抗但又保持動態平衡，主要促進內皮細胞增殖并調節其形態，還能激活多種信號轉導途徑，參與炎癥反應[24]。有研究表明，急性肺損傷發生時，VEGF可作為一種提高肺血管對水和蛋白質滲透性的介質，提高肺內皮細胞屏障的通透性，加重肺水腫[25-26]。本研究發現，與對照組相比，LPS組小鼠血清中VEGF水平顯著上升，這與先前的研究結果一致[27]。與LPS組相比，ES干預組D(5 mg/kg，12 h) VEGF水平顯著降低，表明內皮抑制素能夠拮抗VEGF降低肺血管滲漏的作用，從而緩解急性肺損傷。

細胞凋亡異常引起一系列病理生理變化，凋亡過度時會導致組織細胞壞死和器官功能障礙或衰竭[28]。已明確肺微血管內皮細胞和肺泡上皮細胞的凋亡是急性肺損傷的發病機制之一，因此抑制肺組織細胞凋亡也是防治急性肺損傷的重要手段[29]。本研究結果顯示，與LPS組相比，ES干預組各組小鼠肺組織凋亡細胞數均減少，其中ES干預組B (1 mg/kg，12 h)與ES干預組D(5 mg/kg，12 h)有顯著差異。此結果表明內皮抑制素在小鼠急性肺損傷中有一定抗細胞凋亡作用。

研究發現，LPS可激活RhoA/ROCK通路，使RhoA和ROCK1蛋白表達上調，調節細胞骨架收縮，從而增強內皮細胞屏障通透性，使炎性細胞和炎性因子游出，引起炎癥反應[30-32]。這與本研究結果基本一致，與對照組相比，LPS組RhoA和ROCK1蛋白表達上調，表明RhoA/ROCK通路激活。本研究首次將RhoA/ROCK信號通路的變化與內皮抑制素對急性肺損傷作用的相關性進行探索。結果表明，與LPS組相比，ES干預組D小鼠肺組織中RhoA和ROCK1蛋白表達下調，提示內皮抑制素通過抑制RhoA/ROCK信號通路阻止內皮細胞屏障通透性增強，干預了炎癥級聯反應。

本研究將所有結果中ES干預組分別進行兩兩比較。有研究表明，在膿毒癥模型中內皮抑制素干預與生存率存在一定關系，內皮抑制素可呈劑量依賴性地提高膿毒癥小鼠的生存率[33]。本實驗以此作為理論基礎，使用內皮抑制素的劑量分別為1 mg/kg和5 mg/kg。此外，臨床上對于急性肺損傷的診斷和治療通常發生在疾病發作后，因此本研究增加了6 h和12 h兩個觀測時間點。與ES干預組A (1 mg/kg，6 h)相比，ES干預組D(5 mg/kg，12 h)的肺損傷評分降低，表明隨著內皮抑制素給藥劑量的加大和作用時間的延長，急性肺損傷得到一定緩解。但在其他結果中，ES干預組之間無統計學差異，我們推測這可能與分組數量有關，本研究所采用的高低兩種劑量和兩個觀測時間點仍存在一定局限性，未能較好地反映出內皮抑制素干預的劑量與時間依賴性。

綜上，本研究初步探索了內皮抑制素在急性肺損傷中發揮的積極作用，有望成為治療急性肺損傷的一種新策略。當然，其中諸多問題仍需深入研究。首先，內皮抑制素的遞送方式、給藥時間及劑量需要進一步驗證；其次，內皮抑制素對急性肺損傷發揮修復作用的機制也仍需探索，RhoA/ROCK信號通路僅是證明其作用的方向之一，其確鑿或發揮關鍵作用的靶點尚未揭示。

致謝感謝解放軍總醫院第八醫學中心呼吸與危重癥學部研究所提供的實驗平臺。

作者貢獻岳淵：論文選題，數據收集，數據整理，統計分析，起草文章，論文修改；張濤：論文選題，數據整理，統計分析，論文修改；柳朝陽：數據收集；張鵬霞：數據整理，統計分析；肖漓：論文選題，論文修改；張娟：數據收集。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：yueyuan1110@163.com。