烏司他丁對原發性沖擊傷小鼠早期肺損傷治療作用的研究

胡方超，柴家科，曲毅睿，荀浩怡，劉 甜，遲云飛，白海良，吳育壽，蘇小薇，孫 冉,3，劉翔宇

1 解放軍總醫院研究生院，北京 100853；2 解放軍總醫院第四醫學中心全軍燒傷研究所，北京 100048；3 河北北方學院，河北張家口 075132

沖擊傷是爆炸物爆炸時以熱能、動能、高壓沖擊波等形式快速釋放出的大量能量直接或間接作用于機體引起的損傷[1]，嚴重影響公共安全。阿富汗和伊拉克戰爭[2]、俄烏戰爭[3]、曼徹斯特體育館恐怖襲擊[4]、“八二”昆山粉塵爆炸[5]、天津化學品集裝箱爆炸[6]中，爆炸沖擊不僅造成巨大經濟損失，大量沖擊傷傷員生命安全更是受到嚴重威脅。

原發性沖擊傷是沖擊波直接作用于機體空氣-組織交界區域造成的組織損傷[7]，肺因肺泡充氣的結構特點，是原發性沖擊傷主要累及器官之一[8-9]，17% ~ 47%死于爆炸的人員有肺原發沖擊傷的證據，44%的沖擊傷住院患者和71%的危重患者有肺損傷[10]。研究表明，炎癥反應可能是原發性沖擊傷肺損傷的主要機制，可導致肺功能和組織病理學的變化，并具有時間依賴性[11]。中性粒細胞作為人體免疫的第一道防線，不僅參與多種炎癥因子的產生，其釋放的中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)亦在肺損傷進展中發揮重要作用。本實驗在構建中度原發性沖擊傷肺損傷小鼠模型的基礎上，用烏司他丁進行治療，通過對比對照組、沖擊傷組和烏司他丁組小鼠肺組織病理學、肺組織含水率、血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NF-κB、CXCL-1、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、MMP-9含量、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NAO)活性和肺組織NE、MMP-9的表達變化，以及對照組和B組、U組傷后48 h小鼠肺功能，初步探討烏司他丁是否可以通過抑制中性粒細胞作用，對原發性沖擊傷小鼠早期肺損傷起到治療作用，為臨床上原發性沖擊傷的救治提供依據。

材料與方法

1 實驗動物 清潔級C57BL/6小鼠136只，6 ~8周齡，體質量18 ~ 22 g，由牡丹江醫學院提供，于牡丹江醫學院科研平臺動物實驗室恒溫條件下適應性飼養1周，實驗前禁食12 h，禁水4 h。本研究經解放軍總醫院第四醫學中心實驗動物倫理委員會批準(審批號：S201507160113)。

2 主要試劑及儀器 聚黑鋁藥柱(10 g/次)由中國兵器裝備集團有限公司第208所提供；戊巴比妥鈉(Sigma，美國)；烏司他丁注射液(50 000 U/瓶，廣東天普生化醫藥股份有限公司)； Mouse TNF-α、CXCL-1、NF-κB、NE、MMP-9 ELISA試劑盒、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NAO)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；MMP-9抗體(Abcam/ab228402)；NE抗體(Affinity/AF0010)；辣根過氧化物酶HRP抗體(二抗，Abcam/ab6721)；PVDF膜(Millipore，0.22 μm)；酶標儀(BioTek-ELx800，美國)、恒溫箱(Thermo3111，美國)；雙垂直電泳槽(CAVOY/ MP-8001)、轉移槽(CAVOY/MP-3030)；WBP全身體積描記系統(上海塔望智能科技有限公司)等。

3 動物分組及模型建立 根據預實驗結果，將136只小鼠按隨機數字表法分為對照組(C組，n=16)、沖擊傷組(B組，n=60)和烏司他丁組(U組，n=60)，實驗前禁食12 h，禁水4 h。中度沖擊傷小鼠模型的建立參考課題組前期研究[12-13]，將B組、U組小鼠(共120只)予0.3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，均勻懸吊固定于以爆炸源(聚黑鋁藥柱，10 g)為中心、直徑為50 cm的圓形固定架上，每圈40只，左側肢體正對爆炸源。根據現場測壓結果，3次實驗超壓為(266 ±9.165) kPa。配制1×104U/mL烏司他丁溶液，U組致傷后立即按照5×104U/kg的劑量腹腔注射配制好的烏司他丁溶液，12 h/次，用藥劑量和時機參考課題組前期研究[12,14]，并考慮烏司他丁半衰期及不同種屬間劑量換算而制定；B組致傷后立即按照5 mL/kg劑量腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，12 h/次；C組除不致傷外，其余處理均同B組。2 h后各組動物均正常飼養。

4 檢測時間點及取材方法 于傷后6 h、24 h、48 h設觀察時間點。同一組小鼠均隨機兩兩配對，混合采集血液后離心獲取血清；B組、U組傷后6 h、24 h組均采血處死后立即取肺組織行相應處理；C組以及B組、U組傷后48 h組一同處理，隨機選取10只小鼠行活體肺功能檢測，檢測完畢后與其余小鼠一起按上述方法取血和肺組織。

5 左肺組織病理變化 C組以及B組、U組傷后各時間點各選取小鼠4只，眼球取血處死后，兩只并血離心取上清，-80℃保存備用。取左肺組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，連續切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察，Case-Viewer軟件閱片。

6 左肺組織含水量檢測 C組以及B組、U組傷后各時間點各選取小鼠6只，眼球取血處死后，兩只并血離心取上清，-80℃保存備用。取左肺組織稱量濕重后，放置于恒溫箱(80℃，72 h)中進行烘烤，稱量干重并計算組織含水率。

組織含水率=(濕重-干重)/濕重 × 100%

7 左肺組織NE、MMP-9表達測定 C組以及B組、U組傷后各時間點各選取小鼠4只，眼球取血處死后，兩只并血離心取上清，-80℃保存備用。取左肺組織，Western blot法測定左肺組織中NE、MMP-9表達水平。按照試劑盒說明書提取蛋白，依照電泳上樣量需要，調整蛋白濃度，100℃煮沸變性10 min；配制12%的分離膠，5%濃縮膠；取35 μg待檢測蛋白樣品在濃縮膠恒壓80 V條件下電泳20 min；在分離膠恒壓120 V條件下，電泳至溴酚藍到凝膠底部；準備PVDF膜和兩張厚濾紙，按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序放入海綿墊夾層中，趕盡氣泡，300 mA恒流下轉膜2 h；轉膜后將PVDF膜浸泡于Milk Blocking Buffer中，搖床輕搖封閉1 h，結束后PVDF膜置于雜交袋中；1% BSA/5% milk稀釋一抗，加入雜交袋中，封口，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入羊抗兔-HRP 二抗(1∶5 000稀釋)，室溫輕搖孵育50 min，TBST洗膜4次，每次5 min；ECL法顯色，暗室中曝光、顯影并定影，Quantity One v.4.6.2軟件讀取灰度值。

8 血清TNF-α、NF-κB、CXCL-1、NE、MMP-9含量、NAO活性檢測 血清樣本需兩只小鼠并血獲取。小鼠眼球取血、并血后，靜置30 min，2 500 r/min離心20 min后取上清，-80℃保存，備后續檢測。血清TNF-α、NF-κB、CXCL-1、NE、MMP-9含量采用ELISA檢測，方法如下：按照各試劑盒操作說明，將標準品、生物素化抗體、酶結合物及洗滌液進行稀釋；在標準品孔、樣本孔、空白孔加入相應樣品，封板37℃溫育1 h；取出酶標板，棄去液體，每孔加入生物素化抗體100 μL，封板37℃溫育1 h；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復3次；每孔加入酶結合物工作液100 μL，封板37℃溫育30 min后，上述方法洗板5次；加底物(TMB) 90 μL，封板37℃避光孵育15 min；去除酶標板，每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD值；采用ELISA Calc軟件進行數據分析，標準曲線選擇四參數Logistic曲線擬合。NAO活性：按照其試劑盒說明書對液體樣本直接檢測，按照每毫克組織蛋白每分鐘在反應體系中使450 nm處吸光值變化0.01為1酶活單位的定義計算酶活性。

9 肺功能檢測 C組以及B組、U組傷后48 h，各取小鼠10只，采用無約束全身體積描記系統(whole-body plethysmograph，WBP)對肺功能進行檢測，檢測完畢后與其余小鼠一同按上述方法取血和肺組織。WBP全身體積描記系統可以通過測量動物呼吸產生的“箱體氣流”，對清醒自由活動的小動物進行肺功能及氣道反應相關測試。按說明連接系統，待觀察小鼠置于體積描記器內，在溫度適宜、安靜的環境中穩定30 min后開始檢測。檢測主要指標如下，肺容積指標：潮氣量(tidal volume, VT)；通氣指標：呼吸頻率(frequency，F)、每分通氣量(minute ventilation volume，MV)；氣道阻塞指標：呼氣中期流速(mid-expiratory flow rate，EF50)、支氣管收縮程度指標Penh= PEF/PIF × (Te/Tr-1)；傳導性指標 ：最大呼氣流速(peak expiratory flow，PEF) 、最大吸氣流速(peak inspiratory flow，PIF)。

10 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，GraphPad9.0進行圖形繪制，計量資料符合正態分布以表示，各時間點組間總體比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用Bonferroni或LSD校正。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠建模及生存情況 B組及U組造模后2 h內均出現死亡小鼠。B組存活48只，死亡12只；U組存活44只，死亡16只，兩組病死率差異無統計學意義(P=0.388)。根據小鼠存活情況，B組傷后各時間點各選取小鼠16只，U組傷后6 h、24 h各選取小鼠14只，傷后48 h選取小鼠16只，C組選取小鼠16只，進行相關指標檢測。

2 肺組織病理變化 對照組左肺組織肺泡、支氣管等結構清晰，未見明顯異常。沖擊傷組：傷后6 h，組織肺泡、支氣管等結構清晰，血管和肺泡壁可見明顯炎癥細胞浸潤，少量肺泡壁細胞腫脹，組織輕度淤血；傷后24 h，肺組織中較多肺泡壁細胞腫脹、脫落，可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔出血嚴重；傷后48 h，可見大量炎癥細胞浸潤，大量肺泡壁嚴重增厚，肺泡腔狹窄，結締組織增生，組織淤血較多。烏司他丁治療組：傷后6 h組織肺泡、支氣管等結構清晰，血管內可見少量炎癥細胞，組織輕度淤血，未見其他明顯異常；傷后24 h，組織內可見少量炎癥細胞浸潤，偶見個別肺泡壁細胞腫脹，組織輕度淤血，未見其他明顯異常；傷后48 h，組織肺泡、支氣管等結構清晰，組織內可見少量肺泡壁細胞腫脹，肺泡壁輕微增厚，未見明顯炎癥浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化(HE染色，20×)。圖中黑色箭頭所示為炎癥細胞浸潤，紅色箭頭所示為肺泡細胞腫脹、脫落Fig.1 Pathological changes of lung tissues of mice (HE staining, 20×). Black arrows indicate inflammatory cell infiltration; Red arrows indicate swelling and shedding of alveolar cells

3 肺組織含水率 傷后6 h，B組、U組小鼠左肺組織含水量分別為83.28% ± 1.40%和80.81% ±10.86%，差異有統計學意義(P=0.036)；B組、U組小鼠左肺組織含水量分別與C組(77.02% ±1.98%)相比，差異均有統計學意義(P＜0.01)。傷后24 h，B組、U組小鼠左肺組織含水量分別為85.64% ± 0.87%和82.44% ± 0.94%，差異有統計學意義(P=0.003)；B組、U組小鼠左肺組織含水量分別與C組相比，差異均有統計學意義(P＜0.01)。傷后48 h，B組、U組小鼠左肺組織含水量分別為82.43% ± 1.59%和79.39% ± 0.73%，差異有統計學意義(P=0.011)；B組小鼠左肺組織含水量與C組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)；U組小鼠左肺組織含水量與C組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 小鼠肺組織含水率比較(n=6)Fig.2 Comparison of lung tissue water content of mice (n=6)

4 肺組織NE、MMP-9表達 B組、U組傷后各時間點左肺組織NE、MMP-9表達均高于C組(0.1833 ± 0.0806、0.0803 ± 0.0255)。U組NE、MMP-9表達均在傷后6 h達到最高(0.3784 ± 0.0771、0.4326 ± 0.1367)，24 h、48 h其表達逐漸下降(0.2659 ± 0.0734、0.1941 ± 0.0187；0.2405 ± 0.0755、0.1703 ± 0.0171)；B組NE、MMP-9傷后6 h含量分別為(0.4872 ± 0.0494、0.4326 ± 0.1367)，傷后24 h其表達降低(0.3204 ± 0.0473、0.3435 ±0.0774)，而在48 h，NE、MMP-9表達又出現較大幅度升高(0.6251 ± 0.0453、0.6615 ± 0.1476)；B組各時間點左肺組織NE、MMP-9表達亦均高于U組，且在傷后48 h，差異有統計學意義(P=0.034、P=0.033)。見圖3。

圖3 小鼠肺組織Western blot結果(A)及NE (B)、MMP-9 (C)表達(n=4；aP＜0.05，vs C組；bP＜0.05，vs B組)Fig.3 Result of Western blot (A) and expression of NE (B), MMP-9(C) in lung tissue of mice (n=4; aP＜0.05, vs group C;bP＜0.05, vs group B)

5 血清TNF-α、NF-κB、CXCL-1、NE、MMP-9含量、NAO活性變化 傷后各時間點，B組、U組血清TNF-α、NF-κB、CXCL-1、NE、MMP-9含量、NAO活性均高于C組，差異均有統計學意義。B組傷后各時間點各指標均較U組顯著升高，其中兩組傷后6 h、24 h、48 h的TNF-α、NF-κB、CXCL-1含量差異均有統計學意義(P＜0.01)。NE含量傷后6 h兩組差異無統計學意義，傷后24 h、48 h，B組顯著升高，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)。MMP-9含量，傷后6 h兩組差異無意義；傷后24 h，兩組MMP-9含量均有降低，且U組顯著下降，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)；傷后48 h，兩組MMP-9含量均升高，其中B組顯著升高，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)。兩組NAO活性傷后6 h、24 h差異無統計學意義，傷后48 h B組NAO活性繼續升高，而U組活性較24 h下降，兩組差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖4。

圖4 小鼠血清TNF-α (A)、NF-κB (B)、CXCL-1 (C)、NE (D)、MMP-9 (E)含量、NAO (F)活性變化(U組傷后6 h、24 h，n=7；余n=8)Fig.4 Comparison of sera TNF-α (A), NF-κB (B), CXCL-1 (C), NE (D), MMP-9 (E) contents and NAO (F) activity of mice (Group U: 6 h, 24 h,n=7; Other groups: n=8)

6 肺功能結果 與C組比較，傷后48 h B組小鼠肺功能顯著下降，主要表現為容量指標VT降低，通氣指標F增加、MV降低，傳導指標PIF、PEF降低，以及氣道阻塞指標EF50和反應氣道狹窄的Penh升高，各指標差異均有統計學意義(P＜0.01)。與B組比較，U組肺功能有所改善，其中VT、PIF升高，F、EF50、Penh降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 傷后48 h各組小鼠肺功能指標對比(n=10)Tab. 1 Comparison of lung function indexes of mice in each group at 48 h after injury (n=10)

討 論

原發性沖擊傷是爆炸引起的超壓通過產生剝脫效應、內爆效應和慣性，集中作用于機體，特別是空氣-組織交界區域，所直接造成的組織損傷，肺因肺泡內充滿單層上皮細胞和豐富的血管結構，存在大量的空氣及組織交界區域，是主要受累器官[7,15-16]。肺原發性沖擊傷通常不會在體表產生明顯的創面，其早期體征不明顯，但癥狀嚴重，具有“外輕內重，發展迅速”的特點，如果治療不及時，可發展為急性呼吸窘迫綜合征[17]，導致高達46% ~ 57%的病死率[18]。

烏司他丁是從人新鮮尿液里提取的一種酸性糖蛋白，含兩個活性區域，具有廣譜抗炎作用[19-20]，可減少不良刺激所引起的炎癥因子產生和氧自由基釋放[21-22]，減輕各種炎癥介質對主要臟器功能的損害和液體滲出[23-24]，改善凝血功能[12,14]，并能有效抑制急慢性肺損傷[25-27]。

本實驗測量比較了對照組、沖擊傷組和烏司他丁組小鼠肺組織病理、肺組織含水率以及傷后48 h肺功能的改變，結果顯示，沖擊傷組傷后6 h即可見到較明顯中性粒細胞浸潤，24 h、48 h有大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁嚴重增厚，肺泡腔狹窄，結締組織增生，組織淤血較多；而烏司他丁組各時間點炎癥細胞浸潤顯著減少，肺泡腫脹及淤血程度較沖擊傷組顯著減輕。傷后6 h、24 h、48 h烏司他丁組肺組織含水率均低于沖擊傷組，差異有統計學意義。傷后48 h烏司他丁組肺功能較沖擊傷組有所改善，其中VT、PIF升高，F、EF50、Penh降低。以上結果表明，烏司他丁可以有效抑制原發性沖擊傷小鼠肺組織的炎癥細胞浸潤，防止肺泡結構破壞，減輕肺出血和肺水腫，增加呼吸容量，緩解氣道狹窄，改善呼吸功能，證明了烏司他丁對沖擊傷小鼠早期原發性肺損傷具有一定的治療作用。

TNF-α是體內重要的炎癥因子，在炎癥反應啟動和發展過程中起到重要作用。肺組織破壞導致TNF-α過量釋放，不僅破壞血管內皮緊密連接[28]，引起血管通透性增加，促進中性粒細胞滲出并在肺內聚集[11,29]，還可以通過激活IκB通路使NF-κB活化[29]，進而誘導IL-8等多種細胞因子的生成，參與炎癥反應[30-31]，而IL-8可引起中性粒細胞趨化和活化，促進溶酶體和氧自由基的釋放，加重炎癥反應和組織破壞[32-33]。本實驗結果提示，烏司他丁干預使得沖擊傷小鼠血清TNF-α、NF-κB、CXCL-1(小鼠體內IL-8功能同源物)含量顯著降低，證明了烏司他丁可以抑制炎癥因子產生，減少血液中炎癥介質水平，保護肺組織緊密連接，減少炎癥細胞浸潤，減輕肺水腫和氧化損傷，發揮對原發性沖擊傷小鼠肺組織的保護作用。

中性粒細胞可導致原發性沖擊傷肺損傷加重[34-35]。沖擊波在肺部產生壓力差，導致肺泡微血管破裂，引起肺出血，進而激活肺泡巨噬細胞向肺內遷移并釋中性粒細胞相關趨化因子，趨化中性粒細胞向肺組織內聚集。中性粒細胞通過產生氧自由基和脫顆粒釋放NE、MMP-9等蛋白水解酶，加重肺組織破壞[35-36]。中性粒細胞受刺激后會激活其NAO，導致大量超氧化物的生成[37]，因此NAO活性可用作反應體內ROS生成的指標；NE可降解細胞外基質中幾乎所有蛋白，破壞緊密的細胞間連接，增強血管通透性，并能減弱巨噬細胞對中性粒細胞的吞噬作用[38-39]。MMP-9是多形核中性粒細胞遷移和肺泡毛細血管滲漏的必需條件[35]，其可降解包括Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白和明膠在內的基底膜成分，并刺激肺成纖維細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞和血管內皮細胞等釋放出更多的MMP，導致中性粒細胞進一步聚集，放大對肺組織的損傷[40]。本實驗中，沖擊傷組、烏司他丁組傷后各時間點NAO活性均較對照組顯著升高，但在傷后48 h，烏司他丁組的NAO活性較沖擊傷組顯著下降，提示烏司他丁可能通過抑制NAO活性減少ROS生成，進而減輕氧化應激損傷；而血清NE、MMP-9含量和肺組織NE、MMP-9表達水平檢測結果表明，正常小鼠血清和肺組織中僅有少量NE、MMP-9，B組血清NE、MMP-9含量和肺組織中NE、MMP-9表達水平顯著升高，烏司他丁組血清NE、MMP-9含量和肺組織中NE、MMP-9表達水平較沖擊傷組顯著降低，證明烏司他丁可以有效抑制NE、MMP-9的產生，減少細胞外基質的破壞，保護肺組織緊密連接，減少中性粒細胞浸潤和炎癥因子產生，進而防止肺組織的進行性破壞。

本實驗主要存在一些不足：(1)沒有進行血藥濃度監測和藥物不同劑量之間的療效對比，不能確定最佳用藥劑量；(2)本實驗僅針對中度原發性沖擊傷肺損傷進行研究，但爆炸沖擊往往造成更嚴重的損傷類型，如重度沖擊傷、燒沖復合傷等，其病理生理改變更加復雜，器官障礙發生早、并發癥多、病死率高，烏司他丁能否通過抑制中性粒細胞作用改善該類嚴重、復雜損傷的多器官功能，提高生存率，是下一步研究的重點；(3)需進一步的機制研究對實驗結論進行更加充分的說明。

綜上所述，本實驗結果表明早期應用烏司他丁可以抑制原發性沖擊傷肺損傷小鼠體內細胞因子產生、中性粒細胞聚集、氧自由基和多種中性粒細胞來源絲氨酸蛋白酶產生，有效抑制了過度炎癥反應，防止肺組織進行性損傷，最終表現為肺組織病理學的好轉和肺功能改善，證明了烏司他丁對原發性沖擊傷小鼠早期肺損傷具有治療作用，為臨床上原發性沖擊傷的救治提供依據。

作者貢獻胡方超：實驗設計與實施，數據整理與分析，文章撰寫；柴家科：資金獲取，實驗指導，文章審讀與修訂；曲毅睿、荀浩怡：共同參與實驗實施；劉甜、遲云飛：實驗設計，文章審讀與修訂；白海良、吳育壽、蘇小薇、孫冉、劉翔宇：場地布置，器材準備，輔助實施。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：hfcyuan@163.com。