南昌市動物園圈養動物3種腸道原蟲的分子檢測及基因型鑒定

梁瑋珈，陳小慶

南昌市動物園圈養動物3種腸道原蟲的分子檢測及基因型鑒定

梁瑋珈，陳小慶*

（江西農業大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045）

【目的】隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲是3種常見的寄生于人、家養動物和野生動物等腸道的寄生原蟲，主要引起人和動物的腹瀉。試驗旨在調查南昌市動物園部分圈養動物3種原蟲的感染情況并鑒定其基因型，為制訂動物園人獸共患病傳播防控措施提供參考依據?！痉椒ā繌哪喜袆游飯@采集非人靈長類、偶蹄類、奇蹄類、象類、有袋類、鳥類和食肉類等圈養動物糞便樣品共42份，提取糞樣總DNA；采用PCR技術擴增隱孢子蟲小亞單位核糖體RNA（SSU rRNA）、畢氏腸微孢子蟲核糖體RNA內轉錄間隔區（ITS）和芽囊原蟲SSU rRNA基因序列；并對陽性產物進行測序、序列比對及系統進化分析，確定3種腸道原蟲的感染情況和基因型?！窘Y果】42份糞便樣本中有17份樣品原蟲為陽性，總檢出率40.5%（17/42）；其中隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率分別為2.4%（1/42）、14.3%（6/42）和23.8%（10/42）。檢出動物陽性占比分別為：非人靈長類64.7%（11/17）、偶蹄類23.5%（4/17）、奇蹄類5.9%（1/17）、有袋類5.9%（1/17）；且非人靈長類動物存在畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲混合感染。通過序列比對及系統進化分析，在矮馬（奇蹄類）鑒定出1種隱孢子蟲基因型（姬鼠基因型II），在長臂猿、金絲猴、博士猴、紅尾長尾猴和羊駝中共鑒定到2種畢氏腸微孢子蟲基因型（，）。在松鼠猴、黑白疣猴、博士猴、黑葉猴、金絲猴、羚羊和袋鼠中共鑒定到5種芽囊原蟲基因型（、、、和）；其中芽囊原蟲（、）和畢氏腸微孢子蟲（、）均屬人獸共患基因型?！窘Y論】南昌市動物園圈養動物存在畢氏腸微孢子蟲、芽囊原蟲和隱孢子蟲感染；從畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲中鑒定出人獸共患基因型，有潛在的人獸共患傳播風險。動物園應進一步加強圈養動物腸道寄生原蟲的監測，做好驅蟲、消毒及預防人-獸傳播等預防工作。

圈養動物；畢氏腸微孢子蟲；芽囊原蟲；隱孢子蟲；分子檢測；基因型

【研究意義】隱孢子蟲（）、畢氏腸微孢子蟲（）和芽囊原蟲（）是3種常見的腸道寄生原蟲。其屬內種類復雜，具有廣泛的宿主適應性，可以感染人類、哺乳類、爬行類、鳥類等多種動物[1-3]。宿主感染后主要出現腹痛、腹瀉、嘔吐等臨床癥狀[1,3]，且可通過水源、食物、空氣等進行傳播，具有人獸共患風險。因此，調查動物園中圈養動物腸道原蟲感染情況，對于有效監測和防控動物園圈養動物3種腸道原蟲病具有重要的公共衛生學意義?！厩叭搜芯窟M展】隱孢子蟲和畢氏腸微孢子蟲基因型較多，具有人獸共患潛能，免疫力低下的兒童和老人更易感，癥狀相對較為嚴重[1,4]。目前已鑒定出240多種畢氏腸微孢子蟲基因型，常見的人獸共患畢氏腸微孢子蟲基因型主要有基因型、和等[5]；而隱孢子蟲主要為人隱孢子蟲（）、微小隱孢子蟲（）、鼠隱孢子蟲（）和火雞隱孢子蟲（）等基因型[6-7]。芽囊原蟲也可感染人類和多種動物，引發感染性腹瀉[8]。雖然一些研究表明在某些情況下芽囊原蟲可能對宿主的腸道微生物多樣性和健康產生積極影響，但它們也可以在某些情況下引發嚴重的疾病，特別是在免疫系統受損的人群中。芽囊原蟲主要有和基因型[9]。此外，多項研究表明，這3種原蟲在我國各地動物園圈養動物中有不同程度的流行。王利勤等[10]檢測成都、碧峰峽和貴陽動物園圈養動物微孢子蟲感染率為10.6%～34.5%，隱孢子蟲感染率為0.51%～16.7%。貴陽某動物園芽囊原蟲流行率為10.8%，鑒定出4個人獸共患亞型[11]；圈養大熊貓畢氏腸微孢子蟲感染率45.2%，有和兩種畢氏腸微孢子蟲基因型[12]。因此，動物園圈養動物可能是這3種腸道原蟲的重要儲存宿主，易造成水源污染和人獸共患原蟲病的傳播?！颈狙芯壳腥朦c】上述3種原蟲在南昌市動物園圈養動物中的流行情況及其基因型尚不清楚，有必要對其流行病學和分子特征進行調查分析，為制訂動物園人獸共患病傳播防控措施提供參考依據?！緮M解決的關鍵問題】本研究采集42份圈養動物糞便樣本，通過PCR擴增、測序及序列比對分析等方法對園內部分圈養動物腸道隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的感染情況進行分子流行病學調查。旨在為該動物園圈養動物腸道原蟲的流行病學提供基礎數據，為制訂動物園人獸共患病傳播防控措施提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品

于2022年7月在南昌市動物園采集非人靈長類、偶蹄類、奇蹄類、象類、有袋類、鳥類和食肉類動物共42份糞便樣本，置-20 ℃保存備用。動物均為圈養，由動物飼養員飼喂。

1.2 主要試劑與儀器

糞便DNA提取試劑盒，購自OMEGA公司；rDNA聚合酶、ExDNA聚合酶、dNTP Mixture、MgCl2、6×Loading Buffer、DL1000 DNA marker，均購自Takara公司；50×TAE，購自Solarbio公司；Nanodrop 2000核酸檢測儀，購自Thermo Scientific公司；臺式高速冷凍離心機，購自Eppendorf 公司；PCR儀和凝膠成像儀，均購自Bio-Rad公司。

1.3 DNA提取及引物合成

每份糞樣取約200 mg于滅菌2 mL離心管中，嚴格按照糞便DNA提取試劑盒說明書提取糞便樣品DNA；具體步驟為：將糞便樣本用無菌去離子水（ddH2O）勻漿后用60目的金屬過濾篩（孔徑約為0.42 mm）過濾去除糞便中較大的雜質，加入SP1 Buffer和蛋白酶K裂解糞便中的細胞以釋放DNA；經消化樣本中的蛋白質后，分離DNA；再通過加入BL buffer和無水乙醇使DNA在溶液中沉淀出來，并通過HiBind DNA吸附柱收集DNA，最后用乙醇洗滌DNA沉淀，去除雜質和余留的溶液，靜置吸附柱待乙醇完全揮發，用ddH2O洗脫DNA。所提取的糞便DNA采用Nanodrop 2000檢測DNA質量和濃度，測得濃度≥50 ng/μL用于后續的PCR擴增，分裝后置-20 ℃保存備用。參照文獻[13-16]提供的引物序列合成隱孢子蟲SSU rRNA、畢氏腸微孢子蟲及芽囊原蟲基因擴增引物。引物序列信息見表1，均由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

1.4 PCR擴增

以提取的糞便DNA為模板，采用巢式PCR方法擴增隱孢子蟲和畢氏腸微孢子蟲基因序列；常規PCR擴增芽囊原蟲基因片段。3種原蟲PCR擴增體系和程序具體如下：

隱孢子蟲PCR反應體系（總體積為25 μL）：DNA模板2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，rDNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 14.875 μL。第一輪擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；72 ℃再延伸10 min；第二輪擴增程序除退火溫度為58 ℃，其余條件同前[13,16]。畢氏腸微孢子蟲PCR擴增體系（總體積為25 μL）：DNA模板1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×Exbuffer 2.5 μL，ExDNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 15.375 μL。兩輪擴增程序均為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃再延伸10 min[13-14]。芽囊原蟲擴增總體積為25 μL，包括：DNA模板2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×Exbuffer 2.5 μL，ExDNA聚合酶0.25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 14.25 μL。擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃再延伸2 min[13,15]。1.2%的核酸凝膠電泳分析PCR擴增產物。

1.5 測序及序列分析

將陽性PCR產物送至擎科澤西生物技術有限公司進行測序；使用DNAStar 5.0分析原始序列，通過BLASTn在線程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）與GenBank數據庫中已發表的序列進行比對；利用ClustalX 1.83軟件進行多序列校對，以Mega7.0軟件中最大似然法構建系統進化樹，確定隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲及芽囊原蟲的基因型。

表1 3種腸道原蟲的PCR擴增引物

2 結果與分析

2.1 隱孢子蟲SSU rRNA基因PCR結果及基因型鑒定

巢式PCR擴增結果顯示：僅有1份矮馬樣品為陽性，經二輪PCR擴增出大小約830 bp片段，與預期大小相符（圖1）。測序成功后經序列比對分析判定為隱孢子蟲姬鼠基因型II（Csp.genotype II）（表2）。

1～5：糞便樣品；+：陽性對照；-：陰性對照；M：DL1 000核酸質量標準。

2.2 畢氏腸微孢子蟲ITS基因PCR擴增結果及基因型鑒定

巢式PCR擴增結果顯示，二輪PCR成功擴增出6份陽性樣品，其中包括長臂猿1份、金絲猴1份、博士猴1份、紅尾長尾猴1份以及羊駝2份，PCR片段大小約390 bp，與預期大小相符（圖2）。序列比對分析后鑒定出2種基因型，分別為（=4）和（=2）；系統進化分析表明均聚類于group 1（圖3），為人獸共患基因亞型。

1～6：糞便樣品；+：陽性對照；-：陰性對照；M：DL1 000核酸質量標準。

▲：南昌市動物園中鑒定的畢氏腸微孢子蟲基因型和宿主。

2.3 芽囊原蟲SSU rRNA基因PCR結果及基因型鑒定

PCR結果顯示：共有10份采自松鼠猴（=1）、黑白疣猴（=1）、博士猴（=1）、黑葉猴（=1）、金絲猴（=3）、羚羊（=2）和袋鼠（=1）的糞便樣品DNA成功擴增出目的條帶，大小約600 bp，與預期大小相符（圖4）。序列比對及系統進化分析鑒定到5種基因型，分別為：（=3），（=2），（=1），（=2），（=2）；其中和為人獸共患基因型（表2，圖5）。

1～10：糞便樣品；+：陽性對照；-：陰性對照；M：DL1 000核酸質量標準。

2.4 不同品種圈養動物感染率分析

結果表明：南昌市動物園中圈養動物總感染率為40.5%（17/42），其中隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲檢出率分別為2.4%（1/42）、14.3%（6/42）和23.8%（10/42），且存在畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲混合感染的情況。其中非人靈長類共檢測14份糞便樣本，其中有11份樣本檢測到原蟲感染，包括7個芽囊原蟲陽性樣本，經序列比對鑒定為（=2）、（=2）、（=1）和（=2），以及4個畢氏腸微孢子蟲陽性樣本，經序列鑒定為基因型（=4），其總陽性率為78.6%（11/14）；偶蹄類共檢測14份糞便樣本，其中有4份檢測到原蟲感染，包括2個芽囊原蟲陽性，經鑒定為型以及2個畢氏腸微孢子蟲陽性樣本，經序列比對鑒定為型，其總陽性率為28.6%（4/14）；奇蹄類共檢測4份糞便樣品，只有1份檢測到隱孢子蟲感染，經序列比對鑒定為姬鼠基因型II，陽性率為25%（1/4）；有袋類共檢測2份糞便樣本，其中有1份樣本檢測到芽囊原蟲陽性，經序列比對鑒定為型，其陽性率為50%（1/2）。在本研究中共檢測到17份陽性，不同類別動物中檢測陽性占比分別為：非人靈長類64.7%（11/17）、偶蹄類23.5%（4/17）、奇蹄類5.9%（1/17）、有袋類5.9%（1/17），其中非人靈長類的感染率顯著高于其他動物（<0.05）。

◆：南昌市動物園中鑒定的芽囊原蟲基因型和宿主。

3 結論與討論

根據上述研究結果，南昌市動物園中的圈養動物普遍存在腸道原蟲感染，總感染率為40.5%。本試驗結果表明了圈養動物中腸道原蟲感染的普遍性，可能成為人獸共患原蟲病的潛在感染源，對動物及人類的健康造成極大威脅，同時也建議加強動物園圈養動物的健康管理和防控措施。不同類別的動物中感染率有顯著的差異，非人靈長類的感染率最高，為64.7%。這可能與非人靈長類的生態習慣、社交行為、食物來源等有關。這些因素可能使非人靈長類更容易接觸到感染源，增加感染的機會。相比之下，偶蹄類的感染率為23.5%，奇蹄類和有袋類的感染率均為5.9%。這些差異可能與動物的生態環境、飲食習慣、免疫系統等因素有關。針對不同動物類別，應該制定相應的預防和管理策略，以降低感染風險。

本研究表明南昌市動物園圈養動物畢氏腸微孢子蟲的感染率為14.3%，低于鄭州動物園（15.8%）[17]，高于北京動物園（7.3%）[18]的感染率；此結果提供了不同地區動物園中畢氏腸微孢子蟲感染情況的比較，反映了不同地理環境和管理水平對于動物感染率的影響。值得注意的是，雖然南昌市動物園的感染率略高于北京動物園，但并不一定意味著南昌市動物園的動物健康狀況更差。不同動物園的采樣方法、樣本量、動物種類、動物密度、飼養環境以及防控措施等都可能會對感染率產生影響。本項研究的另一個重要發現是，在非人靈長類動物中檢測到了畢氏腸微孢子蟲基因型，以及在羊駝中檢測到基因型。這兩種基因型都被認為是人畜共患基因型，意味著它們不僅可以感染動物，還可能對人類造成健康風險。此外，南昌市動物園中的圈養動物隱孢子蟲的感染率為2.4%，高于鄭州動物園（1.6%）[17]，低于貴陽動物園（15.5%）和西寧動物園（70%）[19-20]感染率；這些感染差異可能受到多種因素的影響，包括動物種類、飼養環境、采樣方法、防控措施及地理位置、氣候條件以及不同動物園的管理水平等。同時，在矮馬中鑒定到了隱孢子蟲姬鼠基因型II（sp. apodemus genotype II），表明在矮馬中存在這種特定的隱孢子蟲亞型。而南昌市動物園中的動物芽囊原蟲的感染率為23.8%，明顯低于秦嶺動物園感染率（40.2%）[9]；說明國內不同動物園原蟲流行程度存在差異。但在南昌市動物園中非人靈長類動物中芽囊原蟲的感染率為64.7%，且存在芽囊原蟲和畢氏腸微孢子蟲混合感染。既往研究已證實芽囊原蟲是非人靈長類動物最易感的一種腸道寄生蟲[21]；Petráová等[22]調查魯邦多島國家公園中黑猩猩、黑臉綠猴和黑白疣猴芽囊原蟲感染率分別為71.4%、84.7%和83.7%。在我國多地也檢測到非人靈長類動物芽囊原蟲感染率較高，如秦嶺地區平均感染率達75.6%，廣州地區為16.7%～78.9%，西雙版納野生猴群檢出率為40%[9,23-24]。根據南昌市動物園的研究以及既往研究，芽囊原蟲感染在非人靈長類動物中普遍存在，且感染率相對較高。這表明芽囊原蟲在這類動物中的傳播較為廣泛。同時，目前報道的非人靈長類動物易感基因型有10個，包括～、、、、和；其中、和是優勢基因型[25-26]。本研究也檢測到、、和基因型，與國內外報道的研究結果基本一致[27-29]。此外，Yoshikawa等[25]認為基因型在恒河猴和人之間可能存在相互感染；珀斯動物園非人靈長類動物中分離出和基因型，其中型與飼養員分離株相似[30]；格但斯克動物園非人靈長類動物感染、、和基因型，飼養員感染和基因型，人和猴序列相同[29]；以上結果均表明動物可能是人芽囊原蟲病的重要感染源，存在直接傳播的可能性。

表2 南昌市動物園不同圈養動物3種腸道原蟲感染情況及基因型

以上發現表明圈養動物中腸道原蟲感染具有廣泛性和嚴重性。不同類別動物的感染率差異可能與生態習慣、飲食、社交行為等因素有關。研究還檢測到了多個人獸共患基因型的腸道原蟲，說明其多樣性和潛在的人獸共患感染風險。提示園內動物，包括金絲猴、黑白疣猴、長臂猿、袋鼠等為主要的原蟲儲存宿主，有潛在傳播人獸共患病原風險。鑒于3種腸道原蟲主要通過污染的水源和食物傳播，建議動物園進一步加強動物飼養管理，逐步改善動物的生活環境，確保飼養用水和食物的清潔；按時清理動物糞便和消毒圈舍，避免動物之間的相互傳播；定期監測飼養動物寄生蟲感染，制定合理的驅蟲方案，以控制園內寄生蟲病的流行及降低其人獸共患風險?？傊?，本研究為進一步開展圈養動物腸道原蟲流行病學調查奠定了基礎，也為南昌市動物園的飼養管理措施優化及飼養員和游客的健康防護提供了參考依據；對保護動物及公共衛生安全均有重要意義。

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Molecular Detection and Genotyping of Three Enteric Protozoa in Captive Animals from Nanchang Zoo

LIANG Weijia, CHEN Xiaoqing*

（School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China）

,andsp. are three common parasites, which inhabit in the intestines of humans, domestic animals, and wildlife, primarily causing diarrhea in human and animals. This experiment aimed to investigate the epidemiological status and identify their genotypes of three parasites among captive animals in Nanchang Zoo, and provide references for the prevention and treatment of intestinal parasitic diseases in wild animals.A total of 42 fecal samples were collected from captive animals including non-human primates, ungulates, perissodactyls, elephants, marsupials, birds, and carnivores in Nanchang Zoo. Total DNA was extracted from the fecal samples, and a PCR assay was employed to amplify the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene of, the internal transcribed spacer (ITS) region of, and the SSU rRNA gene ofsp.. Positive amplicons were sequenced, aligned, and subjected to phylogenetic analysis to determine the infection status and genotypes/subtypes of these three intestinal parasites.The results indicated that 17 out of 42 fecal samples were positive by PCR, with a total infection rate of 40.5% (17/42). The infection rates of,, andsp.were 2.4% (1/42), 14.3% (6/42), and 23.8% (10/42), respectively. Among the detected animals, the positivity rates were as follows: non-human primates 64.7% (11/17), ungulates 23.5% (4/17), perissodactyls 5.9% (1/17), and marsupials 5.9% (1/17). Furthermore, mixed infections ofandsp. were observed in non-human primates. Through sequence alignment and phylogenetic analysis, onegenotype (sp. apodemus genotype II) was identified in ponies, and twogenotypes (,) were identified in gibbons, golden snub-nosed monkeys, rhesus monkeys, red-tailed langurs, and alpacas. Fivesp. subtypes (,,,, and) were identified in squirrel monkeys, black-and-white colobus monkeys, rhesus monkeys, black leaf monkeys, golden snub-nosed monkeys, antelopes, and kangaroos. Notably, the genotypes,,, andare known as zoonotic genotypes.Captive animals in Nanchang Zoo were infected with,andsp.. The zoonotic genotypes are identified fromandsp., which have a potential transmission risk. This underscores the need for enhanced monitoring of intestinal protozoa in captive animals, and the implementation of deworming, disinfection, and preventive measures against zoonotic transmission within the zoo setting.

captive animal;;sp.;spp.; molecular detection; genotype

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.71

S852.61+1

A

2095-3704（2023）04-0469-09

2023-09-26

2023-11-06

國家自然科學基金項目（32202839）和江西省教育廳科技創新項目（GJJ180185）

梁瑋珈（2002—），女，主要從事動物寄生蟲學研究，2283078323@qq.com；*通信作者：陳小慶，講師，博士，chenxiaoqing2013jl@163.com。

梁瑋珈，陳小慶.南昌市動物園圈養動物3種腸道原蟲的分子檢測及基因型鑒定[J]. 生物災害科學, 2023, 46(4): 469-477.