烏蕨卵細胞發育的超微結構觀察

孫 銳, 包家茜, 曹建國, 戴錫玲,①, 衛 勤

(1. 上海師范大學生命科學學院, 上海 200234; 2. 上海市奉賢區農業技術推廣中心, 上海 201400)

卵細胞發育是蕨類植物有性生殖的重要階段。曹建國等[1-2]在水蕨〔Ceratopteristhalictroides(Linn.) Brongn.〕卵細胞發育過程中發現了受精孔,精子通過受精孔進入卵細胞,完成受精過程。隨后,學者們對部分薄囊蕨類的卵細胞發育過程進行了研究,結果表明:蕨類植物的卵細胞發育過程基本都經過幼卵、發育卵和成熟卵3個時期,但發育過程中的一些細節有所不同,如分離腔的形成方式、卵膜的有無和結構、受精孔的有無和位置以及是否形成核外突等。核心薄囊蕨類的卵細胞成熟后均能夠形成受精孔,且卵細胞表面出現較厚的卵膜[3-4];而在薄囊蕨類紫萁(OsmundajaponicaThunb.)的卵細胞發育過程中并未觀察到受精孔和典型的卵膜結構[5],在海金沙〔Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.〕的卵細胞發育過程中僅觀察到孔區,但未觀察到受精孔和卵膜[6]。從卵膜和受精孔的有無來看,海金沙可能是介于紫萁和核心薄囊蕨類之間的過渡種類。研究認為,蕨類植物的受精孔和卵膜的演化過程可能從無到有、從簡單到復雜[7],并且,成熟卵細胞產生核外突是蕨類植物有性生殖過程中較為進化的特征[3]。因此,研究不同蕨類植物卵細胞發育過程中上述結構的有無和特征差異對于完善蕨類植物分類系統及探究蕨類植物進化方向具有重要意義。

鱗始蕨科(Lindsaeaceae)是蕨類植物的一個特殊類群,在蕨類植物的分類歷史上長期歸屬于骨碎補科(Davalliaceae),在形態分類上曾作為碗蕨科(Dennstaedtiaceae)的一個亞科,而在分子系統(PPG I)中則被置于水龍骨科(Polyposiaceae)[8]。迄今為止,鱗始蕨科的演化地位仍未確定,亟待研究。

烏蕨〔Odontosoriachinensis(Linn.) J. Sm.〕是鱗始蕨科的代表種[9-10]。包家茜等[11]發現烏蕨頸卵器的發育需經過原始細胞、初生細胞、中央細胞、卵細胞形成及卵細胞逐漸發育成熟等過程,其分離腔形成采取由兩側向中央逐漸擴大的方式,并發現了受精孔和卵膜,但關于卵膜具體結構、受精孔位置、卵細胞有無核外突以及卵細胞內細胞器和物質變化等詳細特征均未知,因此,無法確定烏蕨的演化地位。鑒于此,筆者對烏蕨卵細胞發育過程進行了透射電鏡觀察,以期闡明烏蕨卵細胞發育的詳細過程及細胞學機制,并對烏蕨與其他蕨類植物的卵細胞發育特征進行比較,為鱗始蕨科植物的生殖生物學研究提供基礎資料,為鱗始蕨科植物演化地位確定提供有性生殖證據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試烏蕨孢子為黃褐色的成熟孢子,于2012年8月采自湖北省恩施市鳳凰山國家森林公園,并保存在4 ℃冰箱中。憑證標本保存于上海師范大學植物標本館,標本號為2012081501。

1.2 方法

1.2.1 孢子消毒及培養 采用陳倩等[12]的方法處理并培養孢子。具體操作如下:將成熟孢子用體積分數5%NaClO溶液消毒3 min;用無菌超純水清洗3次,每次3 min;隨后將孢子接種到改良的Knop’s固體培養基(瓊脂質量濃度10 g·L-1,pH 7.0)上,并置于ZRX-300E型智能人工氣候培養箱(杭州錢江儀器設備有限公司)中培養,培養條件為光照度2 000 lx、光照時間18 h·d-1、晝溫25 ℃、夜溫20 ℃。

1.2.2 卵細胞超微結構觀察 待頸卵器開始發育(即接種40～50 d),使用SMZ1500解剖鏡(日本Nikon公司)觀察配子體發育情況。選取不同發育階段的頸卵器,先用體積分數3%戊二醛溶液固定6 h,再用濃度0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗3次,每次30 min;然后,用體積分數2%鋨酸溶液固定2 h,再用上述磷酸緩沖液沖洗3次,每次20 min;接著,依次用體積分數50%、70%、90%、100%丙酮溶液脫水10 min;用Spurr’s樹脂進行滲透包埋,于73 ℃聚合9 h以上,得到包埋塊;經半薄切片(厚度500 nm)定位,選擇不同發育階段的卵細胞進行超微結構觀察;超薄切片(厚度70 nm)經飽和乙酸鈾溶液染色30 min及飽和檸檬酸鉛染色20 min后,使用Hitachi-600透射電鏡(日本Hitachi公司)觀察和拍照。

2 結果和分析

2.1 性器官形成

觀察發現,烏蕨孢子在接種后約12 d開始萌發,經絲狀體、片狀體階段(共約25 d)長出原葉體(圖版Ⅰ-1),再經15 d左右長出精子器和頸卵器,二者長在同一原葉體上且距離較近(圖版Ⅰ-2)。其中,頸卵器通常長在生長點下方,在配子體上呈放射狀分布,幼嫩頸卵器的頸部較長且直立,成熟頸卵器的頸部向基部彎曲;精子器呈圓球形,通常沿著中肋分布。

2.2 卵細胞發育過程

2.2.1 幼卵時期 烏蕨頸卵器原始細胞經多次分裂最終形成1個幼卵細胞、1個腹溝細胞和1個雙核頸溝細胞,且3個細胞緊貼著頸卵器周圍的壁細胞(圖版Ⅰ-3)。隨后,雙核頸溝細胞明顯伸長,胞內2個細胞核大、基本為圓形,且距離較近;細胞核周圍質體和囊泡豐富,質體內淀粉粒豐富,并存在片層結構;頸溝細胞通過胞間連絲與腹溝細胞相連(圖版Ⅰ-4)。腹溝細胞內高爾基體較多,與卵細胞通過發達的胞間連絲相連,且在胞間連絲附近的線粒體較為發達(圖版Ⅰ-5)。卵細胞位于頸卵器底部,近橢圓形,細胞核大,核仁明顯;細胞核周圍質體和囊泡豐富,囊泡內存在嗜鋨性物質,質體內含有淀粉粒和片層結構,線粒體發達,卵細胞與周圍壁細胞之間無胞間連絲,僅通過加厚的細胞壁相連(圖版Ⅰ-6)。

2.2.2 發育卵時期

2.2.2.1 分離腔和孔區的形成 在發育卵時期,卵細胞開始略向下凹陷,呈月牙形,且卵細胞與腹溝細胞連接處兩側的邊緣細胞壁加厚,胞間連絲逐漸消失,開始向下凹陷形成分離腔(圖版Ⅰ-7)。分離腔內存在絮狀物,腔下方的卵細胞內細胞器豐富,可見大量的線粒體、高爾基體及嗜鋨性囊泡(圖版Ⅰ-8)。隨后,分離腔由兩側向中間逐漸擴大,內部充滿不定形物質,中央具直徑2～3 μm的孔區,孔區連接腹溝細胞和卵細胞,分離腔下方聚有囊泡,且孔區囊泡較多。此時,腹溝細胞出現2個細胞核(圖版Ⅱ-1),頸溝細胞出現4個細胞核且縱向排列(圖版Ⅱ-2)。

隨著分離腔的形成,卵細胞繼續下陷,細胞核略有凸起和凹陷,細胞器開始發生改變,但初期變化不明顯,在細胞核上方聚有大量線粒體,且線粒體較大,在分離腔形成位置產生許多小泡。卵細胞下部和兩側的細胞器(如高爾基體、線粒體等)數量較多且分布較密集,質體內仍有淀粉粒存在,但主要分布在細胞核的周圍(圖版Ⅱ-3)。

2.2.2.2 卵膜和受精孔的形成 隨著分離腔從兩側向中間的凹陷擴大,腔內不定形物質不斷積累,導致卵細胞上方質膜的染色逐漸加深,特別是孔區的嗜鋨性明顯增強(圖版Ⅱ-4),并在卵細胞表面、分離腔下方產生網狀卵膜,孔區及分離腔內胞間連絲消失,孔區下方聚有囊泡,還存在部分高爾基體等膜性細胞器。卵膜形成后,分離腔內的不定形物質開始減少;卵細胞和細胞核變為碗形,分離腔上方、腹溝細胞下部加厚的細胞壁開始分解,卵細胞上方的質膜釋放出小泡(圖版Ⅱ-5)。卵膜形成時,孔區無卵膜覆蓋,僅有質膜,隨后卵細胞與腹溝細胞在孔區分離,形成受精孔。受精孔位于卵細胞中間,受精孔正下方有大量囊泡,受精孔附近的卵膜有2～3層囊泡堆疊。卵細胞內細胞核上部的內質網、高爾基體等膜性細胞器增加;有質體,但淀粉粒含量減少。腹溝細胞中囊泡數量增多,仍有部分質體存在,腹溝細胞開始退化(圖版Ⅱ-6)。

2.2.3 成熟卵時期 卵細胞成熟時,腹溝細胞與卵細胞在受精孔處完全分離,分離腔內的不定形物質逐漸消失,且未見到核外突(圖版Ⅱ-7);卵膜為網狀結構,卵膜下方的內質網和高爾基體明顯,存在大量高爾基小泡,線粒體發達,卵膜染色淺且具有大小不一的腔(圖版Ⅱ-8)。卵成熟后,腹溝細胞和頸溝細胞完全退化,內部物質排出,為精子進入卵細胞完成受精過程提供了通道;卵細胞與周圍壁細胞分離,卵細胞中間凹陷、兩端隆起,上部和邊緣仍有部分囊泡,內部細胞器已退化,淀粉粒消失(圖版Ⅱ-9)。

3 討論和結論

超微結構觀察結果表明:烏蕨卵細胞發育過程主要包括幼卵、發育卵和成熟卵3個時期,其中發育卵過程中分離腔和孔區的形成、卵膜和受精孔的形成,以及整個卵細胞發育過程中頸卵器的變化最為重要。

3.1 分離腔和孔區的形成

在發育卵時期,卵細胞與腹溝細胞之間形成分離腔,而分離腔的形成是蕨類植物發育卵階段的一個明顯特征。蕨類植物的分離腔有2種形成模式:一種是較為進化的方式,即隨著卵細胞的發育,分離腔由卵細胞與腹溝細胞連接的外側逐漸向中央擴大延伸,腹溝細胞和卵細胞之間起初有一處相連,使兩邊細胞形成漏斗狀,相連的位置即孔區,如水蕨[1-2]、闊鱗瘤蕨〔Phymatosorushainanensis(Noot.) S. G. Lu〕[3]等;另一種是較為原始的方式,即隨著腹溝細胞與卵細胞之間細胞壁的不斷加厚,胞間連絲被阻斷,在卵細胞上方,腹溝細胞與卵細胞的連接處幾乎同時分離,形成分離腔,如紫萁[5]。本研究發現,烏蕨的分離腔是從腹溝細胞和卵細胞連接的邊緣開始向內擴展,并在中央連接處形成孔區,胞間連絲在卵細胞發育近成熟后斷裂,據此認為烏蕨的分離腔形成方式較為進化。

3.2 卵膜和受精孔的形成

Bell等[13]首次發現了蕨類植物卵膜的存在,之后的研究發現,蕨類植物的卵膜是由分離腔內絮狀不定形物質沉積在卵細胞上表面,與嗜鋨性囊泡共同作用形成[3],并且,卵膜位于質膜外,主要由脂類物質組成[14]。本研究發現,烏蕨在卵細胞發育過程中形成網狀結構的卵膜,與系統演化上較為進化的種類闊鱗瘤蕨[3]、栗蕨〔Histiopterisincisa(Thunb.) J. Sm.〕[15]和華東安蕨〔Anisocampiumsheareri(Bak.) Ching〕[16]等的卵膜結構相同。研究發現,水蕨[17]和扇葉鐵線蕨(AdiantumflabellulatumLinn.)[18]等的卵膜是在卵細胞質膜內附著內質網而形成的多層結構,紫萁[5]沒有卵膜形成,而海金沙[6]在卵細胞發育過程中僅出現孔區,并未形成卵膜。Cao等[19]認為,卵膜從無到有、從簡單多層結構到復雜網狀結構,對于阻止蕨類植物多精受精、保護卵細胞可能均起到重要作用。因此,從卵膜結構來看,烏蕨表現出進化特性。

受精孔是精子進入卵細胞形成受精卵的重要通道。從受精孔的形成位置看,闊鱗瘤蕨[3]、華東安蕨[16]和扇葉鐵線蕨[18]等受精孔的形成均有腹溝細胞參與,與腹溝細胞相連的孔區位置并不在分離腔的中心,因而,形成的受精孔位于卵細胞上方偏離中心的位置,致使受精過程中精子對受精孔的直接撞擊可能會減少,從而阻止多精受精[3,15-19]。而金毛狗〔Cibotiumbarometz(Linn.) J. Sm.〕[4]和烏蕨的受精孔則位于卵細胞的中央,在受精孔位置上表現出原始特性。

3.3 頸卵器的發育

淀粉粒是頸卵器發育過程中變化最明顯的結構。比較發現,烏蕨頸卵器發育過程中淀粉粒的變化與紫萁[5]等蕨類植物相同,隨著頸卵器的發育進程,質體逐漸變大,淀粉粒含量也隨之增加[11]。卵細胞發育成熟后,中間凹陷、兩端隆起,呈現不規則的杯狀,質體內的淀粉粒逐漸變小,直至消失。然而,水蕨[1-2]等蕨類植物成熟卵細胞的質體內仍有淀粉粒存在。由此判斷,烏蕨在頸卵器發育上表現出原始特征。

Nishida等[20]在比較原始的同型孢子蕨類植物中觀察到含有2個頸溝細胞或2個腹溝細胞的異常頸卵器,而在系統分類上較為進化的真蕨類植物的頸卵器發育往往只形成1個雙核頸溝細胞和1個腹溝細胞。本研究發現,在烏蕨頸卵器發育過程中,雖然頸溝細胞和腹溝細胞各只有1個,但會出現腹溝細胞具有2個細胞核、頸溝細胞具有4個細胞核的現象。Cao等在桂皮紫萁(Osmundacinnamomeavar.asiaticaFernald)頸卵器發育過程中觀察到2個頸溝細胞同時存在[21];在問荊(EquisetumarvenseLinn.)頸卵器發育過程中也觀察到2個腹溝細胞同時存在的情況,但出現這種情況的幾率較小[22];在地錢(MarchantiapolymorphaLinn.)[23]頸卵器發育過程中會出現頸溝細胞分裂形成4個頸溝細胞的現象。進一步說明烏蕨在系統演化上表現出原始性。

核外突的產生被認為是性細胞發生過程中一種核質之間的交流[24]。卵細胞發育成熟時產生核外突是蕨類植物有性生殖中較為進化的特征,如闊鱗瘤蕨[3]和扇葉鐵線蕨[18]等在卵細胞近成熟時會產生囊狀核外突,且蕨類植物的核外突內部常具有嗜鋨性物質[3,18],華東安蕨的囊狀核外突具有大量褶皺[16]。然而,部分蕨類植物在卵細胞發育過程中不會產生核外突,如紫萁[5]和烏蕨。由此可見,從核外突上看,烏蕨屬于無核外突類型,在系統演化上較為原始。

3.4 結論

卵細胞發育觀察結果表明:烏蕨的分離腔形成方式為從兩邊向中間擴展,屬于較為進化的分離腔形成方式;烏蕨的卵膜具有網狀結構,屬于進化特征;烏蕨有受精孔,且受精孔位于卵細胞的中央,受精孔位置較為原始;卵細胞發育成熟時烏蕨的淀粉粒消失,卵細胞發育過程中腹溝細胞出現2個細胞核,頸溝細胞出現4個細胞核,且未出現核外突,均表現出原始性。綜上所述,從有性生殖角度看,烏蕨的演化地位較為進化,但有一定的原始性。因此,關于烏蕨的確切演化地位仍需結合多方面的研究證據進行全面的研究和探討。

圖版說明 Explanation of Plates

圖版Ⅰ1: 原葉體; 2: 頸卵器和精子器; 3: 頸卵器縱切面; 4: 雙核頸溝細胞; 5: 卵細胞和腹溝細胞間的胞間連絲; 6: 發育早期的卵細胞; 7: 分離腔形成; 8: 分離腔擴展.

PlateⅠ 1: Prothallus; 2: Archegonium and antheridium; 3: Longitudinal section of archegonium; 4: Neck canal cell with two nuclei; 5: Plasmodesmata between egg and ventral canal cell; 6: Egg at early development stage; 7: Formation of separation cavity; 8: Expansion of separation cavity.

圖版Ⅱ1: 具2個細胞核的腹溝細胞; 2: 具4個細胞核的頸溝細胞; 3: 卵細胞內的細胞核和細胞器; 4: 孔區; 5: 質膜釋放的小泡狀物(如箭頭所示); 6: 卵膜和受精孔形成; 7: 腹溝細胞和卵細胞分離; 8: 成熟卵的卵膜; 9: 成熟卵.

PlateⅡ 1: Ventral canal cell with two nuclei; 2: Neck canal cell with four nuclei; 3: Nucleus and organelles in egg; 4: Pore region; 5: Small vesicles released by plasma membrane (as shown by the arrows); 6: Formation of egg envelope and fertilization pore; 7: Separation of ventral canal cell and egg; 8: Egg envelope of mature egg; 9: Mature egg.

An: 精子器Antheridium; Ar: 頸卵器Archegonium; E: 卵細胞Egg; VCC: 腹溝細胞Ventral canal cell; NCC: 頸溝細胞Neck canal cell; N: 細胞核Nucleus; P: 質體Plastid; Pd: 胞間連絲Plasmodesmata; M: 線粒體Mitochondrion; W: 細胞壁Cell Wall; SC: 分離腔Separation cavity; G: 高爾基體Golgi body; Ve: 囊泡Vesicle; PR: 孔區Pore region; EE: 卵膜Egg envelope; FP: 受精孔Fertilization pore.

孫 銳, 等: 烏蕨卵細胞發育的超微結構觀察

圖版Ⅰ

SUN Rui, et al.: Ultrastructural observation on egg development of

Odontosoriachinensis

Plate Ⅰ

圖版說明見文末See the plate explanation at the end of the text

孫 銳, 等: 烏蕨卵細胞發育的超微結構觀察

圖版Ⅱ

SUN Rui, et al.: Ultrastructural observation on egg development of

Odontosoriachinensis

Plate Ⅱ

圖版說明見文末See the plate explanation at the end of the text