柞蠶滯育的研究進展

陳 欣 陳俊山 劉書禹 劉鳳全 徐 亮 諶苗苗 趙 賀 劉佩鋒

(遼寧省蠶業科學研究所,遼寧鳳城 118100)

柞蠶(Antheraeapernyi)是一種具有重要綜合價值的泌絲昆蟲,在分類學上屬于昆蟲綱、鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬。柞蠶業起源于中國,距今已有2000多年的發展歷史,是我國山區農民脫貧致富的特色優勢產業。當前全國柞蠶繭總產量約占世界總產量的 90%以上,柞蠶資源的綜合利用價值得以不斷開發,使得這項傳統產業具有更加廣闊的發展前景[1]。

滯育是昆蟲渡過不利時期的一種重要的生理過程,是由中樞神經系統和激素調控的適應性發育抑制事件,通常在不利環境到來之前開始發生,且不會隨不利環境的消失而立即結束,在昆蟲的生存、進化和繁殖等方面發揮著重要的作用[2]。柞蠶是完全變態昆蟲,在一生中要經歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個形態和生理機能完全不同的發育階段,以蛹態滯育,屬兼性滯育昆蟲,其每個世代的生活周期較長,一般最多為三化。在自然狀況下,柞蠶滯育的發生與解除,是適應環境所產生的遺傳性生理過程,柞蠶的遺傳性(化性及化性的穩定性)和環境因子(光照、溫度、營養等)均與滯育的發生及解除有密切關系[3]。

由于柞蠶產業具有巨大的社會效益,研究并掌握、調控其滯育機制,可實現柞蠶放養技術的改革、育種手段的創立以及營養價值的高效利用,可見研究利用柞蠶滯育機制,對于柞蠶業的可持續發展具有重要作用。

1 柞蠶滯育特性

1.1 滯育蟲態

研究表明,滯育在不同的昆蟲中所發生的蟲態也有所不同,如卵滯育、幼蟲滯育、蛹滯育和成蟲滯育[4]。柞蠶是蛹態滯育的昆蟲,佟秀云經過連續3年的觀察試驗,總結出柞蠶滯育蛹進入滯育期的重要標志是:蛹長與胃長之比接近100∶37,胃質濃縮變硬[5]。

1.2 滯育階段劃分

依據滯育在昆蟲個體間發生的狀況將其分為3個主要時期: 滯育前期,滯育期,滯育后期。根據生理生態特點,滯育前期進一步細分為誘導階段、準備階段2個亞時期,滯育期細分為啟動、維持、解除3個亞時相[2]。

1.2.1 滯育前期

誘導階段:以蛹滯育的昆蟲,感應刺激的敏感階段多在幼蟲期[6],柞蠶在蛹化前的最后兩個齡期即柞蠶的壯蠶期(4—5齡幼蟲稱為壯蠶)最為敏感[7],接受到特殊的環境信號,誘導其在后期注定進入滯育。

準備階段:在準備階段,柞蠶壯蠶期食量增加,生長到5齡末期,會在樹枝間徘徊,尋找適合營繭的場所,為進入滯育做準備。

1.2.2 滯育期

昆蟲滯育期的長短在不同種類、同種不同種群間、個體間均存在較大差異,從幾周至數月甚至長達1年以上[8],二化性柞蠶秋蛹的滯育期大約在1個月左右[9]。

啟動:在這階段,昆蟲個體新陳代謝受到抑制,形態發生停止[2]。二化性柞蠶秋蛹在化蛹后第30天呼吸強度迅速降至極低水平,耗氧量僅為化蛹后第28天的1/3左右,表明此時蛹體已進人滯育狀態[9]。

維持:在這個階段,昆蟲個體發育完全停滯,且不會隨環境變化而有所改變[2]。處于最低水平的呼吸強度已成為昆蟲滯育的主要生理特征[10],二化性柞蠶秋蛹呼吸強度從化蛹后第30天直到化蛹第53天一直維持在較低水平,形成整個呼吸曲線的谷底,并且此時呼吸強度受溫度影響較小,這充分表明蛹體在此階段已處于滯育狀態[9]。

解除:許多昆蟲滯育的解除需要嚴格的外界條件,滯育解除目前尚缺乏明顯的標志,需要進一步研究[11]。

1.2.3 滯育后期

滯育解除后,環境條件尚不能滿足直接發育的恢復,發育和新陳代謝仍為外源條件所抑制[2]。張義成的研究表明,二化性柞蠶秋蛹在化蛹后第56天呼吸強度迅速上升,此后至化蛹第153天始終處于較高水平,并隨溫度變化波動,表明此時已進入滯育后期階段,但由于正值冬季氣溫較低,故蛹體也不能正常發育[9]。

2 環境因子對柞蠶滯育的影響

在影響昆蟲的滯育的諸多外界環境因子中,光照和溫度是最主要因素,濕度和食料次之。其中以光周期最為重要[12]。

2.1 非生物因子的影響

2.1.1 光周期的影響

誘導昆蟲滯育的光周期反應類型分為長日照反應型、短日照反應型、短日照-長日照反應型和中間日長反應型4種[13]。利用光周期反應可以確定臨界光周期,當光照時長低于或高于臨界光周期時,就會誘導昆蟲滯育的發生[14]。柞蠶幼蟲期,特別是壯蠶期光照的長短可直接影響滯育的發生與否,關于柞蠶滯育臨界光周期前人做了許多相關試驗,試驗結果較為一致,認為柞蠶為短日照反應型,引起其滯育的臨界光周期為14 h左右,且確認腦部是柞蠶幼蟲對于光線的直接感受器[3]。

柞蠶壯蠶期光照是引起柞蠶滯育的首要原因,但是處于臨界中間光照條件下,卵期光照也發揮作用。我國柞蠶的化性以北緯35°為分界線,北緯35°以北地區為二化性地區,以南地區為一化性地區,在一化性和二化性之間的過渡區域,為柞蠶化性不穩定地帶[1]。在這個不穩定地帶,研究發現柞蠶卵期感光是發生滯育的主要原因,但與壯蠶期短日照滯育型不同,柞蠶卵在短光照下不滯育,長光照引發滯育[15],同時試驗證實,柞蠶卵的光照敏感時期為胚胎發育在單眼著色至孵化前[16]。

光周期不僅顯著影響柞蠶滯育的誘導,也影響滯育的維持和解除,相關實驗證明,短光照使蛹體維持正常滯育,利用長光照可以解除滯育,且不同化性品種解除滯育時所需光照處理時間有所差異[17,18],可見柞蠶的遺傳性(化性及化性的穩定性)對滯育的發生與解除同樣關系密切。而且,研究證明,腦部是柞蠶滯育蛹接受光刺激的器官[19]。

2.1.2 溫度的影響

溫度對滯育的影響僅次于光周期,高溫對滯育產生抑制作用[7],低溫有利于維持滯育[20],且低溫是蛹滯育解除蛹滯育的必要條件,未經低溫處理的滯育蛹,利用光周期無法解除滯育,且與光照感受器官相同,接受溫度感應的器官也在柞蠶腦部[20]。

2.2 生物因子的影響

影響柞蠶滯育的生物因子主要是食料因子。相關研究表明,柞蠶滯育蛹的產生與否,隨幼蟲營養期積累的多少而定,積累多的蛹滯育,積累少的蛹不滯育,而營養積累的多少,又取決于壯蠶期每天攝食時間的長短以及柞葉柔嫩程度,而攝食時間長短以及柞葉柔嫩程度又與環境條件密切相關[21],可見食料因子是作為光周期和溫度反應的調節因子對昆蟲滯育發生影響的。

3 柞蠶滯育的生理生化基礎

3.1 滯育的激素調控作用

目前對昆蟲滯育調控機制的闡明主要從神經內分泌系統的激素調節層面,其調控機理因滯育蟲態不同也各不相同。蛹滯育主要發生在鱗翅目昆蟲和雙翅目昆蟲中,由腦、前胸腺、咽側體三者相互作用,參與調控的激素最主要是促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone, PTTH)、蛻皮激素(Molting hormone, MH)[22,23]。

在柞蠶的滯育誘導過程中,當柞蠶幼蟲腦接收到能引起滯育的環境信號以后,蛹腦的PTTH的合成和釋放就減少,從而使前胸腺停止分泌MH,使得蛹的發育停滯,從此進入了滯育期[24]。

在柞蠶蛹解除滯育過程中,由腦合成的PTTH增加,促使前胸腺合成分泌MH,MH先后和一些受體復合物結合,誘導一些早期基因的轉錄,這些基因的轉錄激活了一系列參與蛻皮和變態過程[25],蛹期血淋巴中MH滴度下降后,促使由腦合成釋放羽化激素(Eclosion hormone, EH),來調節氣門腺蛻殼啟動激素(Ecdysis triggering hormone, ETH)的分泌,最終在這一系列的激素調控下完成蛻皮及羽化過程[26]。

3.2 滯育的營養物質儲備與代謝

柞蠶體內的物質代謝,是蛹體滯育與否的物質基礎,柞蠶唯一攝取食物的時期為幼蟲期,其中五齡期占取食量的80%以上[27],因此五齡幼蟲期奠定了柞蠶蛹滯育的物質基礎。

3.2.1 脂類物質代謝

滯育性柞蠶體內游離脂肪的含量在五齡盛食期以后顯著高于非滯育性柞蠶,而游離脂肪是可利用的能源物質,說明滯育性柞蠶體內大量積累游離脂肪是為了滯育做準備[27]。

3.2.2 糖類物質代謝

目前滯育昆蟲的糖原代謝途徑主要分為糖醇積累型和海藻糖積累型這2種類型,因昆蟲種類而異[28]。柞蠶屬于海藻糖積累型,滯育性柞蠶自五齡盛食期開始體內大量積累脂肪體糖原,進入滯育后糖原轉化為海藻糖,滯育解除后海藻糖又轉化為糖原。表明蛹體脂肪體糖原與血淋巴海藻糖之間互相轉化,且這種轉化受溫度影響,接觸低溫越早,溫度越低,海藻糖積累速度越快,積累量越高,峰期持續時間也越長,可以加深滯育強度,有利于維持滯育[20]。

排除標準：①斜視（顯斜視）；②任何眼部器質性疾病，如白內障、上瞼下垂等；③伴有顱內疾??；④眼部手術史。

3.2.3 氨基酸變化

柞蠶滯育蛹體內共有16種氨基酸,其中脯氨酸含量最高[29],進一步說明脯氨酸與昆蟲耐寒性相關[30]。柞蠶滯育蛹血淋巴中的游離氨基酸含量隨著滯育的解除而逐漸降低,說明柞蠶蛹解除滯育后發育至成蟲階段,需要消耗大量的游離氨基酸,可見游離氨基酸作為代謝的中間產物,用于滯育期間和滯育解除后昆蟲的合成代謝與分解代謝[31]。

3.2.4 蛋白質變化

蛋白質含量與昆蟲滯育的誘導和解除密切相關[32],滯育性柞蠶體內蛋白質的增加在五齡盛食期以后顯著多于非滯育性柞蠶[33],說明柞蠶體內蛋白質的變化與發生滯育相關。

此外,滯育昆蟲在進入滯育前還會積累一種特殊的貯藏蛋白來存貯氨基酸,這些蛋白在滯育期間持續合成,維持較高濃度,且滯育終止后即消失,它被認為與滯育的發生有關,因而被稱為滯育關聯蛋白(DAP)[34,35]。目前已在多種昆蟲滯育蟲態的血淋巴或脂肪體中發現DAP的存在,柞蠶體內同樣有DAP的存在,但是其具體作用機制還不明確[36,37]。

4 柞蠶滯育調控的分子機制

4.1 促前胸腺激素基因克隆及表達

李慧君克隆了柞蠶促前胸腺激素基因ApPTTH,通過表達分析,得到一些重要發現[24]:①在柞蠶5齡早期幼蟲的腦組織中檢測到ApPTTH的表達,這與ApPTTH參與滯育的誘導有關,在其卵巢組織也檢測到ApPTTH的表達,但其表達機理有待研究;②qRT-PCR實驗發現,ApPTTH的表達量在滯育過程中變化不大,而在解除滯育要進入成蟲發育時ApPTTH的表達量升高而達到最大值,說明ApPTTH的表達及合成對滯育蛹解除滯育及成蟲發育至羽化具有有重要作用。

4.2 蛻皮激素受體相關基因克隆及表達

在柞蠶中已經克隆了兩個蛻皮激素受體相關基因,ApEcRB1和ApUSP1。對這兩個基因的qRT-PCR實驗表明,柞蠶幼蟲蛻皮期間,ApEcRB1呈上調表達,可見ApEcRB1在此期間參與蛻皮激素信號的接收,2個基因在化蛹期均呈現大幅度上調表達的規律,反映出這兩個基因在柞蠶變態發育中發揮作用;利用蛻皮激素誘導滯育蛹羽化的試驗中,發現滯育蛹中2個基因的表達量在注射20-羥基蛻皮甾酮(20E)后均明顯下降,在羽化前期表達量開始上升,且在蛹發育16 d(羽化前1 d)達最高,說明這 2個蛻皮激素受體基因的表達與羽化過程中的形態變化有關聯,可能參與了組織器官的形成[38]。

4.3 代謝調節的分子機制

昆蟲滯育機制的研究表明其主要受激素調節,但是這些激素所涉及的信號通路,包括昆蟲進入滯育前的生理準備,滯育維持需要的生理生化反應及滯育的打破,都需要相關酶類和蛋白質的參與和協作。

4.2.1 海藻糖酶參與的調節機制

作為昆蟲的血糖,海藻糖(trehalose)含量及海藻糖酶(trehalase,Treh)活力變化與昆蟲滯育、滯育的解除和發育密切相關[39]。為了利用海藻糖,昆蟲的許多組織擁有海藻糖酶,通過基因克隆、蛋白純化和酶活性測定結果發現昆蟲存在兩種不同類型海藻糖酶基因( Trehalase,Treh)。目前在柞蠶上已經克隆獲得了兩個可溶性海藻糖酶基因(Treh1):ApTreh1A、ApTreh1B,和一個具有跨膜結構的膜結合型海藻糖酶基因(Treh2):ApTreh2。通過表達分析發現,各組織中ApTreh2比ApTreh1的分布更廣且表達量更高。qRT-PCR實驗表明,長光照處理后,柞蠶蛹脂肪體中ApTreh1A和ApTreh1B在21d時表達量都快速升高,ApTreh2 伴隨滯育的解除表達量逐漸升高,在28 d 時達到峰值,42d 時再次出現一個小高峰。以上實驗結果表明3個基因在柞蠶光照解除滯育及發育過程中均發揮重要作用,而且因在柞蠶滯育和發育過程中,各組織糖代謝途徑有所不同,3個基因的調控功能也不相同[40]。

4.2.2 柞蠶滯育關聯蛋白參與的調節機制

目前已在NCBI檢索獲得了兩個柞蠶滯育關聯蛋白(DAP)基因的序列,柞蠶滯育關聯蛋白基因2(diapause-associated protein 2,dap2),和柞蠶滯育關聯蛋白3(diapause-associated protein 2,DAP3)。序列比對分析顯示,DAP2與煙草天蛾和家蠶眼色素結合蛋白(OBP)同源性可達到56%和57%,其編碼基因在滯育蛹中的轉錄及表達水平最高,推測其可能參與柞蠶滯育活動中,但是具體的作用機制還不明確[36];DAP3基因主要在蛹期表達,并隨著滯育進程逐漸降低,通過與與家蠶滯育時鐘蛋白TIME-EA4的空間結構比對,表明兩者具有高同源性,推測其在滯育解除過程中可能發揮類似的功能[37]。

5 滯育在柞蠶生產中的應用

由于柞蠶的滯育對生產影響較大,還必須進行深入研究,掌握其機制,在生產中加以調節控制,最大限度地利用自然資源,實現柞蠶生產的優質高產。滯育在柞蠶生產應用中的作用主要體現在以下三個方面。

一是改革柞蠶的放養系統,創立“二化一放”放養技術和“一化二放”放養技術。這就需要充分掌握柞蠶的滯育誘導、維持和解除的技術方法,適時誘導柞蠶滯育,適當加深其滯育強度,從而延長柞蠶種繭的貯藏時期,在因為無霜期短而無法完成春秋兩季柞蠶放養的二化性地區實現“二化一放”放養技術[41],以及創建人工解除柞蠶滯育蛹的方法,適時打破其滯育,在溫度適宜的一化性蠶區增加一次秋季放養實現“一化二放”放養技術[42,43],從而充分利用各化性地區的氣候和豐富的柞樹資源。

二是選育柞蠶新品種,建立化性的綜合條件逆向選擇技術。這就需要研究柞蠶化性的遺傳規律,同時充分了解并利用季節、地點、光照、溫度、葉質等最不利于柞蠶滯育的環境因子,從而選育在二化性地區能夠高滯育率的、化性穩定的一化性品種[44]。

三是柞蠶營養價值的高效利用。已有研究表明,滯育蛹和輕度發育蛹培育的蠶蛹蟲草的出草率明顯高于用解除滯育蛹培育蠶蛹蟲草的出草率,且生產出的蛹蟲草營養價值更高[45],這與柞蠶滯育蛹體內營養物質積累有關,因此研究清楚柞蠶滯育的生理生化基礎,對柞蠶營養價值的應用同樣非常重要。

6 小結與展望

柞蠶是以蛹滯育的經濟昆蟲,充分了解掌握柞蠶的滯育特性、滯育的影響因子及滯育調控機制等,能夠進一步補充豐富柞蠶的發育生物學和生理學研究,為實現柞蠶的滯育調控提供理論基礎,最終為實際生產提供技術支撐。

現在對于柞蠶的滯育研究已經基本明確了包括滯育蟲態特征、滯育階段劃分、滯育發生條件、滯育解除手段在內的諸多科學問題,但是對于生理代謝及分子調控機制還缺乏系統、深入的研究解釋,相信未來在這方面的研究會有所突破。