甘蔗渣多酚的超聲輔助提取工藝優化研究

張展鵬,慎 璐,李 燦*

齊魯工業大學(山東省科學院) a.基輔學院;b.生物工程學院,山東 濟南 250353

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)屬于禾本科(Poaceae),喜濕熱,喜光,在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區均有分布,是重要的糖料原產品和全世界第二大生物能源作物[1-3],我國廣西貴族自治區的甘蔗種植面積居國內之首,占全國六成以上[4]。甘蔗是我國重要的經濟作物,生產數量在世界范圍內可以排進前三[5]。近年來,國內外許多學者對甘蔗多酚研究的數據顯示,甘蔗多酚具有良好的抗氧化、抑制血糖、降低血脂、抑菌、抗腫瘤等功效[6-8]。侯小濤等[9]對甘蔗多酚進行了體外抗菌實驗,研究結果發現,甘蔗多酚對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌都有著一定的抑制作用,這為甘蔗多酚的抑菌藥用價值提供了基礎。廖澤勇[10]運用MTT法檢測后,計算甘蔗葉黃酮類物質對腫瘤細胞的生長抑制率,實驗顯示葉黃酮類物質對六種腫瘤細胞均有一定的抑制作用,其中對Hela和Caco-2腫瘤細胞的抑制效果尤為明顯。

傳統工藝大多使用有機溶劑進行提取,但是有機溶劑的消耗量大,提取工藝成本高,對環境也會造成危害[11-13]。超聲輔助提取技術作為一種新型的提取方法,基本原理是利用超聲波在提取液中引起的空化現象,加速提取物中目標成分的釋放和轉移[14-15]。相比于傳統的提取方法,超聲輔助提取多酚技術具有操作簡便、提取效率高、提取時間短、產品質量好等優點[16]。本文利用單因素試驗與響應面法結合,研究超聲波技術輔助甘蔗多酚的提取,旨在優化甘蔗多酚提取工藝,提高多酚的提取率和純度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甘蔗渣(烘干粉碎備用);無水乙醇;植物總酚(TP)含量檢測試劑盒(索萊寶生化試劑盒事業部);酶標儀(BioTek Instruments,Inc.);數顯恒溫水浴鍋(金壇市精達儀器制造有限公司);微型離心機(美國Andy Bio公司);超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

使用植物總酚(TP)含量檢測試劑盒進行沒食子酸的標準曲線繪制。(標準品5 mg沒食子酸、試劑一Folin-Ciocalteu試劑、試劑二Na2CO3溶液)

取不同質量濃度的沒食子酸標準溶液(0.625、0.156、0.078、0.039、0.020 mg·mL-1)50 μL,依次加入250 μL試劑一,渦旋混勻2 min后,各加入250 μL試劑二和450 μL蒸餾水,渦旋混勻后靜置10 min,于760 nm處測定吸光度。建立標準曲線,如圖1所示,求得回歸方程y=3.946 2x+0.008 4,R2=0.995 6。

1.2.2 甘蔗多酚提取量的測定

甘蔗渣樣品烘干稱重,粉碎,過50目篩(微孔直徑280 μm),稱取1 g,加入適量乙醇溶液,使用超聲細胞粉碎機進行輔助提取,一段時間后,離心取上清液待測。根據測沒食子酸標準曲線得回歸方程,計算樣本質量濃度y(mg·mL-1),最終得到甘蔗多酚的質量分數。

多酚質量分數=y×提取液體積÷樣本質量。

1.2.3 單因素試驗

取30 g經粉碎過50目篩(微孔直徑280 μm)的甘蔗粉末,選擇合適的液料比,加入一定濃度的乙醇溶液,在特定的水浴溫度和超聲功率下,對其進行一定時間的超聲輔助提取。提取結束后放入離心機12 000 r/min,25 ℃,離心10 min,取上清液,待測。探究不同的乙醇體積分數(35%、45%、55%、65%、75%)、不同的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、不同超聲時間(15、25、35、45、55、65 min)、不同水浴溫度(30、40、50、60、70 ℃)和不同超聲功率(75、85、95、105、115 W)對甘蔗多酚提取量的影響,其中將各因素初始水平固定為乙醇體積分數45%、液料比10∶1 (mL·g-1)、水浴溫度45 ℃、超聲時間25 min、超聲功率95 W。

1.2.4 響應面試驗

根據各個單因素試驗對甘蔗多酚產量的不同影響,使用Design-Expert13軟件,響應面Box-Benhnken試驗設計原理設計四因素三水平共29組響應面對實驗進行分析,從而得到甘蔗多酚提取的最佳工藝。響應面分析因素表如表1所示。

表1 Box-Benhnken試驗設計表

2 結果與分析

2.1 影響甘蔗多酚提取的單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對多酚提取量的影響

水浴溫度固定45 ℃,液料比10∶1(mL·g-1),在95 W的超聲功率下,將乙醇體積分數作為單變量,分別取值35%、45%、55%、65%、75%,提取25 min。結果如圖2所示。

隨著乙醇體積分數的增加,甘蔗多酚提取量先增加后減少。在乙醇體積分數55%時甘蔗多酚提取量最高,為8.12 mg·g-1;乙醇體積分數為35%時甘蔗多酚提取量最低,為6.37 mg·g-1。乙醇作為溶劑可以有效的溶解多酚類的化合物。在低濃度下,乙醇體積分數越高,甘蔗多酚的萃取效率越高,但在一定濃度以上,乙醇的萃取效率受到其他因素的制約,如乙醇分子的空間排列和分布密度等,甘蔗多酚的萃取效率隨著乙醇體積分數的增加而逐漸降低[17]。因此,提取甘蔗多酚工藝的最佳乙醇體積分數為55%。

圖2 乙醇體積分數對甘蔗多酚提取的影響

2.1.2 液料比對多酚提取量的影響

水浴溫度固定45 ℃,乙醇體積分數55%,在95 W的超聲功率下,將液料比作為單因素變量,分別在10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL·g-1)的條件下,提取25 min,結果如圖3所示。

當液料比低于15∶1(mL·g-1)時,隨著提取液的增多,甘蔗多酚的提取率大幅度提高,在液料比數值較低時,其變化對甘蔗多酚的提取率影響較大。較低的液料比下,甘蔗粉末不能充分地與提取液接觸混勻,減少了甘蔗多酚的溶出,合適的液料比可以促進多酚的轉移和溶解,從而增加多酚的提取量。然而,過高的液料比會增加溶劑的使用,對產品的分離純化造成影響,有機溶劑的殘留使多酚應用受限,也會導致成本過高。液料比超過15∶1(mL·g-1)后,甘蔗多酚的提取率開始逐漸下降,當液料比到達25∶1(mL·g-1)后,對于甘蔗多酚的提取率影響十分微弱。因此,甘蔗多酚最佳提取液料比為15∶1(mL·g-1)。

圖3 液料比對甘蔗多酚提取的影響

2.1.3 超聲時間對多酚提取量的影響

水浴溫度固定45 ℃,乙醇體積分數55%,液料比為15∶1(mL·g-1),在95 W的超聲功率下,將超聲時間作為單因素變量,分別超聲15、25、35、45、55、65 min,進行提取,結果如圖4所示。

從超聲時間15 min開始,甘蔗多酚的提取量逐步增加,一直到35 min時達到峰值為7.05 mg·g-1,適當的超聲時間可以增加多酚與溶劑之間的物質傳遞速率,促進多酚的提取。而后隨著時間的增加,甘蔗多酚的提取量開始下降,在65 min時最低為4.74 mg·g-1。在35 min時甘蔗多酚的提取已經達到飽和,繼續進行超聲,超聲波能量的累積和吸收會引起提取液中溫度的升高、壓力的變化等多種復雜作用,對甘蔗多酚的穩定性產生影響,致使甘蔗多酚降解。過長的時間也會導致甘蔗多酚的氧化,最終產量有所損失。這些因素相互作用造成甘蔗多酚提取量的變化,在使用超聲波技術輔助提取時,選取超聲時間要考慮多酚的穩定性,避免過度超聲造成不利影響。因此,甘蔗多酚提取工藝的最佳提取時間為35 min。

圖4 時間對甘蔗多酚提取的影響

2.1.4 水浴溫度對甘蔗多酚提取的影響

乙醇體積分數55%,液料比15∶1(mL·g-1),在95 W的超聲功率下,將水浴溫度作為單因素變量,分別在30、40、50、60、70 ℃的溫度下,提取35 min,結果如圖5所示。

隨著溫度的升高,甘蔗多酚的提取量增加明顯。因為溫度的升高可以促進乙醇分子與甘蔗中多酚分子之間的相互作用,從而提高多酚分子的溶解度和滲透性,有利于多酚的溶解和擴散[18]。在50 ℃時,提取量達到了最大值為10.84 mg·g-1。但是在超過50 ℃之后,溫度提高,多酚的提取率卻開始下降,降低幅度相較于之前上升幅度顯著減小,在長時間的高溫下,多酚受熱發生反應生成其他物質[19]。因此,甘蔗多酚提取工藝的最佳提取溫度為50 ℃。

2.1.5 超聲功率對多酚提取量的影響

水浴溫度50 ℃,乙醇體積分數55%,液料比15∶1(mL·g-1),將超聲功率作為單因素變量,分別在75、85、95、105、115 W的功率下,提取35 min,結果如圖6所示。

甘蔗多酚的提取量隨著超聲功率的增大而增多,在105 W處達到最高點,多酚提取量為17.35 mg·g-1,繼續增大超聲功率,多酚提取量開始下降。超聲波作用可以引起植物細胞壁的物理破碎,釋放多酚類化合物。同時細胞液內部會產生劇烈的液流和振動,增加了料液間的質量傳遞,促進了甘蔗多酚的溶解和擴散,在空化作用下甘蔗多酚更快的進入溶劑[20-21],導致甘蔗多酚的提取量增加。但是當超聲功率過大時,反而會對物質產生破壞[22-23],影響甘蔗多酚的提取效率。超聲功率的選擇應根據具體的提取物質、設備性能和工藝要求進行優化和調整。過低的功率可能導致提取效果不理想,而過高的功率可能導致不良反應或能源浪費。在實際操作中,需要進行實驗,確定最佳的超聲功率條件以實現最佳的多酚提取效果。因此,甘蔗多酚提取工藝的最佳超聲功率為105 W。

圖6 超聲功率對甘蔗多酚提取的影響

2.2 響應面優化

2.2.1 正交試驗結果分析

表2為29組試驗的結果,對數據進行分析整理,得回歸模型方程為:Y=17.88+0.809 0A-3.17B+0.300 9C-0.197 3D-0.858 3AB+0.458 7AC+0.014 8AD+0.429 1BC+0.269 1BD+0.222 0CD-5.78A2-1.88B2-3.31C2-2.27D2

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 方差分析

表3(續)

圖7所示為使用Design-Expert軟件,通過對上述回歸方程模型進行分析,所得的各個因素交互影響甘蔗多酚產量的三維響應面圖。在響應面的分析中,曲面坡度和等高線是兩個非常重要的指標,用于反映因素的影響程度和交互作用的強度。曲面坡度是指響應面模型的曲率程度,即響應變量在不同因素取值下的敏感程度。如果曲面坡度越陡峭,說明響應變量對該因素的變化越敏感,該因素對響應變量的影響越大。相反,如果曲面坡度越平緩,則說明該因素對響應變量的影響越小。等高線則用于反映兩個因素之間的交互作用程度。如果等高線呈橢圓形且曲線密集,則表明兩個因素之間的交互作用對響應變量的影響顯著。反之,如果等高線呈圓形且曲線稀疏,則說明兩個因素之間的交互作用對響應變量的影響不顯著。如圖7所示,交互項CD(水浴溫度與超聲功率)的等高線近似于圓形,交互項BC(液料比與溫度)和交互項BD(液料比與超聲功率)的響應面坡度較緩,說明其響應量變化較小,交互作用均不顯著,這與上述方差分析的結果一致。

2.2.2 響應面優化最佳工藝驗證

使用響應面軟件對甘蔗多酚提取工藝的最佳條件進行預測,得最適條件為乙醇體積分數58.215 8%、液料比10.853 9∶1(mL·g-1)、水浴溫度49.334 ℃、超聲功率103.075 W。在此條件之下,甘蔗多酚提取量理想值為19.097 4 mg·g-1。將預測數據可行化,即乙醇體積分數58%、液料比11∶1(mL·g-1)、水浴溫度49 ℃、超聲功率103 W,在此條件下做三次平行試驗,進行驗證,得到甘蔗多酚提取質量的平均值為18.87 mg·g-1,與預測值接近,表明該響應面模型真實、準確、有效。

3 結 論

我國的甘蔗資源充足,價格低廉,甘蔗渣作為甘蔗加工過程中的副產品,鮮有科研人員進行研究?，F有的研究結果表明,甘蔗多酚在調節免疫和控制血糖方面具有良好功效,值得進一步開發利用。在本研究中,經單因素試驗和響應面設計,使甘蔗多酚的提取工藝得到優化,影響甘蔗多酚提取量的4種主要因素影響力由大到小分別為:液料比(B)、乙醇體積分數(A)、水浴溫度(C)、超聲功率(D)。優化后的方案為乙醇體積分數58%、液料比11∶1(mL·g-1)、水浴溫度49 ℃、超聲功率103 W,超聲時間35 min,測得甘蔗多酚產量18.87 mg·g-1。相比較于傳統提取方法,該方法提取效率高,顯著地縮短了提取周期,并且操作簡單,易實現大規模生產,為甘蔗多酚的提取提供了依據。

根據報道顯示,不同品種甘蔗的甘蔗多酚存在差異,個別品種的甘蔗多酚產量要明顯高于其他。導致這種差異的因素有很多,例如甘蔗生長環境的不同,基因品種不同,生長時間不同等。因此需要更多的研究來確定這些因素對甘蔗多酚質量分數的影響,并開發出適當的種植和加工方法來提高甘蔗多酚的含量,有助于降低成本,提高生產效率,從而促進相關產業的發展。