應用DNA 條形碼技術對口岸截獲魚翅物種進行鑒定與分析

虞惠貞 趙相鵬 裘慧 張明哲 尹文秀 張荃 沈旭芳 李炎錕 吳姍*

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院 浙江杭州 310016；2.中國海關科學技術研究中心）

0 引言

魚翅，主要為軟骨魚系鯊魚翅和某些鰩魚翅[1]，取自鯊魚和鰩魚的背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭等，富含大量的膠原蛋白， 具有提高免疫力和美容養顏等功效，深受消費者喜愛[2]。據報道，亞洲的魚翅年進口量高達20 000 t[3]，香港是全球魚翅貿易中心[4-5]，市售魚翅主要為大青鯊、灰鯖鯊、鐮狀真鯊、長尾鯊等10 多種鯊魚和鰩魚[6-8]。鯊魚和鰩魚在全球范圍內被捕撈，且因其固有的生物學特性，即生長速度慢、繁殖力低、成熟期較晚和妊娠期相對較長[9-10]，導致生產力相對較低， 許多鯊魚和鰩魚種群被認為受到威脅或瀕臨滅絕。在國際自然保護聯盟（IUCN）評估的1 038 種鯊魚和鰩魚紅色名錄中， 約20%受威脅物種被歸類為極度瀕危、瀕?；蛞孜Ｎ锓N，另有12%被歸類為近危物種[11]。 此外，《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（CITES）附錄Ⅱ列出了真鯊科（2023 年11 月25 日起生效）、長尾鯊屬、雙髻鯊科、藍吻犁頭鰩屬、圓犁頭鰩科、犁頭鰩科所有種和其他6 種鯊魚和鰩魚[12]。

因此， 必須通過出口許可制度控制其國際貿易（CITES，2023），為嚴格執行《瀕危野生動植物種國際貿易公約》，必須采用鑒定技術在全球鯊魚產品交易中準確識別出這些物種。然而，由于鯊魚和鰩魚的種類較多，親緣關系和形態特征相似，不易區分，給海關監管工作帶來了一定的難度， 故建立快速精準的魚翅鑒定技術對打擊魚翅走私、 保護海洋生物多樣性具有重要意義。

目前，魚翅的鑒定方法主要包括形態學鑒定、理化鑒定和分子生物學鑒定。完整的、未經處理的鯊魚標本通?？梢杂蓪I分類學家使用形態學指標在物種層面上進行鑒定[13]。通過非線性復合濾波器（傅立葉變換）對完整的干鯊魚背鰭圖片進行處理，可高效地識別部分魚翅物種[14]。然而，這些產品類別是特定的，通常不適用于分類物種鑒定或物種組成的確定。穩定同位素[15]、紅外光譜[16]和電子顯微鏡分析[17]方法也常被用于干魚翅的鑒定， 但是這些方法無法準確判定魚翅的物種來源。

隨著分子生物學技術的發展， 研究人員已經開發了許多基于DNA 的分析方法來識別鯊魚和鰩魚物種。 這些方法主要基于聚合酶鏈式反應（PCR）用于擴增通用或物種特異性DNA 區域，主要為特異性PCR、多重PCR、DNA 條形碼和熒光PCR 等方法。特異性PCR 技術， 即利用鯊魚的特異性DNA 引物鑒定特定種類的鯊魚，通過PCR 產物片段的大小來確定鯊魚物種[7]，該方法快速且廉價，適合在資源有限的情況下常規使用，僅限于對少數物種的檢測。根據鯊魚線粒體的細胞色素氧化酶I 基因（COI）序列設計鯊魚通用特異性引物， 鯊魚有效的擴增片段大小為228 bp，其他物種則無片段[18]，該方法可以鑒別魚翅的真偽， 但無法鑒定鯊魚的種類。 多重實時熒光PCR 技術，能夠在1 次反應中完成雙髻鯊、長尾鯊、鼠鯊等9 種鯊魚的高效快速鑒定[19]，該方法的設計和條件優化成本較高，通用性較差，只能鑒定特異物種。

DNA 條形碼是一種基于測序的技術，利用通用引物靶向1 個短的標準化遺傳區域來鑒定物種[20]，通過DNA 條形碼進行鑒定的基礎是種內遺傳差異低于種間差異[21]，將未知序列與參考數據庫進行對比，最終鑒定出物種。 DNA 條形碼也被用來揭示鯊魚產品的標簽錯誤， 以及受威脅和瀕危鯊魚物種的貿易。 PAZARTZI 等[22]使用魚類通用條形碼對87 份樣品進行鑒定，發現高達56%的樣品在銷售時存在標簽錯誤的問題，其中23%的物種被列入CITES 附錄。WARD 等[23]通過對來自澳大利亞水域的210 種鯊魚和鰩魚進行DNA 條形碼鑒定，驗證了COI 條形碼在軟骨魚類鑒別方面的有效性，以及在解決分類學問題和發現新物種方面的實用性。 但是在魚鰭被加工成魚翅的過程中，DNA 會被降解和高度碎片化[24]，對鑒定效果產生影響。FIELDS 等[25]開發了一種用于鯊魚物種識別的微條形碼分析方法， 該方法針對全長COI 條形碼中較短的110～130 bp 區域， 在100%的加工魚鰭和62%的魚翅湯樣本中有效識別出了鯊魚的物種或屬水平， 表明在其他高度加工的鯊魚產品（如鯊魚軟骨補充劑）中，鯊魚迷你條形碼分析方法有用于物種鑒定的可能。 ROSALEE 等[26]使用3種不同條形碼對35 種鯊魚產品進行鑒定，綜合鑒定效率為74.3%，其中鯊魚微DNA 條形碼的鑒定效率最高（54.3%），哺乳動物（45.7%）和魚類DNA（8.6%）條形碼的鑒定效率較低， 表明可通過多種引物的聯合使用增加鑒定準確性和成功率。

本研究基于16S rRNA 基因和COI 基因作為DNA 條形碼的靶基因，建立快速有效的魚翅物種鑒定方法，以期打擊魚翅走私，為魚翅的真偽鑒定和保護海洋魚類的多樣性提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

魚翅樣品均為海關口岸截獲樣品。

1.2 DNA 抽提及濃度測定

1.2.1 樣品前處理

干魚翅：用水將10 g 樣本泡發，取泡發后的魚翅2 g， 用振蕩研磨儀 （Bertin Precellys Evolution，Bertin Technologies，法國）充分研磨成細末，研磨程序為：5 500 r/min，20 s，并重復4～6 次。

1.2.2 DNA 抽提

使用DNA 抽提試劑盒 （DNeasy merion Food kit），取200 mg 碾磨后的樣本，加入DNA 提取裂解液1 mL，置于恒溫振蕩儀中，60℃振蕩30 min，繼續按照說明書進行DNA 抽提， 將抽提后的DNA 溶解于50 μL 水中，測定DNA 濃度，提取過程設置以水替代樣品的提取空白對照。

1.2.3 DNA 濃度和純度測定

通過NanoDrop ND-1000 （Thermo Fisher Scientific， 美國） 超微量分光光度計在260 nm 和280 nm 波長處進行測定，將A260nm處的吸光度值換算成DNA 濃度， 用A260nm和A280nm的吸光度比值（A260/280）表示DNA 純度。

1.3 PCR 引物

16S rRNA 基因上游引物16Sar：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′；下游引物16Sbr：5’-CCG GTCTGAACTCAGATCACGT-3′，引物參考PALUMBI等[27]采用的方法。COI 基因上游引物Fish F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；下游引物FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’，引物參考WARD 等[23]采用的方法。

1.4 PCR 擴增和測序

PCR 擴增體系為25 μL：2×TaqPCR Max Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL（10 μmol/L），DNA 模板2 μL（10～30 ng/μL），ddH2O 8.5 μL。16S rRNA 基因的擴增條件是：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個循環；72℃延伸5 min。COI 基因的擴增條件是：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，53℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個循環；72℃延伸5 min。PCR 擴增產物經純化后，送至測序公司進行雙向測序。

1.5 序列比對及分析

測序結果通過SeqMan 軟件進行序列校對和拼接，并刪除兩端引物序列。將處理過的16S rRNA 序列和COI 序列在GenBank BLAST 數據庫進行比對分析。當標本的同一性與參考序列的差異＜2%時，就可以被認為是在物種水平上識別的，100%的同一性得分被用作物種鑒定的截止值[28-29]。

1.6 系統發育分析

根據測序比對結果，從GenBank 數據庫下載其他鯊魚近似種的16S rRNA 和COI 參考序列。 將整理后的擬鯊魚樣品DNA 序列和從GenBank 數據庫下載的16S rRNA 和COI 參考序列， 使用MEGA11軟件進行多序列比對， 用p-distance 的算法構建鄰接法系統發育樹， 選用K2P 替代模型，Bootstrap 自展值設為1 000 次。

2 結果與分析

2.1 序列比對結果分析

本研究共獲得16S rRNA 基因序列和COI 基因序列各28 條，將獲得的序列在GenBank BLAST 數據庫進行比對分析，物種鑒定結果見表1。

表1 28 種魚翅16S rRNA 基因和COI 基因在NCBI 數據庫的鑒定結果Table 1 Identification results of 28 sharks based on 16S rRNA and COI Gene in the NCBI database

16S rRNA 基因比對結果顯示， 在成功獲得的28 個魚翅樣本的16S rRNA 序列中， 有21 條序列在GenBank 數據庫均能得到準確鑒定，且鑒定結果一致，物種序列相似度＞99.8%。 此外，7 號、9 號、10號和16 號魚翅出現相似度高的前3 序列均為鐮狀真鯊，物種序列相似度最高為99.32%，初步判定為鐮狀真鯊。 8 號魚翅出現相似度高的前3 序列為3種不同的真鯊屬物種，物種序列相似度均＞99.40%；19 號魚翅出現相似度高的前3 序列為3 種不同的雙髻鯊屬物種，物種序列相似度均＞98.00%；27 號魚翅出現相似度高的前3 序列為3 種不同的真鯊屬物種，物種序列相似度均＜98.00%。

COI 基因比對結果顯示，26 個魚翅樣本的COI序列在GenBank 數據庫均能得到準確鑒定，且鑒定結果一致，物種序列相似度≥99.7%。 此外，將7號和16 號魚翅在BLAST 數據庫中進行比對， 相似度達100%的物種有2 種結果，分別為鐮狀真鯊和短尾真鯊。

綜合分析2 組比對數據的結果可知，共28 個魚翅樣本來源于13 種鯊魚物種：1 號～4 號及24 號為尖吻鯖鯊；5 號、6 號、13 號、17 號以及20 號～23 號為無溝雙髻鯊；7 號、9 號、10 號和16 號魚翅為鐮狀真鯊；8 號魚翅為長鰭真鯊；11 號魚翅為牛鯊；12 號魚翅為黑邊鰭真鯊；14 號魚翅為烏翅真鯊；15 號魚翅為淺海長尾鯊；18 號魚翅為路氏雙髻鯊；19 號魚翅為小眼雙髻鯊；25 號和26 號為大青鯊；27 號為小尾真鯊；28 號為鼬鯊。從NCBI 中下載與鑒定出的鯊魚物種相似度達98%以上的16S rRNA 基因序列49 條，以及COI 基因序列64 條。

2.2 系統發育分析

2.2.1 魚翅16S rRNA 基因序列分析

構建77 個鯊魚16S rRNA 基因 （28 個樣本序列和49 條參考序列）的系統發育樹（圖2），可見大部分魚翅樣本的同一物種的不同個體基本都能聚合在一起， 且置信度均＞70%，50%以上的置信度被認為是可能發生的關系[30]，這一結果與BLAST 數據庫比對結果一致。 8 號魚翅與真鯊屬多個物種的相似度達到98.00%以上， 其中與長鰭真鯊相似度達到99.83%，分析樹顯示8 號魚翅與長鰭真鯊聚合成一支，且置信度為69%，因而可判斷8 號魚翅為長鰭真鯊。 7 號、9 號、10 號和16 號魚翅序列BLAST 數據庫比對結果為鐮狀真鯊，但在系統發育樹中，4 個魚翅雖然與鐮狀真鯊參考序列聚合在一起， 不同個體與參考序列形成的聚類關系的置信度并不高，只有59%， 檢測樣本序列與參考序列之間親源性不夠，可能是造成上述現象，需豐富參考序列信息，擴大采樣量。 19 號魚翅的16S rRNA 序列與2 種雙髻鯊屬物種的參考序列聚合成在一起，經對應的聚類關系鑒定無法確定所屬物種。27 號魚翅的16S rRNA 序列與真鯊科物種聚合在一起，無法確定其所屬物種。

圖1 基于16S rRNA 基因片段序列構建的魚翅物種系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of shark fins based on 16S rRNA gene

圖2 基于COI 基因片段序列構建的魚翅物種系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of shark fins based on COI gene

2.2.2 魚翅COI 基因序列分析

構建92 個鯊魚COI 基因（28 個樣本序列和64條參考序列）的系統發育樹顯示（圖3），大部分魚翅樣本同一物種的不同個體基本都能聚合在一起，且置信度均達到60%以上，這結果與BLAST 數據庫比對結果一致。 7 號和16 號魚翅BLAST 數據庫比對結果為鐮狀真鯊和短尾真鯊， 分析樹顯示這兩種魚翅與鐮狀真鯊和短尾真鯊聚合在一起， 且置信度達到86%， 說明這2 種真鯊屬物種COI 序列非常相似，在這個基因區間無法區分。

2.2.3 綜合分析

COI 基因和16S rRNA 基因的系統發育樹分支拓撲結構總體趨于一致，驗證了DNA 條形碼鑒定結果的準確性。COI 基因在本次試驗中無法有效區分鐮狀真鯊和短尾真鯊，16S rRNA 基因可以能有效區分兩組真鯊物種，說明在該基因區間內，兩種真鯊的序列差異大；COI 基因鑒定19 號魚翅為小眼雙髻鯊和27 號魚翅為小尾真鯊，基于16S rRNA 序列無法鑒定出此樣品的原因在于GenBank 數據庫中并沒有小眼雙髻鯊和小尾真鯊的相關片段（即缺少該物種16S rRNA 基因片段以及線粒體全基因組序列），通過已知序列無法基于16S rRNA 基因對該魚翅樣品進行準確鑒定。 基于已確定的COI 基因序列的鑒定結果可對16S rRNA 鑒定結果進行補充。CHUN 等[31]在使用16S rRNA 基因序列對原生動物進行物種鑒定時，同樣也出現相關匹配序列缺少，這是利用16S rRNA 基因鑒定的主要障礙之一。

2.3 已鑒定物種的保護現狀

鐮狀真鯊，長鰭真鯊，黑邊鰭真鯊，烏翅真鯊，小尾真鯊，牛鯊，大青鯊和鼬鯊均屬于真鯊科物種；路氏雙髻鯊， 無溝雙髻鯊和小眼雙髻鯊均屬于雙髻鯊物種；尖吻鯖鯊屬于鼠鯊科物種；淺海長尾鯊屬于長尾鯊科物種，以上物種均列入《CITES 公約》附錄II。

2.4 魚翅物種鑒定方案

本次研究中，16S rRNA 基因和COI 基因對鯊魚物種鑒定結果表明，DNA 條形碼技術能對絕大多數鯊魚物種進行準確鑒定。 目前Genbank 數據庫中有關鯊魚物種COI 基因的信息較多，涵蓋的物種數量和種類比較齊全， 相對來說鯊魚16S rRNA 基因的信息較少，涵蓋的物種數量和種類也較少。但根據本次鑒定結果，鑒定魚翅樣本，建議兩種引物聯合使用，可以相互驗證，提高鑒定準確性。

3 結論

本研究應用通用引物擴增口岸截獲28 個魚翅的線粒體16S 核糖體RNA 基因（16S rRNA）和細胞色素氧化酶Ⅰ基因（COI）部分序列進行基因庫比對和構建NJ 分子系統發育樹分析， 共鑒定2 目4科6 屬13 種物種，且均列入《CITES 公約》附錄II?；?6S rRNA 基因和COI 基因的DNA 條形碼技術可以有效應用于大部分魚翅物種的鑒定，2 個基因對同一種魚翅物種的鑒定結果基本一致， 鑒定有差異部分可以互補鑒定。 因而建議鑒定魚翅可以先用COI 基因進行初次鑒定，16S rRNA 作為補充條形碼基因鑒定。 此外，16S rRNA 目的基因在序列長度上更短，更適合加工食品。本研究提供的魚翅物種鑒定方案可對魚翅物種進行準確快速的鑒定， 為打擊瀕危鯊魚走私、 滋補品真偽市場監督管理和保護鯊魚資源提供技術支持。