餐飲中沙門氏菌實時熒光定量PCR 快速檢測方法的建立

陳玉珍 朱良兵 胡翮 何碩 郭沛 趙子冰

（湘潭市食品藥品檢驗所 湖南湘潭 411100）

0 引言

快速有效地檢測沙門氏菌對于餐飲安全至關重要[1-3]。 沙門氏菌（Salmonella）是一種無芽胞、無莢膜的革蘭陰性桿菌，包括腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌2 種，目前已發現存在2 579 個血清型[4-5]。因其營養要求低，在糞便、土壤、水、食品（肉、蛋、奶、面包等） 中存活時間可長達5 個月至2 年之久，且污染食品后并無明顯的感官變化，極易被動物及人類食用造成感染性疾病，是引起食物中毒的常見致病菌之一[6-8]，感染后可引發傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎、食物中毒等，因此沙門氏菌始終是醫療衛生、食品衛生和商檢部門的重點檢驗對象之一[9-11]。沙門氏菌病對全球特別是發展中國家的公共衛生安全構成嚴重威脅， 占我國食源性疾病的40%～60%。

沙門氏菌傳統的檢驗方法存在特異性差、 步驟繁多、耗時耗力（需3～5 d）等缺點，無法滿足當今社會環境下的檢測需求。 因此，建立快速、準確的沙門氏菌檢測方法對預防沙門氏菌病是非常必要的[12-14]。 本研究根據沙門氏菌ompC 保守序列設計特異性引物和TaqMan 探針， 建立一種可快速檢測沙門氏菌的實時熒光定量PCR 法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

亞利桑那沙門氏菌（Salmonella arizonae）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella para-typhi B）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、福氏志賀氏菌（shigella flexneri）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）均為本科室經試驗分離鑒定保存菌株。

1.1.2 儀器和試劑

StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀 （美國ABI公司）； 離心機（德國SIGMA 公司）；VITEK2 compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析儀（法國梅里埃公司）；麥氏比濁儀（法國梅里埃公司）；HFsafe-1200生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；霉菌培養箱（天津泰斯特儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）； 沙門氏菌核酸熒光PCR 法測定試劑盒（生科源）；細菌培養基均由北京陸橋公司提供。

1.1.3 沙門氏菌核酸熒光試劑盒主要組成成份核酸提取液，沙門氏菌核酸熒光PCR 檢測混合液、酶、H2O、陰性對照品、陽性對照品。

1.1.4 試驗樣品

隨機抽樣餐具、筷子、盒飯、米面制品、沙拉、鮮榨果蔬汁、中式涼拌菜、燒烤類、熱菜及壽司類，采樣地點覆蓋飯店、酒店、集體食堂、街頭攤點、快餐店、小吃店、飲品店等。

1.2 引物與引物和TaqMan 探針的設計與合成

根據GenBank 登錄的沙門氏菌ompC 保守序列，運用Primer Express 5.0 軟件設計引物和探針。

上游引物P1：5’-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3’；

下游引物P2：5’-AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3’。

探針序列為：FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMARA。由擎科生物股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 菌種復蘇

將存于-80℃低溫冰箱中的陽性菌液接種至胰酪大豆胨液體培養基中復蘇，36°C 培養24 h。

1.3.2 模板制備

取培養液中的菌液，置于含1mL 生理鹽水的離心管中，利用麥氏濁度儀配置成0.5 麥氏單位菌懸液（相當于含細菌數1.5×108/個）振蕩混勻[15-16]，12 000r/min離心5 min；去上清，直接在沉淀中加入50 μL DNA提取液，金屬浴100℃5 min；12 000 r/min 離心2 min，取上清液即為DNA 提取液 （如不立即進行試驗，于-20℃凍存）。

1.3.3 熒光定量PCR 檢測體系的評價

先對陽性沙門氏菌對照菌種進行實時熒光定量PCR 檢測，以考察體系的符合性；以無菌操作將沙門氏菌提取的核酸DNA （以0.5 麥氏單位菌懸液為原液提?。?，按10 倍稀釋至10-1～10-7濃度，用本研究考察熒光定量PCR 的靈敏度和可行性；選取經過傳統方法鑒定的47 份沙門氏菌陽性樣品和另外3種實驗室保存陽性沙門氏菌株進行DNA 的提取并進行PCR 檢測，以驗證該體系的特異性；同時對4個濃度的樣本進行6 次的重復試驗。 通過試驗的結果CT 值的平均值來評價方法的可重復和穩定性。

1.3.4 VITEK2 compact 與熒光定量PCR 靈敏度

將0.5 麥氏單位菌懸液制成100～10-4濃度的菌液， 將5 個濃度菌液進行VITEK2 compact 上機生化鑒定， 同時對5 個濃度的菌懸液進行DNA 提取，并進行熒光定量PCR 檢測。 通過試驗結果來比較2種檢測方法的靈敏度差異。

1.3.5 熒光定量PCR 檢測體系建立

熒光定量PCR 體系為25 μL，包括19.5 μL PCR混合反應體系（包括引物和探針）、0.5 μL 混合酶液、5 μL 模板DNA，進行PCR 擴增。 擴增程序為：UNG處理50℃2 min； 預變性95℃3 min；100℃5 s、55℃60 s（采集熒光信號）循環40 次。熒光通道選擇FAM通道。

2 結果

2.1 方法符合性

47 株分別是餐飲具和食品中分離鑒定的沙門氏菌， 通過PCR 擴增出現良好的S 型擴增曲線，CT值均＜30，有明顯指數增長，檢測結果均能判定為陽性。表明本研究建立的熒光PCR 檢測體系的正常性及對沙門氏菌檢測具有較高的符合性，見圖1。

圖1 沙門氏菌實時熒光定量PCR 檢測體系的符合性Fig.1 Conformity of Salmonella real-time fluorescence quantitative PCR detection system

2.2 方法的特異性

采用熒光定量PCR 方法擴增陽性對照DNA、沙門氏菌及5 種相關腸道細菌DNA 進行檢測，結果見圖2。 陽性菌和沙門氏菌DNA 擴增后，呈S 型擴增曲線， 其他腸道細菌DNA 及陰性對照均未擴增，表明本研究建立的熒光定量PCR 檢測方法具有極高的特異性。

圖2 沙門氏菌實時熒光定量PCR 檢測特異性擴增結果Fig.2 Specific amplification results of real-time fluorescent quantitative PCR detection of Salmonella

2.3 方法的靈敏性

將陽性沙門氏菌DNA 稀釋至濃度依次為1.5×107CFU/mL～1.5×101CFU/mL； 用稀釋后的DNA 作為模板進行熒光定量PCR 擴增，結果見圖3。 當DNA濃度為1.5×107CFU/mL～1.5×101CFU/mL，CT 值隨著濃度的降低而增大，最低檢出限量值為15 CFU/mL。

圖3 沙門氏菌實時熒光定量PCR 檢測靈敏性擴增結果Fig.3 Sensitivity amplification results of real time fluorescence quantitative PCR for Salmonella detection

2.4 方法的重復性

選取1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104CFU/mL共4 個濃度沙門氏陽性菌DNA， 用建立的PCR 反應體系分別進行6 次的重復檢測，記錄各組的Ct值，并計算變異系數，結果見表1。Ct 值變異系數均在合理范圍內，均小于0.2%，表明本研究建立的檢驗方法重復性極高。

表1 陽性菌株樣本重復性檢測結果Table 1 Repeatability test results of positive strain samples

2.5 VITEK2 compact 與熒光定量PCR 靈敏度比較

將陽性沙門氏菌復蘇菌液配置成0.5 麥氏單位菌懸液并稀釋成100～10-4濃度的菌液， 將這5 個濃度的菌液分別進行VITEK2 compact 上機生化鑒定和熒光定量PCR 檢測。 結果顯示，VITEK2 compact和熒光定量PCR 檢測時間相近，與傳統沙門氏菌鑒定方法相比，時間大大縮短，但是二者在靈敏度上存在明顯差異，詳見表2。

表2 VITEK2 compact 和熒光定量PCR 檢測方法靈敏度比較Table 2 Comparison of sensitivity between VITEK2 compact and fluorescent quantitative PCR detection methods

2.6 實際樣品的檢測

2020 年9 月—2021 年9 月，本實驗室收集餐飲具和食品樣品共計300 份：餐具、筷子、盒飯、米面制品、沙拉、鮮榨果蔬汁、中式涼拌菜、燒烤類、熱菜及壽司類。對樣品進行前增菌培養后，檢測過程分別采用傳統培養法、VITEK2 compact 全自動微生物鑒定及實時熒光定量PCR 進行平行試驗，對比3 種方法的優劣。 結果顯示，3 種方法檢測陽性結果相近，其中傳統培養法和實時熒光定量PCR 都檢出47 批陽性，VITEK2 compact 檢出42 批陽性。之后分別采用全式金DNA 提取試劑盒提取DNA，采用其配套PCR體系和生科源檢測試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，對上述47 批陽性樣本進行第二輪驗證，發現二者檢測陽性結果一致，符合率為100%。從以上分析結果可以看出， 應用熒光定量PCR 方法檢測餐飲具和食品實際樣品中的沙門氏菌更快捷、準確。

3 結論與討論

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性腸道桿菌， 能夠進入多種宿主細胞的侵襲細菌[17]。 沙門氏菌作為一種人類致病菌每年都會導致很多嚴重病例和死亡病例，受到全世界的廣泛關注[17]。餐飲具、餐飲食品、動物或動物制品、 新鮮的農產品等間接受到沙門氏菌污染都會導致感染[18]。 傳統的沙門氏菌檢測主要依靠細菌分離、生化鑒定等方法，過程繁瑣，費時費力，生化反應容易交叉[19]。因此，快速、準確地檢測沙門氏菌對保障食品安全、防止疾病傳播具有重要意義[20]。

實時熒光定量PCR 方法是一種建立在普通PCR基礎上的新技術， 該技術可以檢測分析各技術擴增同時進行，具有特異性強，靈敏度高、檢測快速等特點[21]。 根據沙門氏菌ompC 保守序列登錄GenBank，運用Primer Express 5.0 軟件設計引物和探針，確定PCR 體系及反應條件后，同時對陽性沙門氏對照菌種、3 種實驗室保存陽性沙門氏菌株以及5 種相關腸道細菌的DNA 進行擴增檢測。 結果顯示，所有沙門氏菌及其陽性對照菌株呈S 型擴增曲線， 其他細菌沒有擴增， 充分證明了沙門氏菌的實時熒光定量PCR 方法具有高度特異性和覆蓋性。同時，對陽性沙門氏菌DNA 稀釋至濃度依次為1.5×107CFU/mL～1.5×101CFU/mL 進行靈敏性檢測； 對濃度依次為1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104CFU/mL 進行重復性檢測，靈敏度為15 CFU/mL，重復試驗的CT 值變異系數小于0.2%。利用本研究建立的熒光定量PCR方法與生科源沙門氏菌檢測試劑盒分別對采集的300 份樣本中的沙門氏菌進行檢測，2 種方法的陽性檢出率都為15.7%。 比較VITEK2 compact 和熒光定量PCR 2 種檢測方法， 檢測時間分別為6 h和3 h，可見2 種檢測方法時間比較相近， 但是VITEK2 compact 檢測存在試劑成本較高、購買時間周期長、所有配套檢測卡片均需從國外進口的缺點， 且在樣品復蘇菌液含量低于1.5×107CFU/mL 時便不能檢出；而熒光定量PCR 的檢驗靈敏度可達到15 CFU/mL， 且檢測成本低， 所有試劑均可在國內購買。 在實際檢測300 份樣本時，VITEK2 compact 存在漏檢陽性的情況，漏檢率達到11%。 這些檢測方法的對比結果說明本研究建立的熒光定量PCR 方法方便、 快捷，可以有效用于餐飲具、 餐飲食品安全監測以及臨床檢測等領域[22]。

普通PCR 檢測從核酸DNA 提取至PCR 擴增級電泳的全過程大約需要5～7 h， 而采用本研究建立的方法從核酸DNA 提取到檢測完成最快僅需3 h，且該方法實行完全閉管式操作， 可從根本上杜絕污染[23-24]。 綜上所述，本研究建立的沙門氏菌實時熒光定量PCR 檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好、方便快捷等優點，可運用于實驗室日常保障檢測任務中，具有良好的實用價值，對沙門氏菌的防治具有重要意義。