實驗室細菌內毒素定量檢測方法建立與驗證

李輝 湯曼莉 楊玉玲 吳愫青

（珠海市食品藥品檢驗所 廣東珠海 519000）

0 引言

細菌內毒素是注射劑中的主要致熱物質[1]，自20世紀60 年代闡明并建立鱟試驗方法學以來[2]，細菌內毒素檢查法具有操作簡單快速、靈敏度高、準確度高的優點[3]，因此可作為熱原檢查法的有效補充[4]，以控制藥品質量，提高藥品國家標準[5]。

本實驗采用內毒素檢測中的動態濁度法， 選取常見檢品維生素注射液和氯化鈉注射液， 對照3 種不同廠家的鱟試劑進行動態濁度法測定細菌內毒素結果， 驗證不同廠家的鱟試劑對細菌內毒素定量檢測的靈敏度和準確性。

1 實驗材料

1.1 儀器

TAL-96G 型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；MS3 基本型震蕩器 （德國IKA 集團公司）；DHG9077A 型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；試管、試管架、微量移液器及配套無熱原槍頭等。

1.2 藥品與試劑

維生素C 注射液（國藥集團容生制藥有限公司，規格：2 mL∶0.5 g，批號：1911301）；氯化鈉注射液（江西科倫藥業有限公司， 規格：250 mL∶2.25 g， 批號：C20033301B）；氯化鈉注射液（廣東艾希德藥業有限公司，規格：250 mL∶2.25 g，批號：191209101）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，0.01 EU/mL， 批號：1809270； 廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，0.01 EU/mL，批號：21034103；福州新北生化工業有限公司，0.01 EU/mL，批號：23051212）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院生產，規格80 EU/支，批號：150601-201886）； 細菌內毒素檢測用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號：2008120）。

2 方法與結果

2.1 供試品細菌內毒素限值（L）的確定

依據《中國藥典》（2020 年版） 二部中維生素C注射液細菌內毒素項規定每1 mg 維生素C 中含內毒素的量應小于0.020 EU；氯化鈉注射液細菌內毒素項規定每1 mL 中含內毒素的量應小于0.50 EU。本次實驗采用該標準。

2.2 最大有效稀釋倍數（MVD）的計算

參照藥典規定的公式：MVD=c·L/λ，計算檢品1維生素C 注射液（批號：1911301）MVD 為500 倍；檢品2 氯化鈉注射液（批號：C20033301B）MVD 為50倍；檢品2 氯化鈉注射液（批號：191209101）MVD 為50倍。

2.3 動態濁度法定量檢測方法驗證

2.3.1 線性關系

本試驗采取最嚴格要求，制備了0.01、0.05、0.1、0.5、1 EU/mL 等5 個細菌內毒素標準品濃度，每個濃度平行3 管，陰性對照2 管，進行標準曲線可靠性試驗。所得標準曲線回歸方程：LgTg=2.586 1-0.365 6 LgC，r=-0.994 7，|r|＞0.980，表明本實驗動態濁度法定量檢測線性良好。

2.3.2 適用性

本實驗的適用性考察包括預干擾實驗和專屬性實驗。 預干擾實驗考察樣品對內毒素定量檢測的影響， 專屬實驗考察所采用的分析方法能否正確測定出被測物（細菌內毒素）的能力。

2.3.2.1 預干擾實驗

本實驗采用湛江安度斯鱟試劑、 廈門鱟試劑和福州新北鱟試劑考察不同稀釋倍數樣品的內毒素的回收率（表1）。

表1 不同倍數稀釋樣品在3 種鱟試劑條件下的預干擾實驗結果Table 1 The pre-interference test results of different dilution samples under the condition of three limulus reagents

由表1 可知， 湛江安度斯鱟試劑和福州新北鱟試劑條件下， 不同稀釋級別樣品回收率均在50%～200%內，樣品不存在干擾，高稀釋級別比低稀釋級別回收率高。 廈門鱟試劑的預干擾實驗結果比其他2種鱟試劑在同樣實驗條件下檢測的回收率結果低，2倍稀釋氯化鈉溶液細菌內毒素回收率低于50%，低稀釋倍數的樣品溶液對實驗存在干擾。 試驗結果顯示， 廈門鱟試劑與其他2 種鱟試劑質量參數存在差異，抗干擾能力較差。 因此，本次實驗采用回收率較高的高稀釋級別樣品溶液進行正式干擾實驗測定。

2.3.2.2 專屬性實驗

本實驗采用氯化鈉注射液（批號：191209101）進行專屬性實驗， 參照預干擾實驗結果， 標準曲線取0.01、0.1、1 EU/mL 等3 個細菌內毒素標準品濃度，制備含0.1、0.5、1 EU/mL 細菌內毒素50 倍稀釋供試品溶液， 測定回收率分別為100.79%、78.27%、64.17%，回收率均在50%～200%之間，符合要求，實驗方法專屬性良好。

2.3.3 重復性

在規定范圍內，取同一濃度的供試品，用至少6份的測定結果進行評價。 氯化鈉注射液內毒素限值為0.5 EU/mL， 參照適用性實驗最優結果， 配制含0.5 EU/mL 細菌內毒素的50 倍供試液稀釋液，以0.01、0.1、1 EU/mL 3 個細菌內毒素標準品濃度為標準曲線，進行6 次平行測試，計算回收率及RSD 值。參照藥典對重復性的要求，本次實驗所使用的試劑氯化鈉注射液濃度為0.9%， 稀釋50 倍濃度為0.018%，重復性RSD 值為2.54%，小于3%，本次實驗重復性良好，符合規定。

2.4 標準曲線可靠性試驗

本實驗通過標準曲線可靠性試驗求得湛江安度斯鱟試劑標準曲線回歸方程：LgTg=2.662 1-0.336 1 LgC，r=-0.999 3；廈門鱟試劑的標準曲線回歸方程：LgTg=2.568 1-0.373 1LgC，r=-0.998 2； 福州新北鱟試劑標準曲線回歸方程：LgTg=2.716 2-0.300 6LgC，r=-0.999 8。 3 個廠家鱟試劑標準曲線回歸方程|r|均大于0.998 0，平行管RSD 均小于10%，故所得標準曲線有效。

2.5 干擾實驗

本實驗根據預實驗結果采用最高稀釋倍數樣品進行干擾試驗，實驗結果見表2、表3 和表4。

表2 湛江安度斯鱟試劑的干擾試驗結果Table 2 interference test results of Zhanjiang Andus Limulus agent

表3 廈門鱟試劑的干擾試驗結果Table 3 Interference test results of Xiamen Limulus agent

表4 福州新北鱟試劑的干擾試驗結果Table 4 interference test results of Fuzhou xinbei Limulus agent

結果顯示，3 批檢品在湛江鱟試劑、廈門鱟試劑和福州新北鱟試劑條件下均未檢測到細菌內毒素，結果一致。樣品陽性對照回收率均在規定范圍內，但廈門鱟試劑條件檢測下的回收率均比湛江鱟試劑和福州新北鱟試劑的低，與預干擾實驗結果相符。

3 討論

本實驗是我所開展的細菌內毒素動態濁度法檢測能力擴項實驗， 通過對動態濁度法方法的驗證，建立了實驗室定量檢測細菌內毒素方法，同時選取了檢測頻率高的檢品氯化鈉注射液和維生素C注射液作為樣品，采用3 個不同廠家的鱟試劑分別進行驗證， 驗證動態濁度法定量檢測的可靠性、靈敏度和準確性。

實驗結果表明，氯化鈉注射液和維生素C 注射液在最大有效稀釋倍數（MVD）相較其他稀釋級別回收率更高，本實驗均采取最大有效稀釋倍數進行樣品稀釋檢測；在廈門鱟試劑條件下，低稀釋倍數氯化鈉注射液干擾作用明顯， 回收率低于50%；供試液在廈門鱟試劑反應條件下比湛江安度斯鱟試劑和福州新北鱟試劑的反應時間短，回收率低。

鱟試劑法檢測細菌內毒素含量，會受到很多因素的影響，如供試品的pH 值、溫度、離子強度、濃度等[6]，同時，不同廠家生產鱟試劑質量差數會存在一定差異，其抗干擾能力不同[7]。 因此，雖然不同廠家的鱟試劑標示靈敏度相同，但會因實際靈敏度不同導致同一樣品產生完全不同的檢測結果[8]，故選用新批次鱟試劑時應進行靈敏度復核，并選用標示靈敏度與實際靈敏度相符的鱟試劑進行檢驗，以保證實驗結果的準確性。

本實驗建立的細菌內毒素動態濁度法可以滿足日常定量檢測檢品細菌內毒素的需求，不受鱟試劑種類的影響，結果靈敏、準確。 同時，該方法具備可追溯性[9]，出現假陽性結果時，應用動態濁度法判斷實驗結果的條件更全面，更利于分析原因[10]。