單中心CCLG-ALL 2018方案治療MLL基因重排陽性兒童急性淋巴細胞白血病的臨床研究

李晨 劉煒 王亞峰 王天有

作者單位：450000 鄭州1鄭州大學附屬兒童醫院，河南省兒童醫院，鄭州兒童醫院血液腫瘤科；450000 鄭州2鄭州大學附屬兒童醫院，河南省小兒血液醫學重點實驗室；100045 北京3首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童最常見的惡性腫瘤，以幼稚淋巴細胞惡性克隆性增殖為特征［1］，約占兒童所有惡性腫瘤的25%，發病高峰年齡為2～5 歲。隨著化療方案的不斷優化，目前兒童ALL 患者的存活率已超過85%［2］，但存在混合譜系白血?。╩ixed lineage leukemia，MLL）基因重排陽性急性淋巴細胞白血?。∕LL-rearrangement acute lymphoblastic leukemia，MLL-r ALL）的患兒存活率仍較低。MLL基因位于染色體11q23 上，可與80多個不同的配對基因重排，其重排存在于初治和治療相關的髓系和淋巴母細胞白血病中，約占兒童ALL 的5%、嬰兒ALL 的75%［3］。據報道，MLL-r ALL以1 歲以下的嬰兒最為多見，是最具侵襲性的白血病亞型之一，通常以起病快、高白細胞和預后不良為特征［4］。本研究回顧性分析鄭州大學附屬兒童醫院于2018年4月至2022年7月收治的19例MLL-r ALL 患者的臨床資料，以探討兒童MLL-r ALL 患兒在中國兒童白血病協作組（CCLG-ALL 2018）方案治療下的療效。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年4月至2022年7月在鄭州大學附屬兒童醫院按照CCLG-ALL 2018 方案診治的19 例MLL-r ALL 患兒的臨床資料?；純旱募{入標準：⑴臨床診斷為MLL-r ALL（骨髓中原始+幼稚淋巴細胞≥20%且存在MLL基因重排）；⑵確診前未接受過任何抗腫瘤治療；⑶年齡小于18 歲；⑷采用CCLG-ALL 2018 方案治療。排除標準：⑴中途轉去其他醫院治療；⑵隨訪失聯?；仡櫺苑治鏊谢純旱男詣e、初診時年齡、初診白細胞、白血病細胞免疫分型、染色體核型等臨床特征。本研究通過鄭州大學附屬兒童醫院倫理委員會審核批準（倫理批文號：2023-K-130）。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫表型分析 取患者骨髓2 mL，加入肝素抗凝后，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，然后加入表面標記的抗體，用PBS 洗滌后放置于流式細胞儀上進行上機處理（檢測儀器為美國BD 公司FACS canto 型流式細胞儀），檢測熒光陽性細胞的百分率，并以抗原表達超過20%為陽性。根據免疫表型特征可分為早期前B-ALL（Pro-B-ALL，CD19+CD10-cyμ-lgk-lgλ-）、普通型B-ALL（common-B-ALL，CD19+CD10+cyμ-lgk-lgλ-）、前B-ALL（Pre-B-ALL，CD19+CD10+/-cyμ+lgk-lgλ-）。

1.2.2 染色體核型分析 取患者骨髓5 mL，加入肝素抗凝后進行R 顯帶分析染色體核型。核型異常的依據《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2013）》進行描述。

1.2.3 熒光原位雜交（FISH）技術檢測MLL基因重排 取患者骨髓2 mL，加入肝素抗凝后，應用FISH技術，采用MLL基因斷裂點雙探針（紅色和綠色熒光探針）標記靶細胞。在熒光顯微鏡下觀察間期細胞的熒光雜交信號，每例至少分析200 個間期細胞。陰性細胞呈現兩個黃色信號，陽性細胞呈現兩紅兩綠四個熒光信號，或一紅一綠一黃三個熒光信號。

1.2.4 RT-PCR 法檢測MLL融合基因 取2 mL 骨髓，加入肝素抗凝，用Ficoll 梯度離心法分離骨髓標本中的單個核細胞。根據試劑使用說明，使用Trizol 試劑提取總RNA，用PCR方法檢測常見MLL融合基因。

1.3 治療方案與療效評估

19 例MLL-r ALL 患兒參照CCLG-ALL 2018 診治方案，根據診斷時的年齡、白細胞計數、免疫分型、細胞遺傳學和分子生物學、早期治療反應及微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）水平等指標，均被劃為高危組，均采用CCLG-ALL 2018（高危組）治療方案，依次進行誘導緩解、早期強化、鞏固、延遲強化和維持治療。在化療過程中監測潑尼松治療反應、誘導化療第15 天、第33 天及第12 周MRD 及MLL重排基因是否轉陰來進行評估療效?；蜣D陰是指通過RT-PCR 法檢測融合基因定量＜1×10-4。完全緩解（complete remission，CR）定義為骨髓中原始及幼稚細胞比例＜5%，外周血無幼稚細胞，血紅蛋白≥90 g/L，血小板計數≥100×109/L，中性粒細胞計數≥1.5×109/L。

1.4 隨訪

采用電話、短信、以及查閱電子病歷方法進行隨訪，自患兒誘導緩解化療期結束開始隨訪，隨訪間隔時間為2 個月，隨訪截至2023 年5 月31 日。隨訪期間，白血病達CR 后再次出現骨髓原始及幼稚細胞≥5%或者出現髓外浸潤為復發。極早期復發：距離診斷時間＜18 個月出現疾病復發；早期復發：距離診斷時間在18～36 個月之間出現疾病復發；＞36 個月出現疾病復發為晚期復發?？偵嫫冢╫verall survival，OS）指從疾病診斷至因任何原因死亡或隨訪截止的時間。無事件生存時間（event-free survival，EFS）是指從診斷到出現任何事件（包括疾病復發、疾病進展、疾病持續不緩解）的時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量資料以中位數表示，計數資料以率（%）表示。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，采用Cox 比例模型分析影響預后因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

19 例MLL-r ALL 患兒中男12（63.2%）例、女7（36.8%）例，男女比例為1.72∶1。年齡≤1 歲的為15（78.9%）例、年齡＞1 歲的為4（21.1%）例，診斷時的中位年齡為10.2個月（范圍：0.5～156.0個月）。18（94.7%）例為B 前體急性淋巴細胞白血?。˙-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL），1（5.3%）例為急性T淋巴細胞白血?。╝cute T-lymphocytic leukemia，T-ALL）。初診白細胞≥50×109/L的患兒為16（84.2%）例、初診白細胞＜50×109/L的患兒為3（15.8%）例，初診平均白細胞值為227.78×109/L（6.99×109/L～913.14×109/L）。初診時骨髓平均原始細胞為81.2%（51.6%～97.0%），見表1。

表1 19例MLL-r ALL患兒的臨床和血液學資料Tab.1 Clinical and hematological data of 19 children with MLL-r ALL

2.2 MLL-r ALL患兒的免疫表型分析

19 例MLL-r ALL 患兒標本的免疫表型分析結果顯示，18 例MLL-r ALL 患兒為B 細胞系來源異常細胞，均有CD19、HLA-DR 和cCD79a 表達；1 例MLL-r ALL 患兒為T 細胞系來源異常細胞，可見CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD38、CD99、cCD3、CD117表達。19例MLL-r ALL患兒中14例為Pro-B-ALL、2例為Common-BALL、2例為Pre-B-ALL。CD10+者4例，CD10-者15例。

2.3 MLL-r ALL患兒的染色體核型分析

19例MLL-r ALL患兒均進行染色體核型分析。R顯帶核型分析顯示8例核型異常（異常率為42.1%）、6 例核型正常、5例因細胞生長不良未見可分析的分裂相。8 例核型異常的MLL-r ALL 患兒中有4 例涉及11q23的異常，分別為46，XY，add（4）（q21），add（11）（q23）［8］/46，XY［4］；46，XX，（4；11）（q21；q23）［5］/46，XX［5］；46，XX，t（4；11）（q21；q23）［4］/48，idem，+X，+21［5］/46，XX［1］；47，XY，+？9，del（11）（q23）［7］/46，XY［2］。

2.4 MLL-r ALL 患兒的MLL 基因重排及其融合基因分析

FISH技術檢測結果顯示，19例MLL-r ALL患兒均檢測出MLL基因重排。RT-PCR法檢測結果顯示，19例MLL-r ALL 患兒中有17例檢測出MLL融合基因，其中MLL-AF47例、MLL-AF1P1例、MLL-ENL4例、MLL-AF61例、MLL-AF91 例、MLL-AF102 例、MLL-CBL1 例，見表1。

2.5 MLL-r ALL患兒的治療與療效分析

19 例患兒中1 例在確診后5 d 死亡，無有關療效評價的數值，故將剩下18例患兒納入療效評價。18 例MLL-r ALL 患兒誘導治療第15 天，5（27.8%）例患兒MRD＜1×10-3，13（72.2%）例患兒MRD≥10-3；基因轉陰率為0%。誘導治療第33 天，7（38.9%）例患兒MRD≥1×10-4，11（61.1%）例患兒MRD＜1×10-4；基因轉陰率為66.7%（12/18）。治療第12 周，16（88.9%）例患兒MRD＜1×10-4，2（11.1%）例患兒MRD≥1×10-4；基因轉陰率為72.2%（13/18），誘導化療第33 天完全緩解率為61.1%。

2.6 MLL-r ALL患兒的生存率及預后因素分析

中位隨訪時間為19.0個月（范圍：0.1～62.0個月）。19例MLL-r ALL 患兒死亡9 例，死亡率為47.4%，其中死于治療相關并發癥3例，包括肺出血1例、重癥感染2 例；1 例持續未緩解；死于復發5 例，復發率為26.3%，均為極早期骨髓復發，中位復發時間為6 個月（范圍：5～9個月）。所有患兒的2年累積OS率、EFS率分別為57.9%和52.6%，見圖1。單因素分析結果顯示，誘導化療第15 天MRD＜1×10-3組與≥1×10-3組、第33天MLL重排基因轉陰與未轉陰組、MLL-AF4組與非MLL-AF4組患兒的2 年OS 率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2、圖2。而年齡、初診白細胞、初診血小板、初診血紅蛋白、初診紅細胞、初診中性粒細胞、初診LDH、CD10 表達情況、第33 天MRD、第12 周MRD 以及第12 周基因分組均未見明顯統計學差異（均P＞0.05），見表2。將以上單因素分析P＜0.05 的因素納入多因素分析，Cox模型多因素分析顯示，重排基因MLL-AF4是影響MLL-r ALL 患兒OS 的獨立預后不良因素（P=0.032），見表3。

圖1 MLL-r ALL患兒的OS和EFS生存曲線Fig.1 Curves of OS and EFS of MLL-r ALL patients

圖2 不同類型MLL-r ALL患兒的OS生存曲線Fig.2 The OS curves of different types of children with MLL-r ALL

表2 單因素分析影響MLL-r ALL患者OS的預后因素Tab.2 Univariable analysis of prognostic factors affecting OS in patients with MLL-r ALL

表3 多因素分析影響MLL-r ALL患者OS的預后因素Tab.3 Multivariable analysis of prognostic factors affecting OS in patients with MLL-r ALL

3 討論

MLL基因又稱KMT2A基因（組蛋白賴氨酸［K］-甲基轉移酶2A 基因），位于11q23，其重排是導致急性白血病的常見原因［5］。MLL重排是染色體易位的結果，其重排產生MLL融合基因，進而編碼具有新功能的蛋白產物，同時保留原有MLL 的一些功能。因此，得到的MLL 融合蛋白是一種獨特的蛋白質復合體，在功能上與野生型MLL 復合體不同［6］。研究表明，MLL-r ALL 的患兒具有白細胞計數較高、年齡較小、對常規化療效果較差、容易復發、死亡率較高的特點［7］。MLL基因重排的存在通常被認為是急性白血病預后不良的標志之一。本研究中MLL-r ALL 患兒年齡≤1歲者占78.9%、初診白細胞≥50×109/L者占84.2%，符合發病年齡較小、初診白細胞計數較高，與既往報道結果［7］相符。有研究表明，發病時的年齡和白細胞計數是影響MLL-r ALL 預后的因素［8］，而本研究顯示初治時年齡≤1 歲、白細胞≥50×109/L 不是預后獨立危險因素，可能與樣本量及隨訪時間有限相關。本研究中MLL-r ALL 患兒的融合基因以MLLAF4為主，其他常見融合基因依次為MLL-ENL、MLL-AF10、MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF1P、MLLCBL。 MEYER 等［5］的大樣本量研究通過對876 名嬰兒和671 名兒童進行MLL基因和相關融合基因的測定，也發現MLL融合基因以MLL-AF4最為多見，其余幾種較為常見的融合基因依次為MLLAF9、MLL-ENL、MLL-AF10、MLL-AF6。

有研究表明，染色體核型分析法、FISH 法及RT-PCR 法3 種方法聯合可以提高MLL基因重排檢出率和明確融合基因類型［9］。本研究通過染色體核型分析法發現19 例患兒中只有14 例分析出染色體核型，5 例因細胞生長不良，未見可分析分裂相，表明該方法的敏感性較低；FISH 檢測敏感性及特異性均較高，所有病例均能通過FISH 法檢測出基因重排，然而該方法無法明確其融合基因類型，還需借助RT-PCR 確定伙伴基因類型。由此可見，聯合以上三種方法可以提高MLL基因重排檢出率并明確其融合基因類型，也為MLL-r ALL 患兒的診斷以及預后判斷提供更多的依據。

前體B-ALL 根據細胞發育程度可分為Pro BALL、Common B-ALL、Pre B-ALL 共3 個階段，且以Pro-B ALL 為主。本研究19 例MLL-r ALL 患兒中Pro-B ALL 患兒占73.7%，與既往報道基本相符［10］。既往研究表明，在MLL-r ALL 中，CD10 陰性是其不良預后的影響因素［11-12］，本研究中CD10 陰性與CD10 陽性組患兒的生存率雖然無顯著差異，但是有不良預后趨勢，有待后期擴大樣本量及延長隨訪時間加以證實。

白血病的治療包括化療、造血干細胞移植、靶向治療、放療等，其中化療是最主要的治療方式?；煼桨敢罁L險度分層，分階段進行，分為誘導緩解、早期強化、緩解后鞏固、延遲強化及維持治療［13］。目前主要采用CCLG-ALL 2018 高危方案治療MLL-r ALL 患兒，并定期監測第15天、33天及12周骨髓MRD 及MLL重排基因是否轉陰進行療效評估。本研究結果顯示，第15 天MRD＜1×10-3組與≥1×10-3組、第33 天MLL重排基因轉陰與未轉陰組、MLL-AF4組與非MLL-AF4組OS 比較差異均有統計學意義（P=0.032，0.042，0.008）。多因素分析結果顯示重排基因MLL-AF4為影響MLL-r ALL患兒生存期的預后不良因素（P=0.032）。本研究雖然病例數較少，生存分析結果價值有限，但是仍可以看出重排基因為MLL-AF4是影響MLL-r ALL 患兒生存期的不良因素，后期可以采用大樣本、多中心的臨床研究來驗證。

腫瘤化療過程中可能會出現很多化療相關并發癥，本研究收集患兒誘導緩解階段的不良反應類型，得出在誘導階段最為常見的為血液系統不良反應（100%）。18 例患兒均需輸血治療，平均輸血次數為12 次（3～56 次），輸血次數與預后不存在統計學關系（P＞0.05）。其次為肺部感染（88.9%），腹瀉、肝損傷、電解質紊亂、口腔感染及膿毒血癥也較為常見，偶可見急性胰腺炎、敗血癥、甲狀腺功能減退及消化道出血；9 例死亡患兒中2 例死于嚴重感染。因此說明在CCLG-ALL 2018 方案化療下，患兒存在著較多不良反應，平衡化療藥物劑量與并發癥防治之間的關系至關重要，有待于更進一步的研究。

MLL-r ALL患兒總體預后較差，緩解后容易復發，一方面是由于MLL-r ALL 患兒對化療不敏感，短期療效差，盡管用了CCLG-ALL 2018 高危組方案治療，但第33 天完全緩解率仍較低，9 例死亡患兒中有4 例在化療第33 天未達完全緩解。而導致化療效果差的重要原因是細胞耐藥，在治療過程中白血病細胞容易對皮質類固醇和L-天冬氨酸耐藥［14］。異基因造血干細胞移植（HSCT）是治療急性白血病的方法之一，通常是耐藥或者難治患者的唯一選擇。然而，有研究發現HSCT 與單純化療相比并不能改善MLL-r ALL 兒童的EFS 或OS［15］。在TOMIZAWA等［16］的研究中發現HSCT 只對患有MLL基因重排且具有額外高危特征的嬰兒亞群有益：年齡較?。ǎ? 個月）、白細胞計數高（≥300×109/L）或最初對皮質類固醇反應差的嬰兒。MLL-r ALL 患兒預后差的另一重要原因是緩解后容易復發，一旦復發，治療效果則遠差于初診ALL。該研究中9 例死亡患兒中5 例死于復發，且均為極早期骨髓復發，復發患兒最終全部死亡。因此針對MLL-r ALL 患兒較高的復發率，期望能盡早尋找一些新指標來更早、更準確的預測復發，從而避免高復發風險者的治療不足和低復發風險者的過度治療，以進一步提高兒童ALL的療效。

目前研究發現嵌合抗原受體T 細胞（CAR-T）療法是一種治療MLL-r ALL 很有前景的方法，CAR-T療法通過利用人體自身的免疫系統來靶向并摧毀癌細胞，屬于一種免疫療法［17］。2017 年FDA 批準了Tisagenlecleucel，這是第一種用于治療復發和難治性B-ALL 的CAR-T 細胞療法［18］。除此之外，靶向治療也逐漸成為研究熱點，最近研究發現一種小分子抑制劑VTP50469，它可以抑制Menin（MEN1）和MLL 的相互作用，進而誘導細胞凋亡。該藥物在MLL-r ALL 患者來源的異種移植模型上顯示出較好療效，有賴于進一步應用于臨床［19］。MLL重排導致與DOT1L、BRD4 和Menin 組裝成獨特的多蛋白復合體［20］。因此，使用DOT1L、溴域、薄荷素和bcl2 的抑制劑進行分子靶向治療均具有較大的潛力。此外，選擇性WD40重復結構域蛋白5（WDR5）降解劑MS67［21］、自噬抑制因子LAMP5 抑制劑［22］、Meis1 與PBX3 的結合抑制劑［23］等均有望用于治療MLL-r ALL，以提高MLL-r ALL 患兒的總體生存率。

綜上，CCLG-ALL 2018 方案治療MLL-r ALL 患兒總體預后較差，患兒容易復發且復發時死亡率較高。重排基因MLL-AF4是影響MLL-r ALL 患兒應用CCLG-ALL 2018方案治療效果的主要不良因素。