胎鼠神經干細胞原代培養及傳代條件優化

朱文豪, 劉天一, 何 川, 張曉宇, 辛 強, 王海峰

（吉林大學第一醫院神經創傷外科，吉林 長春 130021）

目前普遍認為中樞神經元在人出生后短時間便會失去再生能力，成人神經細胞一旦受損死亡便無法更新［1］。研究［2］顯示：成年哺乳動物的側腦室下層和海馬齒狀回區仍可以不斷產生新的神經干細胞（neural stem cells，NSCs），并且這種細胞可以通過遷移對損傷腦組織進行替代和修復。因此，基于神經干細胞移植的治療方法成為研究熱點［3-5］。細胞療法通過在損傷處移植NSCs，實現外源性神經替代。同時移植的NSCs 能夠釋放多種營養因子調節宿主微環境，促進神經再生并減少繼發性損傷，限制宿主星形膠質細胞活化以減少神經膠質瘢痕形成［4，6-7］。研究［8-10］顯示：NSCs 在傳代培養后的活性受培養基成分、生長因子濃度、消化時長和吹打力度等方面的影響，但傳代的細胞密度和傳代時神經球大小對NSCs 活性影響及其作用效果尚未完全闡明。本研究在原代培養NSCs 的基礎上，探討傳代的細胞密度和神經球大小對神經干細胞活性的影響，為優化NSCs 的體外培養條件提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器孕12~14 d SPF級SD 大鼠，無特定病原體動物，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號： SCXK （京） 2021-0006。 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、DMEM/F12 培養基、1%青-鏈霉素混合液、谷氨酰胺和非必需氨基酸（北京索萊寶科技有限公司），B27 神經干細胞培養補充劑、Accutase 消化酶和鈣黃綠素Calcein-AM（美國Gibco 公司），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF） （美國Peprotech 公司），無血清細胞凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司），4%多聚甲醛溶液、兔抗鼠巢蛋白Nestin 抗體和A488 標記的山羊抗兔免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） 二抗（英國Abcam 公司）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Hoechst 33342 （上海碧云天生物技術有限公司）。40 μm 和70 μm 無菌尼龍細胞濾網及CO2培養箱（美國Thermo 公司），激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司），正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 胎鼠NSCs 原代培養胎鼠NSCs 原代分離培養方法參考相關文獻［9，11］并進行改良。采用DMEM/F12 培養基、20 μg·L－1EGF、20 μg·L－1bFGF、2% B27、1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸和1%谷氨酰胺配制NSCs 增殖培養基。取材應用的手術器械洗凈后高壓蒸汽滅菌，然后置于65 ℃烘箱中干燥備用。孕12~14 d SD 大鼠頸椎脫位法處死后采用75%酒精浸泡消毒20 min。將消毒后的大鼠置于相對潔凈的手術臺中剖腹，取出胚胎后轉移至無菌超凈臺中。去除胎膜，剪下胎鼠頭部后PBS 緩沖液洗凈置于冰上備用。以顯微彎鑷插入胎鼠眼眶處固定頭部，顯微剪沿大腦中線剪開新生的薄層顱骨，再用小彎鑷將胎鼠神經節擠壓出，置于盛有PBS 緩沖液的培養皿中。將腦組織表面的雜質洗凈，顯微鑷小心剝離腦組織表面的微血管。全部胚胎處理結束后，將收集的腦組織使用顯微剪剪碎，巴氏管吹打20~30 下，1 mL 移液槍吹打5~10下。將制得的懸液依次過40 μm 和70 μm 細胞篩網。收集細胞懸液于離心管中，1 500 r·min－1室溫離心5 min，加培養基重懸細胞并計數，以1~1.6×105·mL－1的細胞密度接種于T25 或T75 培養瓶中。取培養48~72 h 的細胞， 收集培養液1 500 r·min－1室溫離心5 min， 加入2 mL 的Accutase 消化酶并轉入3.5 cm 培養皿中，于37 ℃的CO2培養箱中消化5~10 min。每隔2 min 取出培養皿于光學顯微鏡下觀察細胞消化情況，直至NSCs 消化完全并均勻分散，加入4 mL 培養基終止消化。收集懸液1 500 r·min－1室溫離心5 min。傳代的細胞加培養基重懸、計數并接種細胞。凍存的細胞加入1 mL 無血清細胞凍存液，重懸后于－80 ℃冰箱凍存，長期保存需轉移至液氮。

1.3 巢蛋白免疫熒光染色鑒定NSCs多聚賴氨酸包被細胞爬片，將24 孔細胞爬片浸泡于多聚賴氨酸溶液中，5~10 min 后用PBS 緩沖液洗滌3 次，超凈臺中室溫晾干備用。取傳代后培養48 h 的NSCs，接種于預先包被多聚賴氨酸細胞爬片的24 孔細胞培養板中，孵育2 h 使細胞貼壁。于培養板中將爬片采用4%多聚甲醛溶液固定30 min 以上，PBS 緩沖液洗滌3 次。0.5% Triton X-100 溶液室溫打孔30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次。5%牛血清白蛋白溶液室溫下封閉1 h 后，滴加兔抗鼠巢蛋白單克隆抗體（1∶100）孵育過夜。PBS 緩沖液洗滌3 次后加入A488 標記山羊抗兔二抗，室溫避光孵育2 h，PBS 緩沖液洗滌3 次。采用含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察NSCs 并進行圖像采集。

1.4 神經球直徑測定取培養第3 代的NSCs，以1.0×104、2.0×104、6.0×104、1.0×105、1.6×105和2.0×105mL－1的細胞密度接種于6 孔細胞培養板中，每孔2 mL 培養液。培養48 h 后形成神經球。采用光學顯微鏡觀察神經球形態表現并進行圖像采集。每個傳代密度重復3個復孔，每個孔內選取隨機3個視野成像。采用Image J 1.47v軟件分析神經球直徑。

1.5 活死細胞染色法檢測神經球中NSCs 存活率取傳代后72 h 的神經球，培養液中加入終濃度5 μmol·L－1鈣黃綠素AM、0.5 g·L－1PI 和5 mg·L－1Hoechst 33342，于室溫靜置10 min。采用倒置熒光顯微鏡觀察并調整焦距后對神經球最大直徑視野進行圖像采集。采用Image J 1.47v 軟件分別對神經球的直徑、該視野下總細胞面積和死細胞面積進行定量分析，計算細胞存活率。細胞存活率=（總細胞面積－死細胞面積）/總細胞面積×100%。

1.6 統計學分析采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析，GraphPad Prism 8.0 軟件繪制圖像。各細胞傳代密度下神經球直徑和細胞存活率均符合正態分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 神經球中NSCs 鑒定培養的NSCs 呈巢蛋白陽性，且直徑約40 μm 神經球中心部分巢蛋白的表達量最高。有少量散在的單個細胞呈巢蛋白陽性，偶爾可見呈巢蛋白陰性的細胞，考慮是由于傳代過程中發生凋亡或貼壁后細胞迅速失去干性所導致的。因此，培養的細胞呈較強的巢蛋白表達，提示培養出的細胞為NSCs。見圖1。

圖1 巢蛋白抗體免疫熒光染色法鑒定神經球中NSCsFig. 1 NSCs in neurospheres identificated by nestin antibody immunofluorescence staining method

2.2 傳代NSCs 形態表現傳代48 h 后NSCs 呈聚集生長趨勢，形成神經球。細胞球大小不均一，直徑為76.41~306.79 μm，平均直徑為（152.72±47.52）μm。NSCs 生長方式呈牢固細胞間黏附聚集模式，球與球之間少有單獨的細胞散在。大部分NSCs 聚集呈圓球形或橢圓球形，也有部分因球與球之間的粘連呈串珠狀。神經球中細胞間連接緊密且縫隙較小，形成緊密的球形結構。見圖2 和3。

圖2 倒置顯微鏡觀察NSCs 傳代培養48 h 后神經球形態表現Fig. 2 Morphology of neurospheres after 48 h of subculture of NSCs observed by inverted microscope

圖3 共聚焦顯微鏡觀察活死細胞染色神經球的形態表現(Bar=20 μm)Fig. 3 Morphology of neurospheres with live-death cell staining observed by confocal microscope(Bar=20 μm)

2.3 不同傳代密度神經球直徑與2.0×104mL－1傳代密度（39.01 μm±12.37 μm） 比較，6.0×104mL－1和1.0×105mL－1傳代密度的神經球直徑（61.99 μm±22.87 μm 和79.72 μm±25.31 μm）增加（P<0.05）；1.0×105mL－1、1.6×105mL－1（86.11 μm±30.00 μm）和2.0×105mL－1（79.69 μm±18.43 μm） 傳代密度的神經球直徑比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 光學顯微鏡觀察不同傳代密度神經球直徑(Bar=200 μm)Fig. 4 Neurosphere diameters at different transmission densities observed by light microscope(Bar=200 μm)

2.4 不同直徑神經球中NSCs 存活率0~40 μm（91.92%±9.69%）、 40~60 μm （87.25%±8.27%）、60~80 μm （78.98%±5.79%） 和80~100 μm 神經球（80.24%±4.93%） 中NSCs 存活率比較差異無統計學意義（P>0.05）。與0~40 μm、60~80 μ m 和80~100 μ m 神經球比較，100~200 μm 神經球中 NSCs 存活率 （65.12%±5.20%）降低（P<0.05）。見圖5。

圖5 不同直徑神經球中NSCs 活性(活死細胞染色，Bar=100 μm)Fig. 5 Activity of NSCs in neurospheres with different diameters(Live-dead cell staining，Bar=100 μm)

3 討 論

原代提取的NSCs 質量受胎鼠的成熟度、干細胞提取分離方法和傳代擴增條件等多個方面的影響，其中首要影響因素為胎鼠發育情況［12］。研究［12-13］顯示：發育早期小鼠的螺旋神經節較發育晚期小鼠含有更多的有絲分裂干細胞，同時在孕10.5~14.5 d 的大鼠宮內提取的胎鼠NSCs 細胞活性增加并達到高峰，并于發育后期細胞活性逐漸減弱。因此，NSCs 原代提取的時機對于保持干細胞活性尤為關鍵。本研究結果顯示：采用孕11~14 d的胎鼠可獲得能夠穩定快速擴增的NSCs，不足孕11 d 胎鼠提取NSCs過少且擴增效率低，超過孕14 d的胎鼠由于發育成熟度較高使獲取的NSCs 聚球和增殖活性較差。此外，在NSCs 提取分離過程中有效地分離出單細胞是提升NSCs 質量的關鍵。研究［9］顯示：采用1 mL 槍頭反復吹打可以使腦組織迅速分散，但過度吹打易使細胞增殖活性減弱。本研究結果顯示：巴氏管吹打20~30 下后1 mL 移液槍吹打5~10 下的分離條件可以在不影響細胞活性前提下高效分離NSCs。

傳代的細胞密度較大程度上決定NSCs 的擴增效率，關于傳代密度的條件尚未完全統一。有學者［10-11，13-15］采用1×105mL－1和2×105mL－1的傳代密度培養5~7 d 消化傳代； 研究［16-17］采用5×105mL－1的傳代密度培養7 d 消化傳代；也有研究［18-19］采用1×106mL－1的傳代密度以機械切割分離球的方式傳代。NSCs 屬于聚團成簇生長類型細胞，細胞在生長過程中會不斷分泌營養物質以保持自身生長的環境。因此，細胞傳代密度會較大地影響NSCs 的生長環境，過少的細胞會在培養過程中因自身營養物質分泌不足而導致生長遲緩，過量的細胞則會因營養物質的缺乏而導致生長受限［20］。本研究結果顯示：當傳代密度大于1×105mL－1時，NSCs 神經球直徑不再隨傳代密度的升高而增加。傳代密度過大時，由于過量細胞導致培養基中營養物質的競爭耗竭，可能出現神經球形成速度減慢的現象。因此，以1×105mL－1的傳代密度進行培養是保持NSCs 活性的最佳傳代培養條件。

神經球直徑是維持干細胞活性的重要方面。NSCs 呈聚集生長的狀態，細胞聚球之后，內部的細胞與外界養分及氣體交換減弱，較大地影響了神經球內部細胞活性。隨著培養時間的延長，神經球內部缺乏氧氣和營養的細胞將大量死亡［9，11，16］。因此，傳代時神經球的直徑直接決定了NSCs 的活性和培養效率。研究［16-17，21］顯示：直徑為100~150 μm、100~200 μm 或200 μm 的神經球可進行細胞傳代。當神經球直徑為150~200 μm 時，神經球球心會出現大量壞死細胞［11］。本研究結果顯示：神經球直徑大于100 μm 時，神經球中心部位會出現細胞死亡的情況。因此，神經球直徑為80~100 μm是傳代的最佳時機，既可以最大程度延長培養時間又不會出現明顯的細胞死亡。

綜上所述，胎鼠的孕期和腦組織吹打分離細胞的方式是高活性NSCs 原代提取的重要因素。傳代的細胞密度和傳代時機直接影響體外培養NSCs 的細胞活性。因此，選擇以1×105mL－1的傳代密度進行種板和傳代時神經球直徑為80~100 μm，可以有效地提高NSCs 傳代培養效率和細胞活性。