魚類病毒(SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV)LAMP聯檢方法的建立和應用

時國強,張 妍,李賀杰,焦義然,張 璜,張 嬋,石 磊,董振國

(1.河北三獅生物科技有限公司,河北 石家莊 050035;2.河北師范大學生命科學學院,河北 石家莊 050024;3.河北科技大學食品與生物學院,河北 石家莊 050018)

0 引言

近年來,我國漁業綜合產值呈持續增長趨勢,2021年全國漁業綜合產值為2.96萬億元,而淡水養殖幾乎占一半,但各種疾病對養殖產業形成較大影響,其中鯉春病毒血癥、錦鯉皰疹病毒病、鯉浮腫病和病毒性神經壞死病嚴重威脅鯉科魚類的養殖和發展,也造成巨大的經濟損失[1-3]。

鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)其基因組由負義單鏈RNA組成,傳播快、宿主范圍廣,可引起急性、出血性傳染病[4-7]。SVCV傳染性強、死亡率極高,發現病魚只能對其進行識別和撲殺[8]。鯉皰疹病毒(cyprinid herpesvirus,CyHV)3型(CyHV-3)為dsDNA病毒,感染可引起高致病性、高傳染性、高死亡率的疾病[9,10]。鯉浮腫病毒(carp edema virus,CEV),是線性雙鏈DNA(dsDNA)病毒,可誘發致死率高達80%以上的鯉浮腫病[11-13]。病毒性神經壞死病病毒(viral nervous necrosis virus,VNNV)是一種神經壞死病毒屬β諾達病毒[14]?，F階段對這4種病毒的診斷方法為PCR/RT-PCR,但操作復雜,不適合基層人員的快速診斷。

隨著集約化養殖迅速發展,這4種病毒的傳播,給鯉科養殖產業造成巨大的經濟損失,而且鯉浮腫病病癥與錦鯉皰疹病毒病癥狀非常相似[15],給防護工作增加了難度,所以一種靈敏度高,準確度高的檢測方法,對該病毒診斷防控是非常重要的。目前PCR是仍精準的基因診斷方法[16,17],然而該方法操作復雜,對儀器和人員要求較高,不適合基層進行快速診斷。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種在恒溫條件下(60℃左右)即可啟動鏈置換DNA合成,并在1 h左右內完成 DNA大量擴增的方法[18]。目前,環介導等溫擴增技術已逐漸步入了產業化、商品化的時代[19,20]。

本研究針對SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的蛋白編碼基因序列各設計3對特異性引物,通過篩選和反應溫度、引物濃度等優化測試,建立一個可以同時檢測以上4種病毒的LAMP檢測方法,為SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的現場快速診斷奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測試質粒DNA

在NCBI中查找4種病毒的基因組序列:SVCV(GenBank: EF593145.1)、CyHV-3(GenBank:MK733802.1)、CEV(GenBank: MF326541.1)和VNNV(GenBank: AY744705.1),用BLAST進行序列比對篩選保守區域,將保守序列交由上海生工進行質粒合成。

1.1.2 主要試劑

Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs公司),甜菜堿(Betaine,Sigma公司),MgCl2(Sigma公司),dNTPs(寶生物工程(大連)有限公司),SYTO-9(life technology公司),LAMP引物(生工生物工程(上海)有限公司),總DNA/RNA提取試劑(河北三獅生物科技有限公司),All-in-one逆轉錄試劑(河北三獅生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器

-80℃凍存柜(thermo fisher scientific),高速臺式離心機(thermo fisher scientific),漩渦混合器(德國IKA公司),微量移液器(德國Eppendorf公司),超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司),熒光PCR儀器ABI7500(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設計

將SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的序列保守區域,使用LAMP Designer軟件設計特異引物,引物交由上海生工合成。各引物序列見表1—表4。

表1 SVCV LAMP擴增的引物序列

表2 CyHV-3 LAMP擴增的引物序列

表3 CEV LAMP擴增的引物序列

表4 VNNV LAMP擴增的引物序列

1.2.2 LAMP引物篩選及反應體系的建立

參考文獻[21]的數據,初步確定25 μL的LAMP反應體系,其成分包括:FIP和BIP各1.6 μM,F3和B3各0.2 μM,FLP和BLP各0.8 μM,20 mM Tris-HCl(pH8.8),10 mM KCl,8 mM MgSO4,10 mM (NH4)2SO4,0.1% Tween20,1 M甜菜堿,6 mM MgSO4,1.6 mM dNTP,8U Bst大片段DNA聚合酶,2 μL核酸。

本研究采用恒溫熒光法進行引物篩選和檢測,具體步驟如下:

1)根據設計的3套引物,分別配制加環引物和不加環引物的引物混合液,在不加環引物的引物混合液中,濃度比為外引物∶內引物=1∶8,在加環引物的引物混合液中濃度比為外引物∶環引物∶內引物=1∶4∶8。

2)試劑配制具體操作如下:先在冰上準備LAMP反應混合液,擴增反應體系如下:12.5 μL反應液RM,8.0 μL超純水DW,0.5 μL SYTO-9,1 μL引物PM,1 μL Bst酶以及2 μL模板(濃度為1 pg/μL)。將除模板外其他試劑配備成混合液混勻后,每管分裝23 μL,加入20 μL密封液后再分別加入2 μL模板。最后參照ABI 7500使用說明書,將混合物置于反應孔中,63 ℃恒溫反應60 min。

1.2.3 LAMP靈敏度和特異性實驗

取SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的濃度為1 ng/μL質粒作為初始濃度,用TE緩沖液10倍梯度稀釋質粒至0.1 fg/μL。用DEPC處理水作為陰性對照(NG),按照1.2.2中的反應體系和步驟進行靈敏度實驗。以鯉春病毒血癥病毒,鯉皰疹病毒,鯉浮腫病毒,病毒性神經壞死病病毒,草魚呼腸孤病毒,虹彩病毒,愛德華氏菌DNA,孢子蟲病,副溶血弧菌,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌,大腸桿菌,鱈魚,馬哈魚,比目魚,鯡魚的基因組作為LAMP反應的模板,用篩選出的LAMP引物作為引物,進行LAMP反應,63 ℃運行60 min,驗證LAMP反應的特異性,利用熒光PCR儀器觀察反應結果。

1.2.4 核酸提取

將收集到的疑似帶有SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV病毒的樣本進行預處理,使用總DNA/RNA提取試劑盒參照試劑盒說明書對樣本進行核酸提取,將提取的核酸進行LAMP檢測。

1.2.5 逆轉錄

將提取的SVCV、VNNV病毒的樣本核酸進行反轉錄,使用All-in-one逆轉錄試劑,參照說明書進行反轉錄,將得到的cDNA進行LAMP檢測。

1.2.6 LAMP樣本檢測實驗

檢測收集的150份含有疑似鯉春病毒血癥病毒(SVCV),鯉皰疹病毒3型(CyHV-3),鯉浮腫病毒(CEV)和病毒性神經壞死病病毒(VNNV)的魚組織樣本核酸。以市售的各熒光定量PCR檢測試劑盒為對照,對建立的4種病毒LAMP檢測方法進行測試。

2 結果與討論

2.1 LAMP引物篩選結果

使用設計的LAMP引物,采用1.2.2的反應體系,反應條件為63 ℃,60 min,每組引物各重復測試2次,進行LAMP引物篩選。實驗結果如下所示:根據實時熒光擴增曲線(圖1)和Ct平均值(表5)對比發現鯉春病毒血癥病毒(SVCV)的引物SVCV1出峰早,且重復性好,故將引物SVCV1作為后續實驗研究;鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)的CyHV-3-1和CyHV-3-2引物重復性好,但CyHV-3-1出峰早,CyHV-3-3的陰性對照有引物二聚體出現,所以篩選引物CyHV-3-1為最合適引物;鯉浮腫病毒(CEV)的引物CEV2出峰最早,故選引物CEV2進行后續實驗研究;病毒性神經壞死病病毒(VNNV)中VNNV1引物出峰早,且重復性好,故選引物VNNV1為最合適引物并進行后續實驗研究。

圖1 SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的不同引物組擴增曲線

表5 不同引物組的Ct值

2.2 LAMP引物靈敏度測試結果

用DEPC處理水作為陰性對照(NG),取SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的濃度為1 ng/μL質粒作為初始模板濃度,用TE緩沖液10倍梯度稀釋模板質粒至0.1 fg/μL進行測試,各梯度模板重復測試3次。結果顯示,SVCV和CyHV-3均可穩定性檢測到10 fg/μL,CEV和VNNV可穩定性檢測到1 fg/μL,見表6。

表6 各梯度的Ct值

表7 各梯度的Ct值

2.3 LAMP特異性測試結果

以鯉春病毒血癥病毒,鯉皰疹病毒,鯉浮腫病毒,病毒性神經壞死病病毒,草魚呼腸孤病毒,虹彩病毒,愛德華氏菌DNA,孢子蟲病,副溶血弧菌,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌,大腸桿菌,鱈魚,馬哈魚,比目魚,鯡魚的基因組作為LAMP反應的模板,使用篩選出的LAMP引物進行測試,63 ℃運行60 min,驗證LAMP反應的特異性。結果顯示,4種病毒所對應的核酸有擴增曲線,其余核酸均沒有擴增結果,證明這4種病毒的引物均具有很好的特異性,如圖2所示。

圖2 4種病毒引物特異性擴增曲線圖

2.4 LAMP樣本檢測實驗結果

使用建立的4種病毒聯合LAMP檢測方法對收集的150份含有疑似SVCV,CyHV-3,CEV和VNNV的魚組織樣本核酸進行測試,以市售的各熒光定量PCR檢測試劑盒平行測試結果為對照。結果顯示SVCV陽性率為32%,CyHV-3陽性率為58%,CEV陽性率為64%,VNNV陽性率為20%,并且兩種檢測方法準確率為100%。

2.5 討論

本實驗在NCBI中查找出所有SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV的全基因組序列,用BLAST進行序列比對,找出序列保守區域,進行LAMP引物的設計,通過LAMP Designer軟件各設計3對引物,并進行實驗篩選,通過對比測試各選出一組擴增效率更高的引物作為后續實驗研究。而且LAMP引物有很好的特異性,通過實驗測試發現設計篩選出的LAMP引物僅對SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV有特異性擴增。為了更全面的檢測,本試驗將鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)、鯉浮腫病毒(CEV)和病毒性神經壞死病病毒(VNNV)4種病毒進行整合,制成聯檢病毒診斷方法。通過實驗發現,4種病毒檢測結果不存在熒光信號干擾,特異性好,靈敏度高,而且LAMP方法適合現場檢測。

隨著我國生活水平的不斷提高,人們對水產品的需求量也在逐年增長,國內的水產養殖隨之得到快速發展。但大規模地發生傳染性疾病,給養殖戶帶來了嚴重的損失[22,23]。鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)、鯉浮腫病毒(CEV)和病毒性神經壞死病病毒(VNNV)有著很強的傳染性,尤其是對鯉科魚類傷害最大[24]?，F在市場上對于這4種病毒的診斷更多的是熒光定量PCR方法,對于儀器、人員要求高,導致成本也高。目前水產養殖過程中無論是SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV都沒有非常有效的治療方法,因此早發現,早防治才是避免以上病毒造成大面積水產死亡的最有效方法。

3 結論

本研究通過采用建立的4種病毒聯合LAMP方法與實時熒光定量PCR方法對比試驗,同時對150份魚組織樣本進行SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV檢測,發現兩種方法測得結果陽性率一致,準確率100%。建立的LAMP方法能準確、高效、快速的在魚組織樣本中檢測出SVCV、CyHV-3、CEV和VNNV,并且LAMP方法對儀器要求低,操作簡單,檢測時間短,非常適合水產養殖現場檢測,對病毒的監測和診斷起到重要作用。