膠質瘤中碳水化合物磺基轉移酶6的表達與臨床預測價值☆

趙北川 宣若恒 楊桂濤 凌耿強 夏之柏

膠質瘤因其高死亡率給社會和家庭均帶來了沉重負擔，識別更好的生物標志物，建立更準確的預后模型在神經膠質瘤的臨床診治中具有十分重要的意義。碳水化合物磺基轉移酶6（carbohydrate sulfotransferase 6，CHST6）作為一種催化硫酸基轉移酶的編碼基因，通過參與子宮內膜癌[1]、甲狀腺癌[2]、腎透明細胞癌[3]的糖酵解途徑，影響腫瘤的侵襲，其高表達與上述腫瘤較差的預后密切相關。同時在GRANT等[4]對437例胰腺癌患者和1922例正常人的全外顯子測序中發現，CHST6在胰腺癌患者中具有罕見的破壞性變異富集。目前，CHST6基因在正常組織和神經膠質瘤，以及不同神經膠質瘤臨床亞型中的表達差異水平及預后作用仍不清楚，本研究旨在分析CHST6基因在神經膠質瘤中的差異表達情況，以及與膠質瘤的預后關系，并探尋膠質瘤可能的新作用靶點，為進一步探尋神經膠質瘤的發展機制及治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象各種神經膠質瘤類型的RNA表達數據和臨床數據來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov)和中國膠質瘤基因組圖譜(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)（http://www.cgga.org.cn/）325和693數據庫。正常樣本RNA表達數據則來自于基因型和基因表達量關聯數據庫（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）中標簽為“Brain”的1152例樣本。

神經膠質瘤樣本納入標準：①行顱腦腫瘤切除術；②病理診斷明確，世界衛生組織（World health organization，WHO）分級為II～IV級的彌漫性膠質瘤。排除標準：①生存狀態及術后生存時間缺失或不完整；②生存期<60 d或隨訪<60 d；③異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變、1號染色體短臂和19號染色體長臂（1p19q）共缺失和O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶（methyl guanine methyl transferase，MGMT）甲基化狀態、性別、年齡或分級信息缺失或不明確。共獲得TCGA數據庫501例樣本、CGGA_325和CGGA_693數據庫共703例樣本。所有樣本將轉錄本定量（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments，FPKM）格式的RNA-seq表達數據轉換為TPM（Transcripts Per Million）格式，其中CGGA_325和CGGA_693 RNA-seq表達數據合并時行批次校正處理。

1.2 統計學方法使用GraphPad Prism 9.4.1軟件行統計分析。用Mann-WhitneyU檢驗對比非正態分布定量變量CHST6在正常樣本與膠質瘤樣本間差異表達情況。

以TCGA數據庫中501例膠質瘤樣本為訓練集，CGGA數據庫中703例膠質瘤樣本為外部驗證集，以TCGA數據庫中CHST6表達值中位數為界限，分為CHST6高表達風險組與低表達風險組，行Kaplan-Meier預后差異分析及外部驗證。并分別做受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，以ROC曲線下面積（area under curve，AUC）值>0.7表示其有較好的辨別能力，分別驗證CHST6在TCGA與CGGA數據庫中對膠質瘤患者1年、3年、5年生存期預測的準確性。

使用R語言survival軟件包，基于單因素和多因素比例風險（Cox）回歸分析TCGA數據庫中CHST6表達量與性別、年齡、WHO腫瘤分級、IDH突變狀態、1p19q共缺失情況和MGMT甲基化狀態等不同臨床特征是否為神經膠質瘤患者的獨立預后因素，檢驗水準α=0.05?；诮Y果構建改進預測模型的列線圖（Nomogram）和預測模型的校準圖（Calibration），以C指數（C-Index）>0.75認為該模型有較好預測效度。以納入CHST6表達量的預測模型為改進模型，未納入CHST6表達量的預測模型為對照模型，以CGGA數據庫為驗證集，帶入TCGA數據庫改進模型與對照模型參數，Bootstrap法比較納入CHST6后，AUC變化情況。

1.3 功能與免疫差異分析使用R語言GSEA軟件包對TCGA數據庫CHST6高低表達組（中位值為界限）行差異基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。通過R語言ClusteProfiler軟件包分別作為基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，獲得差異富集的分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）和細胞成分（cellular component，CC），以及KEGG通路富集情況。

2 結果

2.1 臨床特征本研究納入501例TCGA數據庫和703例CGGA數據庫膠質瘤樣本，臨床特征見表1，1152例GETx數據庫正常樣本。結果顯示，膠質瘤樣本CHST6表達值[TCGA 4.27（2.37，8.73）,CGGA 6.61（3.37,18.17）]較正常樣本[GTEx 1.81（1.32，2.23）]明顯升高（TCGAvs.GTEx，Z=2.457，P<0.001；CGGAvs.GTEx,Z=4.800，P<0.001）。

表1 神經膠質瘤樣本臨床特征分組情況 例

2.2 預后分析Kaplan-Meier分析顯示，CHST6高表達風險組（中位值4.277為界限）在TCGA數據庫和CGGA數據庫中總生存期均較低表達風險組明顯下調（P<0.0001）。見圖1。ROC曲線分析顯示，CHST6在TCGA與CGGA數據庫中對膠質瘤患者1年、3年、5年生存期預測有較好的準確性（TCGA 1年AUC 0.820，3年AUC 0.748，5年AUC 0.760；CGGA 1年AUC 0.724，3年AUC 0.769，5年AUC 0.760）。見圖2。單因素與多因素Cox回歸分析結果顯示，CHST6與年齡、WHO級別、IDH突變狀態、1p19q共缺失等臨床特征共同作為膠質瘤患者的獨立預后因素。見表2。根據多因素Cox回歸分析結果，我們將上述獨立預后因素共同納入預后分析，構建出改進預測模型的列線圖（Nomogram）和預測模型的校準圖（Calibration）（C-Index 0.885，95%CI0.862～0.908）。見圖3、4。納入CHST6表達量的改進模型較未納入CHST6表達量的對照模型有著更高的效度（TCGA改進模型1、3、5年AUC 0.900，0.886，0.850；對照模型AUC 0.874，0.865，0.822；改進模型vs.對照模型d=0.036±0.004，SE=0.002，P=0.007；CGGA改進模型1、3、5年AUC：0.719，0.758，0.752；對照模型AUC：0.663，0.666,0.668；改進模型vs.對照模型d=0.087±0.004，SE=0.002，P=0.001）。見圖5。

圖1 TCGA與CGGA Kaplan-Meier分析曲線 mOS，中位總生存期(median overall survival)；HR，風險比率(hazard ratio)；95%CI，95%置信區間（95% confidence interval）

圖2 TCGA與CGGA ROC分析曲線 TCGA與CGGA ROC模型閾值=4.277，AUC>0.7認為有較好的預測效度

圖3 TCGA數據庫樣本預測模型列線圖

圖4 TCGA數據庫樣本預測模型校準圖 C-index，C指數；Observed OS，觀測生存期；Nomogram-predicted OS，預測生存期。C指數>0.75，表示有著較好的預測效度

表2 TCGA數據庫樣本多因素Cox回歸分析結果

2.3 功能與免疫差異分析GSEA富集分析顯示，CHST6高表達風險組GO主要富集于胞外結構（圖6紅色標記），如含膠原蛋白的細胞外基質、細胞外基質組織、細胞外結構組織、外部封裝結構組織、細胞粘附的正向調節（表3）；KEGG主要富集于PI3KAkt信號通路、神經活性配體-受體相互作用、黏著斑、細胞因子-細胞因子受體相互作用、人乳頭瘤病毒感染（圖7紅色標記，表4），此外還有癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）等通路（圖7紫色標記）。

圖6 TCGA數據庫GSEA GO富集差異分析結果 MF，分子功能（molecular function）；BP，生物學過程（biological process）；CC，細胞成分（cellular component）

圖7 TCGA數據庫GSEA KEGG富集差異分析結果 注：Count，核心基因的數目，值越大，差異富集越顯著；GeneRatio，核心基因（Count）與該GO條目中包含表達數據集中的基因數目（setSize）的比值，值越大，差異富集越顯著；qValue，校準后P值

表3 TCGA數據庫GSEA GO差異富集分析結果

表4 TCGA數據庫GSEA KEGG差異富集分析結果

3 討論

CHST6編碼一種催化硫酸基轉移酶，相關研究認為CHST6通過參與糖酵解途徑，與子宮內膜癌[1]、甲狀腺癌[2]、腎透明細胞癌[3]的預后密切相關。LIU等[5]在對能量代謝基因的研究中發現，CHST6與低級別膠質瘤的預后密切相關。本研究經TCGA與CGGA數據庫Kaplan-Meier分析和ROC曲線分析，證實CHST6對膠質瘤患者預后有較高的預測價值。多因素Cox回歸分析提示，CHST6與年齡、WHO級別、IDH突變狀態和1p19q共缺失情況，共同作為膠質瘤的獨立預后因素，并繪制生存預測列線圖，提示臨床可通過該模型圖，對膠質瘤患者預后進行預判，從而指導臨床盡早展開針對性治療。

糖酵解作為一種成熟的代謝途徑，在癌癥的進展中發揮著重要作用。其中異檸檬酸脫氫酶（IDH）作為參與糖酵解途徑的關鍵限速酶之一，其突變情況是膠質瘤的重要臨床預后特征，相比于IDH野生型，IDH突變型膠質瘤有著更低水平的糖酵解和更好的預后[6-7]。近年來的研究發現，在膠質母細胞瘤中，腫瘤細胞主要通過激活PI3K/AKT信號通路促進腫瘤細胞的有氧糖酵解[7-11]。本研究的GSEA分析結果也顯示，CHST6高表達風險組在PI3K-Akt信號通路有顯著的富集，這提示CHST6可能通過PI3K-Akt信號通路，促進膠質瘤的糖酵解水平，并在臨床特征中表現為更少的IDH突變，從而影響膠質瘤患者的預后。

在本研究的GSEA分析中，CHST6高表達風險組還在神經活性配體-受體相互作用、黏著斑、細胞因子-細胞因子受體相互作用、ECM-受體相互作用中顯著富集。在神經活性配體-受體相互作用中，近年來的研究發現，其中的GABRP與胰腺癌的趨化因子信號、巨噬細胞浸潤和腫瘤進展有關[12]，小膠質細胞和骨髓來源的髓系細胞分泌的CCL5，與NF1相關的低級別膠質瘤（LGGs）生長有關[13]。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是腫瘤微環境中的一個高度活躍的部分，影響腫瘤細胞的行為和轉移能力，對腫瘤的診斷、靶向治療、預后有著重要意義[14-15]。其中，ECM可通過抑制腫瘤細胞死亡和抗原的釋放、感染腫瘤抗原提呈、影響效應T細胞啟動和激活、調節T細胞的遷移，干擾T細胞識別和殺死癌細胞等免疫途徑，導致免疫系統逃逸和腫瘤生長[16]。黏著斑是一種重要的細胞外基質粘附結構，對于細胞的伸展，粘附，遷移和免疫應答都有不可替代的作用，在腫瘤的轉移和侵襲性中具有重要作用[17-18]。以上GSEA分析表明，CHST6在通過PI3K-Akt信號通路促進腫瘤細胞的生長增殖同時，還可能通過神經活性配體的內分泌途徑，促進神經膠質瘤的生長；通過影響ECM和細胞外基質結構如黏著斑，促進膠質瘤的生長和免疫系統逃逸。

綜上所述，本研究揭示了CHST6的高表達與神經膠質瘤患者的預后不良相關，并制作出的風險因素預后列線圖。此外，本研究還對CHST6造成神經膠質瘤患者不良預后的可能通路進行分析，表明CHST6可能作為神經膠質瘤免疫治療的潛在靶點。但CHST6作用于糖酵解的調控機制、與膠質瘤相關通路的作用機制仍需進一步在膠質瘤細胞系及腫瘤樣本中驗證。