牙齦卟啉單胞菌通過上調HIF-1α抑制食管鱗癌細胞鐵死亡*

郭 苒, 石林林, 程月月, 陳 攀, 朱巧晴, 杜玉博, 伍當柔, 齊義軍, 高社干△

1河南科技大學第一附屬醫院(臨床醫學院),腫瘤醫院,河南省微生態與食管癌防治重點實驗室,河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室,洛陽 471003 2河南科技大學基礎醫學與法醫學院,洛陽 471023

食管癌位居全球惡性腫瘤發病率的第7位,2020年全世界新發食管癌病例約60.4萬人,其中一半以上來自中國[1-2]。在我國,食管鱗狀細胞癌(食管鱗癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌的主要組織學亞型,占所有食管癌病例的90%以上[3]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭氏陰性厭氧菌,是牙周病的關鍵致病菌,可誘發口腔微生態失衡,造成牙周炎和牙齒缺失,與多種疾病的發生發展密切相關[4-6]。流行病學研究表明,中國食管癌高發區林州市牙齒缺失居民的ESCC發生風險顯著升高[6]。還有研究報道,河南食管癌高發區ESCC患者食管癌組織P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織,該研究認為P.gingivalis富集與ESCC侵襲轉移等惡性演進顯著相關,是ESCC預后的獨立危險因素之一[7]。另有研究表明,P.gingivalis感染ESCC細胞后,能夠顯著增加ESCC細胞對順鉑、紫杉醇等化療藥物抵抗,并降低化療藥物作用后ESCC細胞的凋亡率[8]。

與壞死、凋亡等不同,鐵死亡是亞鐵離子依賴性,由脂質過氧化物堆積導致的一種新型細胞死亡方式[9-10]。雖然凋亡是化療藥物引發腫瘤細胞死亡、降低腫瘤負荷的主要方式,但是,化療藥物也能誘導腫瘤細胞發生鐵死亡,并與化療耐藥關系密切[11]。在大腸癌[11]、胃癌[12]、胰腺癌[13]、肺癌[14]、三陰性乳腺癌[15]等多種惡性腫瘤中,鐵死亡誘導劑與抗腫瘤藥物的聯合作用,能夠通過多種方式殺傷癌細胞,更高效地清除癌細胞。缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一種具有轉錄活性的核蛋白,是介導缺氧狀態下腫瘤細胞適應性調節的因子之一。HIF-1α可通過促進糖酵解來增加腫瘤細胞的能量供應,從而促進腫瘤細胞的增殖[16]?，F有研究已表明,HIF-1α是調節鐵死亡的關鍵蛋白之一[17-19]。然而,鐵死亡在ESCC發生發展過程中的作用及機制,尤其是P.gingivalis感染對其的影響,目前尚不清楚。因此,本研究主要探討P.gingivalis感染對ESCC細胞鐵死亡的影響,以及HIF-1α抑制劑與鐵死亡誘導劑聯用對P.gingivalis感染陽性ESCC的治療效果。

1 材料與方法

1.1 食管鱗癌樣本來源

94例ESCC組織樣本來自河南科技大學第一附屬醫院食管腫瘤外科接受初次手術治療的ESCC患者,所有ESCC患者術前均未接受放化療,手術切除樣本經病理學診斷為食管鱗狀細胞癌,收集到的所有樣本均用于免疫組化染色分析,并經過河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 免疫組化實驗

應用PV-9000試劑盒(中杉金橋)進行組織P.gingivalis、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和HIF-1α表達水平的免疫組化檢測。94例ESCC組織進行包埋、切片、烤片、脫蠟、水化,EDTA抗原修復液于100℃進行抗原修復20 min,冷卻至室溫后,分別加入鼠抗P.gingivalis(1∶100,ANT0085,DIATHEVA)、兔抗GPX4(1∶100,ab125066,Abcam)、兔抗HIF-1α(1∶100,ab51608,Abcam)等一抗4℃孵育過夜,抗鼠/兔二抗孵育1 h,DAB顯色,蘇木精復染。根據切片中胞質及胞核著色的陽性細胞數和著色強度進行免疫組化綜合評分,每張切片隨機選取5個視野(×200),用Image J進行定量分析,計算每個視野陽性染色的百分比,評估P.gingivalis、GPX4和HIF-1α表達的陽性率。

1.3 食管鱗癌細胞和牙齦卟啉單胞菌培養

ESCC細胞KYSE30和KYSE70由河南科技大學第一附屬醫院腫瘤表觀遺傳實驗室保存,復蘇后用含10% FBS(164210,Procell)的RPMI-1640(PM150110,Pricella)培養液于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養,細胞生長至80%～90%融合度時傳代,取對數生長期細胞進行后續實驗。P.gingivalis33277來源于美國標準菌株庫ATCC,培養于含5% CO2、10% H2和85% N2的37℃厭氧培養箱中18～24 h后,取對數生長期的菌液(1×109CFU/mL,A600nm=1.5,以MOI 20感染ESCC細胞),12000 r/min、4℃離心5 min,棄去上清,PBS重懸,感染細胞。

1.4 細胞活力、細胞內丙二醛及活性氧水平測定

將對數生長期的KYSE30和KYSE70細胞接種至96孔板或10 cm細胞培養皿中,待細胞貼壁后,感染P.gingivalis,加入鐵死亡誘導劑RSL3 2.5 μmol/L(1219810-16-8,MCE)和(或)HIF-1α抑制劑LW6 10 μmol/L(934593-90-5,MCE)及鐵死亡抑制劑Ferrostain-1 60 nmol/L(347174-05-4,MCE)至各實驗終止時(12 h或24 h)檢測細胞活力,每孔加入10 μL CCK-8溶液(Invigentech),孵育2 h,酶標儀測定450 nm處的吸光度(A450nm),按公式計算細胞活力:細胞活力(%)=(A加藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。根據丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(BC0025,Solarbio)和活性氧(reactive oxygen,ROS)檢測試劑盒(S0033S,碧云天)說明書檢測并計算細胞內MDA和ROS含量。在前述分組基礎上,進一步添加順鉑30 μmol/L(Cisplatin,P4394,Sigma)作為陽性對照,進行上述細胞功能評估。

1.5 平板克隆實驗

取對數生長期的ESCC細胞,以500個/孔接種于6孔板中,待細胞貼壁,經P.gingivalis感染24 h后使用RSL3和(或)LW6處理,于37 ℃、5% CO2條件下持續培養14 d,棄去培養液,PBS洗滌3次,4%甲醛固定1 h,結晶紫染液染色30～60 min,PBS洗去多余染料,晾干,拍照后計數細胞克隆數。

1.6 Western blot實驗

取對數生長期的細胞,以3×105個/皿接種于細胞培養皿中,待細胞貼壁后,經P.gingivalis感染處理24 h,使用RSL3或LW6處理24 h后終止實驗,RIPA裂解緩沖液裂解細胞、提取蛋白,BCA法測定蛋白質濃度。SDS-PAGE分離蛋白,電轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,分別孵育一抗GPX4(1∶1000,ab125066,Abcam)、HIF-1α(1∶1000,ab51608,Abcam)和GAPDH(1∶2500,CW0100 M,康為世紀)和相應二抗(1∶5000),ECL曝光顯示目的蛋白條帶,以GAPDH為參照對目的蛋白的表達進行定量。

1.7 qRT-PCR檢測

取對數期生長的ESCC細胞,分組處理后,以Trizol(15596026,Invitrogen)提取總RNA,按HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(R211,Vazyne)操作說明,反轉錄合成cDNA,用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111,Vazyne)進行PCR,檢測HIF-1α及其靶基因脂肪酸結合蛋白3(FABP3)、脂肪酸結合蛋白7(FABP7)的mRNA水平,用2-ΔΔCt方法計算每個基因的相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.8 免疫熒光實驗

將對數生長期的ESCC細胞以8×103個/皿接種于共聚焦培養皿中,以P.gingivalis感染24 h,洗滌、甲醛固定、透化、封閉,孵育HIF-1α一抗(1∶100,ab51608,Abcam)和熒光標記的二抗,DAPI復染細胞核,共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.9 動物實驗及分組

取6～8周齡BALB/c-nu雄性裸鼠(北京維通利華),體重18～20 g,共34只。于裸鼠右側后背部皮下接種經P.gingivalis以MOI 20感染24 h和未感染的KYSE70細胞(3×106/只),皮下荷瘤長至100 mm3后,分為對照組、P.gingivalis感染組、RSL3組、P.gingivalis和RSL3聯合處理組、P.gingivalis和RSL3及LW6聯合處理組,每組6只。RSL3處理組及LW6處理組按同等劑量采取腹腔注射(50 mg/kg,溶劑為40% PEG300),一周2次,每次100 μL;聯合處理組相應藥物給藥方式同上所述,28 d實驗終止。實驗過程中測量腫瘤大小(最大長徑a和最小短徑b),實驗終止時剝離瘤體稱重并計算瘤體體積(a×b2/2)。

1.10 統計學方法

用SPSS 26.0和Graphpad Prism軟件進行數據統計分析,檢驗水準α=0.05。實驗數據以均數±標準差表示,Western blot與PCR結果的差異分析采用t檢驗,P.gingivalis豐度和HIF-1α蛋白表達的相關性分析采用卡方檢驗,實驗終點的腫瘤生長曲線采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 P.gingivalis抑制食管鱗癌細胞發生鐵死亡

為研究P.gingivalis感染對ESCC細胞鐵死亡過程的影響,本研究首先對KYSE30和KYSE70細胞進行P.gingivalis感染,然后加入鐵死亡誘導劑RSL3處理,通過CCK-8檢測不同處理組的細胞活力。結果顯示,P.gingivalis感染顯著促進KYSE30和KYSE70細胞增殖;RSL3處理顯著抑制KYSE30和KYSE70細胞增殖,加入鐵死亡抑制劑Ferrostain-1后,RSL3對ESCC細胞的增殖抑制作用減弱;P.gingivalis感染也可顯著降低RSL3對ESCC細胞的增殖抑制作用(均P<0.05,圖1A、1B)。

1:Uninfected;2:P.gingivalis;3:RSL3;4:RSL3+P.gingivalis;5:RSL3+Ferrostain-1;6:positive control;A:CCK-8檢測細胞活力;B:平板克隆實驗檢測細胞增殖;C:化學法檢測細胞中MDA含量;D:流式細胞術檢測細胞ROS含量;E:Western blot檢測細胞蛋白表達水平;F:免疫組化實驗檢測ESCC組織中GPX4的表達(×200);*P<0.05,**P<0.01

檢測ESCC細胞經P.gingivalis和(或)RSL3處理后鐵死亡的標志性代謝產物MDA(圖1C)和ROS(圖1D)含量的變化。結果表明,RSL3處理KYSE30和KYSE70細胞后,細胞內MDA和ROS含量顯著升高;P.gingivalis感染后,接受RSL3處理的KYSE30和KYSE70細胞中MDA和ROS含量降低(均P<0.05,圖1C、1D)。Western blot結果表明,與RSL3單獨處理組相比,P.gingivalis感染可顯著升高KYSE30和KYSE70細胞中鐵死亡核心調控蛋白GPX4的蛋白表達水平(圖1E),提示P.gingivalis對ESCC細胞鐵死亡起抑制作用。免疫組化檢測ESCC組織中GPX4蛋白表達,發現P.gingivalis感染的ESCC組織中GPX4蛋白表達也增高(P<0.05,圖1F)。

2.2 P.gingivalis感染上調食管鱗癌中HIF-1α的表達水平

免疫組化結果顯示,P.gingivalis感染陽性(40.4%,38/94)的ESCC組織樣本中HIF-1α表達陽性率顯著升高(78.9%,30/38),且P.gingivalis感染陽性與ESCC組織中HIF-1α高表達陽性率顯著相關(χ2=13.2,P<0.01)(圖2A)。接下來,分別從基因和蛋白水平檢測了P.gingivalis感染KYSE30和KYSE70細胞后HIF-1α的表達情況。結果顯示,P.gingivalis感染顯著提高KYSE30和KYSE70細胞中HIF-1α的表達水平(圖2B、2C)。此外,免疫熒光結果顯示P.gingivalis感染可顯著促進ESCC細胞核周HIF-1α的聚集(圖2D)。進一步通過qRT-PCR檢測P.gingivalis感染對KYSE30和KYSE70細胞HIF-1α下游靶基因表達的影響。結果顯示,P.gingivalis感染可顯著提高HIF-1α下游靶基因FABP3和FABP7的mRNA表達水平(圖2E)。

A:免疫組化檢測P.gingivalis高、低豐度ESCC組織中HIF-1α表達情況(×200);B:qRT-PCR檢測ESCC細胞感染P.gingivalis后HIF-1α mRNA表達量變化;C:Western blot檢測ESCC細胞感染P.gingivalis后HIF-1α蛋白表達量變化;D:免疫熒光檢測ESCC細胞感染P.gingivalis后細胞中HIF-1α分布變化;E:qRT-PCR檢測ESCC細胞感染P.gingivalis后HIF-1α靶基因FABP3和FABP7的表達情況;*P<0.05,**P<0.01

2.3 HIF-1α介導P.gingivalis誘導的ESCC細胞鐵死亡抗性

為明確HIF-1α在P.gingivalis感染的KYSE30和KYSE70細胞發生鐵死亡過程中的作用,本研究首先用HIF-1α抑制劑LW6單獨處理ESCC細胞,發現LW6能夠明顯抑制HIF-1α蛋白表達;而與LW6單獨處理組相比,P.gingivalis感染聯用LW6組的HIF-1α蛋白表達未見明顯上調(圖3A)。進一步,與P.gingivalis+RSL3處理組相比,同時應用HIF-1α抑制劑LW6聯合處理后,ESCC細胞活力降低,MDA水平升高,說明LW6能夠抑制P.gingivalis感染所誘導的細胞增殖,同時降低鐵死亡抗性(圖3B～3D)。

1:Uninfected;2:P.gingivalis;3:RSL3;4:RSL3+P.gingivalis;5:RSL3+LW6;6:RSL3+LW6+P.gingivalis;7:Cisplatin;8:Cisplatin+P.gingivalis;9:Cisplatin+LW6;10:Cisplatin+LW6+P.gingivalis;A:Western blot檢測HIF-1α的蛋白表達水平;B:CCK-8檢測細胞活力;C:平板克隆實驗檢測細胞增殖;D:化學法檢測細胞MDA含量;E:Western blot檢測GPX4蛋白表達;F:P.gingivalis感染對順鉑作用的影響;*P<0.05,**P<0.01

Western blot結果顯示,在P.gingivalis感染基礎上,LW6和RSL3聯合使用較RSL3單獨處理組GPX4蛋白的表達量降低,提示LW6處理可逆轉P.gingivalis感染誘導的ESCC細胞鐵死亡抗性(圖3E)。與文獻報道一致[12],P.gingivalis感染可以降低順鉑對ESCC細胞的敏感性,而同時使用LW6可靶向抑制HIF-1α進而改善P.gingivalis誘導的鐵死亡抗性,從而增強順鉑對ESCC細胞的殺傷作用(圖3F)。

2.4 P.gingivalis感染影響HIF-1α表達抑制RSL3抗腫瘤療效的體內實驗

為了進一步在體內驗證P.gingivalis感染上調HIF-1α從而抑制ESCC細胞鐵死亡的作用,本研究采用經P.gingivalis感染的KYSE70細胞建立裸鼠皮下荷瘤模型,再分別給予RSL3單獨或聯合LW6處理。

結果表明,與對照組相比,P.gingivalis感染可顯著促進荷瘤小鼠腫瘤體積的增長[(582.0±16.1)mm3vs.(881.0±14.7)mm3,P<0.05];與RSL3單獨處理[(456.0 ±8.3)mm3]相比,P.gingivalis感染能夠降低RSL3的抑瘤作用[(508.0±14.8)mm3],上述作用可被LW6聯合作用[(315.0±12.4)mm3]顯著抑制(圖4)。

3 討論

P.gingivalis是ESCC發生、發展過程中的重要危險因素之一[7]。研究提示,ESCC組織中P.gingivalis豐度與腫瘤淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期和總生存期縮短呈顯著正相關[7-8]。新輔助放化療聯合食管切除是可手術切除ESCC患者首選的治療方式,患者生存獲益優于單純手術治療[20-21]。多烯紫杉醇、順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前臨床常用的ESCC化療藥物,大部分初治的ESCC患者對這些化療藥物敏感,但化療過程中發生的化療耐藥導致超過70%的ESCC患者治療失敗,5年生存率低于30%[22-23]。P.gingivalis感染KYSE30細胞后,通過STAT3激活Caspase 3,降低了紫杉醇、5-Fu和順鉑誘導的KYSE30凋亡發生率,表明P.gingivalis感染降低了ESCC細胞對化療藥物的敏感性,進而誘導化療耐藥。P.gingivalis陰性ESCC患者總生存期>60個月,而P.gingivalis陽性患者僅為26個月[8]。此外,P.gingivalis還可通過調控溶質運載蛋白7家族成員11來促進P.gingivalis在胞內的定植,從而促進ESCC細胞的增殖[24]。因此,P.gingivalis刺激的ESCC細胞增殖和抗凋亡能力增強是ESCC患者預后不良的重要危險因素。

鐵死亡具有特征性的形態學、生化特征和分子學基礎,是與凋亡、壞死和自噬不同的細胞死亡方式,且凋亡、壞死和自噬的小分子抑制劑不能阻斷鐵死亡的發生,鐵死亡為腫瘤的治療提供了新的選擇[9]。多數的化療藥物是通過誘導腫瘤細胞發生凋亡清除腫瘤細胞,而順鉑不僅能夠誘導A549和HCT116細胞凋亡,還能降低胞內谷胱甘肽含量和滅活谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs),誘導這兩種癌細胞發生鐵死亡[11]。一些小分子化合物如Erastin和RSL3通過抑制胱氨酸-谷氨酸交換系統Xc-或GPX4誘導細胞發生鐵死亡[9-11,25]。本研究表明,P.gingivalis感染ESCC細胞后,細胞內ROS和MDA降低,GPX4表達升高,進而降低RSL3誘導的KYSE30和KYSE70細胞鐵死亡,提示P.gingivalis可能通過多種機制與感染的宿主細胞共存,促進腫瘤進展。

低氧廣泛存在于細胞和組織中,尤其是腫瘤組織中,缺氧誘導因子(HIF)是細胞感受和適應組織低氧的重要機制之一。HIF包括HIF-1α、HIF-2α及HIF-3α,其中HIF-1α的表達受氧含量調節[26]。由于惡性腫瘤生長迅速,惡性腫瘤組織長期處于低氧狀態,為了適應低氧環境,HIF-1α在多種不同類型的惡性腫瘤細胞中表達增加[27]。HIF-1α能夠誘導多種血管生長因子的表達,如血管內皮生長因子和血管生成素1/2[28],促進腫瘤血管形成。缺氧狀態下,ESCC細胞中HIF-1α表達增加,繼而促進葡萄糖轉運蛋白-1及己糖激酶-Ⅱ等糖酵解相關酶表達,表明HIF-1α能夠通過促進糖酵解來增加腫瘤細胞的能量供應,促進腫瘤細胞的增殖[29]。有研究證實,HIF-1α表達下調可以促進RSL3誘導的鐵死亡過程[18]。且在缺氧條件下HIF-1α誘導的FABP3和FABP7表達對脂質儲存至關重要[30],與細胞膜的脂質過氧化有關。另有研究表明,P.gingivalis感染能夠干擾牙膜周細胞中糖酵解和三羧酸循環通路相關基因的表達,并降低脯氨酸羥化酶2(prolyl hydroxylase 2,PHD2)和核轉錄因子紅系2相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)表達,抑制PHD2依賴的HIF-1α降解。本研究結果證實,P.gingivalis誘導ESCC細胞中HIF-1α表達上調,介導鐵死亡抗性產生,HIF-1α抑制劑LW6能夠逆轉P.gingivalis誘導的ESCC細胞鐵死亡抗性,提示HIF-1α是克服ESCC耐藥的潛在靶點分子。

綜上所述,本實驗證實P.gingivalis可通過上調ESCC中HIF-1α的表達,介導ESCC細胞鐵死亡抗性發生,抑制HIF-1α能夠恢復P.gingivalis感染的ESCC細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性,是克服ESCC多重耐藥的潛在靶點分子。