缺氧腫瘤細胞來源的外泌體miR-182通過調節PTEN的m6A修飾促進前列腺癌紫杉醇耐藥*

周 艦, 程 耿, 戚曉紅, 張朝陽

武漢市第三醫院泌尿外科,武漢 430060

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一[1]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一種紫杉烷類抗癌藥物,已廣泛應用于PCa的治療,但對其耐藥導致的預后不佳仍是臨床上的一個重要挑戰[2]。

目前的研究認為,缺氧是腫瘤微環境中的一個關鍵促癌因素,缺氧環境可以影響外泌體的釋放,缺氧腫瘤細胞來源的外泌體中攜帶的RNA已被證明是調節腫瘤生物學和重塑腫瘤微環境的重要因素[3]。此外也有研究表明,缺氧腫瘤細胞外泌體能夠促進PCa細胞的存活[4],但其具體機制尚不明確。以往研究表明miR-182的過度表達能夠促進PCa細胞的增殖、集落形成并抑制凋亡[5-6]。

新近研究發現PCa組織和細胞系中脂肪和肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)表達下調,m6A水平增加,而該表達失調與PCa進程顯著相關[7]。磷脂酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)在腫瘤細胞生長、凋亡、粘附、浸潤及遷移等方面發揮重要作用,其水平升高能夠抑制PCa進展[8]。另外PTEN被發現能夠增強PCa細胞對PTX的敏感性,并促進PTX誘導的細胞凋亡[9]。

本研究旨在闡明缺氧腫瘤細胞外泌體在PCa中的作用及其機制,為了解PCa耐藥的分子機制提供數據支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

經STR鑒定正確的人前列腺癌DU145細胞及人正常前列腺上皮細胞RWPE-1均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。RPMI l640培養液、EDTA溶液、胰蛋白酶購自上海雅心生物技術有限公司;免疫磁珠購自德國美天旎公司;轉染用載體及lipofectaminTM3000購自Invitrogen公司;外泌體分離及純化試劑盒均購自上海翌圣生物公司;雙熒光素酶報告基因試劑盒購自Promega公司;Trizol試劑盒、MTT溶液、Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒購自北京索萊寶公司;紫外-可見光分光光度計購自上海美析儀器有限公司;過表達質粒及其siRNA干擾質粒、各自對照產物均由上海吉瑪基因公司設計并合成。

1.2 生物信息學分析方法

借助NCBI網站的GEO數據庫查詢PCa相關芯片,借助在線分析工具GEO2R對數據進行分析。差異篩選條件設置為adj.P.Value<0.05和|LogFoldChange|>1,limma package用于差異分析,ggplot2繪制表達火山圖,heatmap package繪制熱圖。Targetscan網站(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測與miRNA存在結合位點的基因。Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)用于預測基因的RNA結合蛋白(RNA binding protein)。Disgenet網站(https://www.disgenet.org/home/)查找Malignant neoplasm of prostate(C0376358)疾病風險基因。借助在線Venn工具(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html)取預測結果交集,通過DAVID網站(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)代謝途徑分析。GSCALite網站(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)用于基因對藥物敏感性的預測。以UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數據庫對基因在PCa中的表達進行預測。SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp/)用于尋找基因的m6A甲基化修飾位點。

1.3 臨床資料與組織樣本獲取

選取2019年1月至2020年6月收治于本院腫瘤科與泌尿外科的PCa患者52例(PCa組),患者均于PCa根治術前行造影檢查,患者組織活檢后均經2名以上病理學專家確診為PCa?；颊呔鶠槟行?年齡51～79歲,中位年齡68歲。納入標準:①臨床資料完整且均簽署知情同意書;②患者均為初次進行診療;③既往無其他惡性腫瘤史也未接受過抗腫瘤治療。排除標準:①有嚴重心肝腎功能障礙的患者;②合并系統性疾病;③患有自身免疫性疾病的患者。另選取50例因良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)行電切手術的患者(Control組),患者均為男性,年齡49～79歲,中位年齡65歲。PCa組與Control組患者均于術后留取組織?；颊呓M織經切除后立即置于凍存管中,并用液氮轉移至-80℃條件下保存。本研究經我院倫理委員會審核批準。

1.4 細胞培養與PTX耐藥細胞系建立

人前列腺上皮細胞系RWPE-1在添加有0.05 mg/mL BPE、5 ng/mL EGF生長因子和1% P/S(青鏈霉素合劑)的K-SFM培養液中培養。DU145細胞在補充有10% FBS和1% P/S的Ham’s F-12 K培養液中培養。所有的細胞均在含5% CO2的加濕培養箱中培養。將處于對數生長期的DU145細胞分為常氧細胞外泌體組和缺氧細胞外泌體組,常氧細胞置于20% O2、37℃、5% CO2中進行培養。缺氧條件設置為1% O2、37℃、5%CO2,細胞處理48 h后進行后續實驗。通過逐步增加培養液中PTX的濃度獲得PTX耐藥(PTX resistance,PR)[10]的DU145細胞(DU145/PR)。

1.5 外泌體的分離、純化和鑒定

收集常氧和缺氧條件處理的細胞并轉移至EP管,以12000 r/min離心后收集上清,添加外泌體提取試劑,混勻后轉移至4℃條件下靜置2 h。隨后再次離心1 h,收集沉淀,用1×PBS吹打沉淀產物,25000 r/min離心2 min后棄去沉淀,保留上清。采用3 kD超濾管再次將上清進行30000 r/min離心,30 min后即可獲得純化后的外泌體顆粒,隨后借助0.22 μm的濾器進行過濾除菌。采用透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察外泌體形態,蛋白免疫印跡(Western blot)檢測CD63、CD9、CD81的表達。

1.6 細胞轉染與共培養

取耐藥培養后的第3代對數生長期細胞,采用胰蛋白酶消化,轉染前24 h用無血清培養液培養,采用LipofectamineTM3000轉染試劑將oe-FTO-NC(過表達FTO陰性對照載體)、oe-FTO(過表達FTO載體)、si-FTO-NC(敲減FTO陰性對照載體)、si-FTO(敲減FTO載體)、oe-PTEN-NC(過表達PTEN陰性對照載體)、oe-PTEN(過表達PTEN載體)、mimic-NC(miR-182 mimic陰性對照載體)、miR-182 mimic(轉染miR-182 mimic載體)、inhibitor-NC(轉染miR-182-inhibitor陰性對照載體)、miR-182-inhibitor(轉染miR-182-inhibitor)分別或聯合轉染至細胞。6 h后更換培養液,在37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續進行培養48 h。將1×105個各轉染組的細胞與約150 μL的外泌體懸液共培養48 h,進行后續功能實驗,另將等量PBS與各轉染組細胞共培養作為對照組。

1.7 qRT-PCR實驗

收集PCa組患者前列腺癌組織及對照組正常增生前列腺組織各約100 mg,生理鹽水沖洗,借助Trizol試劑提取組織中的總RNA,紫外分光光度計測量吸光度以檢測RNA純度,以總RNA為模板借助反轉錄試劑盒合成cDNA,隨后以cDNA為模板按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。反應體系及反應條件均依據試劑盒說明書進行。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平,miRNA以U6為內參,其余目的基因以GAPDH為內參,詳細引物序列見表1。本方法同樣適用于細胞檢測。當檢測對象為外泌體時,借助外泌體RNA分離試劑盒提取常氧PCa細胞外泌體及缺氧PCa細胞外泌體中的總RNA,其余操作相同。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 免疫印跡實驗(Western blot)

組織和細胞用RIPA消化,BCA試劑盒測定蛋白質濃度。裂解物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳分離,然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。5%的脫脂牛奶封閉膜以抑制非特異性結合,2 h后在4℃條件下添加以下檢測抗體孵育過夜:抗FTO(1∶10000)、抗PTEN(1∶1000)、CD63(1∶1000)、CD9(1∶1000)、CD81(1∶1000;)。次日洗滌后,用山羊抗兔IgG(1∶2000)作為第二抗體進一步孵育膜2 h。根據制造商的說明,使用ECL Western blot檢測試劑盒對蛋白質條帶進行可視化,并通過Quantity One 4.6.2分析軟件對蛋白條帶的灰度進行量化,目的蛋白與內參蛋白(GAPDH)條帶灰度值比值作為蛋白的相對表達量。

1.9 m6A RNA甲基化定量及MeRIP檢測

根據制造商的說明,用EpiQuik m6A RNA甲基化定量試劑盒測量提取的RNA的總m6A水平。使用polyA SpinTM純化mRNA后根據Magna MeRIPTMm6A試劑盒的說明進行MeRIP檢測。將mRNA片段化為大約100 nt的寡核苷酸。將Magna ChIP蛋白A/G磁珠與m6A特異性抗體(anti-FTO,1∶10000)在免疫沉淀緩沖液中于室溫下孵育1 h。然后將混合物與MeRIP反應混合物在4℃下孵育過夜。洗脫的RNA用于qRT-PCR分析,后續操作同1.7部分。

借助放線菌素D檢測RNA穩定性,用5 μg/mL放線菌素D處理細胞以抑制轉錄。然后分別在0、2、4、8 h時收集細胞。使用qRT-PCR檢測mRNA水平。

1.10 雙熒光素酶報告基因實驗

借助Targetscan預測miR-182與FTO之間的相互作用位點,構建熒光素酶報告質粒,pmirGLO-FTO-WT(FTO-WT)和pmirGLO-FTO-MUT(FTO-MUT)。將含有miR-182結合位點的FTO 3′UTR克隆到pmirGLO載體中。同樣,將含有miR-182突變結合位點的FTO 3′UTR結構域插入pmirGLO載體以構建FTO-MUT。HEK-293T細胞接種至96孔板中,每孔1×105個細胞。根據制造商的說明,借助LipofectaminTM3000將miR-182 mimic(模擬物)與mimic-NC(miR-182 mimic模擬物陰性對照)轉染至細胞。24 h后使用雙熒光素酶報告基因系統進行檢測。熒光密度由微板閱讀器定量,以海腎熒光素酶作為對照熒光素酶報告基因,將其進行歸一化處理。

1.11 MTT實驗檢測PTX藥物敏感性

將1×104個DU145/PR細胞接種在96孔板中,用不同劑量的PTX(0～300 nmol)處理細胞24 h。隨后添加MTT繼續培養4 h。去除培養上清液后,加入200 μL DMSO溶解。使用微板閱讀器在490 nm波長下檢查吸光度值。借助相對生存曲線確定IC50值。

1.12 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。DU145/PR用100 nmol PTX暴露24 h后用PBS清洗,結合緩沖液重懸,避光加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色10 min,5 μL PI染色5 min。使用流式細胞儀對凋亡細胞進行分析。

1.13 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件分析本研究中數據。計量資料以平均值±標準差表示,兩組間均數比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組內兩兩比較使用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧腫瘤細胞外泌體促進PCa細胞PTX耐藥

如圖1A所示,TEM結果顯示常氧和缺氧條件下培養的腫瘤細胞外泌體呈盤狀囊泡結構,Western blot結果證實外泌體標記物CD9、CD81、CD63在常氧細胞外泌體和缺氧細胞外泌體中均有表達,但缺氧細胞外泌體中CD9、CD81、CD63的表達水平較常氧細胞外泌體組更高(均P<0.05)(圖1B),提示缺氧增強了PCa細胞外泌體的分泌。PTX毒性檢測結果顯示,DU145/PR細胞對PTX的敏感性變低,PTX半數抑制濃度較DU145組細胞顯著升高,提示PTX耐藥細胞模型構建成功(圖1C)。為了明確缺氧細胞外泌體對常氧PCa細胞的影響,本研究用PBS、常氧和缺氧細胞外泌體處理DU145/PR細胞。如圖1D所示,在不同濃度的PTX處理后,常氧和缺氧細胞外泌體明顯提高了DU145/PR細胞的存活率和PTX的半數抑制濃度,且缺氧外泌體組細胞存活率和PTX半數抑制濃度更高(均P<0.05)。此外,細胞凋亡實驗結果顯示(圖1E),與PBS組相比,常氧和缺氧細胞外泌體組細胞凋亡減少且缺氧細胞外泌體組細胞凋亡率更低(均P<0.05),而以上變化均能被外泌體抑制劑GW4869部分挽救(均P<0.05)。以上結果表明,缺氧PCa細胞分泌的外泌體能夠促進PCa細胞的PTX耐藥。

A:TEM觀察外泌體形態;B:外泌體標志蛋白CD63、CD9、CD81的表達檢測結果;C:PTX耐藥細胞模型(DU145/PR)鑒定結果;D:PTX處理后各組細胞存活率和各組細胞的PTX半數抑制濃度檢測結果;E:各組細胞凋亡率;1:DU145/PR+PBS組;2:DU145/PR+常氧細胞外泌體組;3:DU145/PR+缺氧細胞外泌體組;4:DU145/PR+缺氧細胞外泌體+GW4869組;與常氧細胞外泌體組比較,**P<0.01;與DU145組比較,##P<0.01;與DU145/PR+PBS組比較,△P<0.05 △△P<0.01;與DU145/PR+缺氧細胞外泌體組比較,&P<0.05 &&P<0.01

2.2 miR-182在缺氧腫瘤細胞外泌體中高表達

GSE36802數據集里面包含21對PCa組織及正常前列腺組織中的miRNAs表達情況,GEO2R在線分析共篩選出35個差異表達miRNAs,選擇上調最顯著的10個miRNAs并繪制熱圖(圖2A),鑒于以往關于miR-182和PCa的報道不夠深入,將miR-182納入本研究。圖2B、2C結果顯示miR-182在PCa組織樣本中表達顯著升高(logFC=1.16549,adj.P.value=0.0000254)。圖2D結果顯示,與對照組比較,miR-182在PCa樣本組織中表達上調(P<0.01)。與RWPE-1細胞相比,DU145細胞和DU145/PR細胞中miR-182水平上調且DU145/PR細胞中miR-182水平更高(P<0.05)(圖2E)。對常氧和缺氧細胞外泌體中miR-182的表達進行檢測發現缺氧條件處理的細胞分離的外泌體其miR-182水平更高(P<0.05)(圖2F)。進一步將外泌體與DU145/PR細胞共培養并且檢測miR-182表達發現,與DU145/PR+PBS組比較,常氧細胞外泌體和缺氧細胞外泌體處理的DU145/PR細胞中miR-182水平上調且DU145/PR+缺氧細胞外泌體處理組中miR-182水平更高(P<0.05)(圖2G),提示缺氧細胞外泌體中miR-182能夠轉移到DU145/PR細胞中。

A～B:GSE36802數據集中顯著上調的miRNAs;C:miR-182在GSE36802數據集樣本中的表達;D:qRT-PCR檢測miR-182在對照組(n=50)及PCa組(n=52)患者前列腺組織中的表達水平,與對照組比較,**P<0.01;E:miR-182在RWPE-1、DU145以及DU145/PR細胞中的表達水平,與RWPE-1細胞比較,##P<0.01;F:miR-182在常氧細胞外泌體和缺氧細胞外泌體中的表達水平;G:miR-182在PBS、常氧細胞外泌體及缺氧細胞外泌體處理的DU145/PR細胞中的表達水平,與PBS組比較,△P<0.05 △△P<0.01

2.3 miR-182 inhibitor部分逆轉缺氧細胞外泌體對PCa細胞PTX耐藥的促進作用

相對于DU145/PR+PBS組,DU145/PR+缺氧細胞外泌體組細胞的存活率和PTX半數抑制濃度增加,細胞凋亡減少(均P<0.05);而相對于DU145/PR+缺氧細胞外泌體+inhibitor-NC組,DU145/PR+缺氧細胞外泌體+miR-182 inhibitor組細胞的存活率和PTX半數抑制濃度降低,細胞凋亡率升高(均P<0.01,圖3)。提示缺氧細胞外泌體對PCa細胞PTX耐藥的影響是通過miR-182實現的。

1:DU145/PR+PBS組;2:DU145/PR+缺氧細胞外泌體組;3:DU145/PR+缺氧細胞外泌體+inhibitor-NC組;4:DU145/PR+缺氧細胞外泌體+miR-182 inhibitor組;A:PTX處理后各組細胞存活率和各組細胞的PTX半數抑制濃度檢測結果;B:各組細胞凋亡檢測結果;與DU145/PR+PBS組比較,**P<0.01;與DU145/PR+缺氧細胞外泌體+inhibitor-NC組比較,##P<0.01

2.4 FTO為miR-182的作用靶點

為確定miR-182可能作用的靶點,Targetscan對其下游靶基因進行了預測。結果顯示miR-182與FTO存在靶向結合位點(圖4A)。雙熒光素酶報告分析實驗結果顯示(圖4B),相對于mimic-NC和FTO-WT共轉染組,miR-182 mimic和FTO-WT共轉染組的熒光素酶活性顯著降低(均P<0.05)。圖4C顯示FTO在PCa組中表達水平較對照組顯著下調(P<0.05),且與miR-182水平呈負相關(r=-0.83,P<0.01)(圖4D)。另外,與RWPE-1組相比,FTO在DU145和DU145/PR細胞中水平顯著下降(均P<0.05)(圖4E)。圖4F顯示,與PBS組比較,常氧細胞外泌體和缺氧細胞外泌體處理的DU145/PR細胞中FTO的表達降低且缺氧細胞外泌體組FTO表達更低(均P<0.05)。綜上結果表明,miR-182可靶向抑制FTO的水平。

2.5 FTO抑制PCa細胞的PTX耐藥但該作用能夠被缺氧細胞外泌體逆轉

相對于DU145/PR+oe-FTO-NC組,DU145/PR+oe-FTO組細胞的存活率和PTX半數抑制濃度降低,細胞凋亡率增加(均P<0.05)。而相對于DU145/PR+oe-FTO+PBS組,DU145/PR+oe-FTO+缺氧細胞外泌體組中細胞存活率和PTX半數抑制濃度增加,細胞凋亡率降低(均P<0.05)。上述結果表明FTO能夠抑制PCa細胞的PTX耐藥但該作用能夠被缺氧細胞外泌體挽救(圖5)。

1:DU145/PR+oe-FTO-NC組;2:DU145/PR+oe-FTO組;3:DU145/PR+oe-FTO+PBS組;4:DU145/PR+oe-FTO+缺氧細胞外泌體組;A:PTX處理后各組細胞存活率和各組細胞的PTX半數抑制濃度檢測結果;B:各組細胞凋亡檢測結果;與oe-FTO-NC組比較,**P<0.01;與oe-FTO+PBS組比較,##P<0.01

2.6 FTO抑制PTEN的m6A修飾并上調其在PCa中的表達

為探究缺氧細胞外泌體/miR-128/FTO的下游機制,以Starbase對FTO的結合因子進行預測,并且通過Disgenet網站以Malignant neoplasm of prostate(C0376358)為關鍵詞查找PCa疾病風險基因,做Venn圖取交集后得到1673個基因(圖6A)。KEGG富集分析結果中發現了PCa通路(圖6B)。GSCALite網站預測顯示E2F2,BCL2,E2F3,RAF1,PTEN,EP300,MTOR,PIK3CA的表達與耐藥性呈負相關,即其在PCa組織中表達水平越高,PCa組織對紫杉醇敏感性越高。StarBase預測結果顯示,PTEN在PCa中低表達(圖6C),且PTEN與FTO在PCa中的表達水平呈正相關(r=0.22,P=6.77 e-06)(圖6D)。SRAMP網站預測結果顯示,PTEN存在多個具有非常高可信度的m6A甲基化修飾位點。另外,PCa組織中m6A水平上升(均P<0.01)(圖6E);而PTEN表達水平在PCa組織及細胞中均下調(均P<0.01)(圖6F、6G)。敲減FTO后PTEN穩定性下降(P<0.01),過表達FTO后PTEN穩定性增強(均P<0.01)(圖6H)。MeRIP結果(圖6I)顯示FTO抑制了PTEN的m6A修飾,而敲減FTO則促進了PTEN的m6A修飾(均P<0.01)。綜上結果表明,FTO通過抑制PTEN的m6A水平增強其轉錄穩定性,進而上調PTEN在PCa中的表達。

1:si-FTO-NC;2:si-FTO;3:oe-FTO-NC;4:oe-FTO;A:StarBase與Disgene預測結果交集;B:KEGG富集分析結果;C～D:GSCALite、StarBase預測結果;E:m6A水平檢測結果;F～G:qRT-PCR檢測PTEN在PCa組織和細胞中的表達水平;H:放線菌素D實驗結果;I:MeRIP實驗結果;與對照組比較,**P<0.01;與RWPE-1細胞比較,##P<0.01;與si-FTO-NC組比較,△△P<0.01;與oe-FTO-NC組比較,&&P<0.01

2.7 PTEN對PCa細胞PTX耐藥的影響被si-FTO部分挽救

圖7A結果顯示,oe-PTEN促進PTEN的表達,但該效果能被si-FTO部分逆轉(均P<0.05)。圖7B、7C結果顯示,與DU145/PR+oe-PTEN-NC組比較,oe-PTEN組細胞存活率降低,PTX半數抑制濃度降低,細胞凋亡率增加(均P<0.05)。另外,與DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO-NC組比較,DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO組DU145/PR細胞存活率和PTX半數抑制濃度增加,細胞凋亡減少(均P<0.05)。提示PTEN的作用被si-FTO挽救,結合結果2.6認為FTO通過上調PTEN進而影響PCa的PTX耐藥。本研究機制見圖7D。

1:DU145/PR+oe-PTEN-NC組;2:DU145/PR+oe-PTEN組;3:DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO-NC組;4:DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO組;A:各組細胞PTEN的mRNA表達水平;B:各組DU145/PR細胞的存活率和PTX半數抑制濃度;C:各組細胞凋亡率;D:本研究機制圖;與DU145/PR+oe-PTEN-NC組比較,**P<0.01;與DU145/PR+oe-PTEN+si-FTO-NC組比較,##P<0.01

3 討論

缺氧與腫瘤的不良預后相關,也是惡性腫瘤的重要標志,外泌體是腫瘤微環境的重要組成部分,缺氧條件下的外泌體能夠通過調節免疫、傳遞貨物分子等途徑促進腫瘤的生長[11]。另外也有研究表明缺氧PCa細胞來源的外泌體能夠促進原始PCa細胞的干性和侵襲性,促進PCa的上皮間充質轉化[12-13]。首先本研究對常氧和缺氧細胞中分離的外泌體對PTX耐藥細胞的影響進行探討,發現常氧和缺氧細胞外泌體均增加了PCa細胞對PTX的耐藥性并減少了凋亡,但缺氧細胞外泌體的作用更顯著,這可能與缺氧條件下腫瘤細胞的惡性程度更高和增殖更多有關。

運輸RNA和蛋白質等貨物分子是外泌體參與腫瘤進展的重要途徑,如缺氧結直腸癌細胞分泌的外泌體能通過傳遞Wnt4至常氧細胞,以激發常氧腫瘤細胞的遷移和侵襲[14]。缺氧的非小細胞肺癌細胞源性介導高水平的miR-21傳遞可促進常氧細胞對順鉑的耐藥性[15]。本研究通過生物信息學分析發現miR-182在PCa中表達增強,關于PCa的研究也證實miR-182過表達能夠促進PCa細胞增殖和侵襲[16]。本研究發現miR-182在缺氧條件處理的PCa細胞外泌體中表達顯著增強。功能實驗進一步表明缺氧細胞外泌體能夠促進DU145/PR細胞的存活,抑制細胞凋亡,但是敲減miR-182后上述情況則改善,提示缺氧細胞外泌體對PCa細胞PTX耐藥的影響可能是通過運輸miR-182實現的。

FTO作為去甲基化酶被證實參與了PCa的進展,有研究表明FTO在PCa中表達降低且其表達與PCa患者預后有關[17]。本研究發現FTO和miR-182存在結合位點并且證實了二者直接的結合關系。此外FTO在DU145/PR細胞以及缺氧細胞外泌體中表達降低,可能是受到miR-182的靶向抑制。功能實驗顯示過表達FTO能夠抑制PTX處理的PCa細胞的存活率并且促進細胞凋亡,提示FTO能夠抑制PCa細胞的PTX耐藥但該作用能夠被缺氧細胞外泌體挽救,結合缺氧細胞外泌體中miR-182高表達以及FTO和miR-182的靶向關系我們推測缺氧細胞外泌體能夠分泌miR-182進而調控FTO并影響PCa細胞對PTX的耐藥。

進一步對FTO可能調節的下游因子進行分析,發現其能夠與PTEN結合,PTEN作為PCa的抑癌因子證據較為充分[18],且本研究通過GSCALite網站發現其與PCa耐藥呈負相關。FTO對其結合靶點的修飾有多種途徑,比較常見的就是通過調節其靶基因的m6A水平進而調節靶基因表達,如FTO被發現能夠抑制CLIC4 mRNA的m6A修飾水平進而增加CLIC4的表達和穩定性[19]。本研究對FTO和PTEN的關系進行驗證發現FTO過表達增加了PTEN的穩定性,而敲減FTO則能夠抑制PTEN的穩定性,進一步發現FTO對PTEN的調節是通過影響PTEN的m6A修飾水平實現的。功能實驗進一步表明過表達PTEN后PTX處理的DU145/PR細胞存活率下降,細胞凋亡增加,但加入si-FTO后DU145/PR細胞的存活率增加,細胞凋亡減少,可能是敲減FTO后PTEN的穩定性受到了影響。

綜上所述,本研究揭示了缺氧腫瘤細胞外泌體能夠通過向常氧細胞傳遞高水平的miR-182,進一步靶向FTO,上調PTEN的m6A修飾水平進而抑制PTEN表達,促進PCa細胞對PTX的耐藥。本研究認為缺氧細胞外泌體源性miR-182可以作為針對PCa耐藥性治療的一個新的潛在生物標志物和治療靶點。