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噬菌體裂解酶及其在畜禽生產中的應用研究進展

2024-01-09 06:13謝自強宋瑞銘郝柳杭高慶羽張永英石玉祥
現代畜牧獸醫 2023年12期
關鍵詞:肽聚糖外膜陰性菌

謝自強,宋瑞銘,郝柳杭,高慶羽,趙 越,李 悅,張永英,石玉祥

( 河北工程大學生命科學與食品工程學院,河北 邯鄲 056000 )

細菌耐藥性導致了嚴重的公共衛生安全問題,為響應農業農村部減抗、替抗、無抗的戰略提案,急需開發出新的、綠色安全的替抗產品。噬菌體(bacteriophage,phage)是能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[1],因其以細菌為寄主,也稱為細菌病毒,根據噬菌體與宿主相互關系可分為裂解和溶原兩種類型[2]。裂解性噬菌體具有殺菌效果,可直接進入宿主細菌進行復制和裂解[3-4],在感染細菌后期控制編碼產生裂解酶,破壞細菌細胞壁肽聚糖層,最終使細菌破裂死亡。噬菌體遺傳物質中可能攜帶耐藥和毒力基因以及特異性殺菌能力制約了噬菌體的臨床應用,且細菌菌株通過突變、受體修飾、被動適應、限制性修飾、規律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated systems,CRISPR/Cas)和假溶原等方式對噬菌體產生耐藥性[5]。為克服這一影響,有研究嘗試利用基因重組技術對裂解酶蛋白進行表達,結果顯示了一定的抑菌效果,且沒有關于細菌對噬菌體裂解酶產生耐藥性的報告[6]。目前,針對噬菌體裂解酶的研究主要通過修飾改造其裂解譜,及提高抗菌活性,從而實現對不同種屬耐藥菌株的殺菌效果。此外,噬菌體裂解酶制劑在治療細菌性疾病時具有特異性強、無殘留、效果顯著等優勢,可用于畜禽細菌性疾病的治療,解決耐藥菌所致感染疾病,還可作為飼料添加劑用于改善畜禽腸道菌群、提升畜禽抗氧化能力?;诖?,本文綜述了裂解酶的結構、作用方式及應用概況等,以期為裂解酶制劑的開發提供參考。

1 噬菌體裂解酶概述

1.1 裂解酶的分類及結構

裂解酶(endolysin 或lysin)又稱內溶素(lysozyme)、胞壁質酶(muramidase),是噬菌體編碼的酶,在侵染細菌的后期產生,可降解細菌細胞壁內的特定鍵,從而釋放子代病毒。一般根據裂解活性可分為不同類型:乙酰壁酰胺酶(acetylmuramidases)、轉糖基酶(transglycosylases)、氨基葡萄糖苷酶(glucosaminidases)、酰胺酶(amidases)和內肽酶(endopeptidases),見圖1。它們可以降解不同細菌的細胞壁,其作用的靶點是細菌的肽聚糖層[7-8]。

肽聚糖聚合物由交替的N- 乙酰壁酸(Nacetylmuramic acid,MurNAc)和N-乙酰氨基葡萄糖(Nacetyl-D-glucosamine,GlcNAc)殘基組成,通過β-1, 4 糖苷鍵連接。相鄰的聚糖鏈通過短的相互連接的肽交聯,每個肽通過涉及肽的第一個氨基酸的酰胺鍵與MurNAc 殘基連接(通常為L-丙氨酸)[9]。乙酰壁酰胺酶(如N-乙?;?D-壁酰胺酶)、氨基葡萄糖苷酶(如N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)、轉糖基酶(如裂解轉糖基酶)是糖苷酶的亞類,其通常會切割連接在肽聚糖層的MurNAc和GlcNAc交替聚合結構的β-1, 4 糖苷鍵。酰胺酶(如N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)可催化MurNAc 和肽莖部分中的第一個氨基酸L-丙氨酸之間的酰胺鍵的斷裂。內肽酶(如L-丙氨酰-D-谷氨酸內肽酶)可切割干肽的兩個氨基酸之間的鍵,在肽橋內發生鍵的斷裂[10]。

由于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁結構的差異,不同細菌噬菌體裂解酶在結構上存在區別。革蘭氏陽性菌噬菌體裂解酶通常呈現模塊化結構,由兩個具有不同活性的結構域組成:一個N端酶活性結構域(EAD)和一個C端細胞壁結合結構域(CBD),由一個短而靈活的連接體連接,見圖2。CBD負責底物識別,附著在細胞壁上的特定配體分子上,裂解酶的特異性通常由CBD決定。在細胞裂解后,一些CBD會與細胞壁碎片上的底物緊密結合,阻止它們過早裂解周圍可能含有預裝配噬菌體成分的細菌細胞。EAD負責催化特定PG鍵的斷裂以破壞細胞壁。

圖2 針對革蘭氏陽性細菌的模塊化裂解酶的一般結構Fig.2 General structure of modular lyase for Gram-positive bacteria

由于外膜可有效保護革蘭氏陰性細菌免受游離裂解酶的攻擊,革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶在宿主細胞裂解后不需要CBD 與細胞碎片結合,以最大限度地減少過早裂解。因此,革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶通常具有球狀結構,帶有單個EAD以破壞細胞壁。一些革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶被發現具有模塊化結構(見圖3),如由沙門菌噬菌體編碼的PVP-SE1gp146[11]、SPN1S_0028[12]和Gp110[10]。與革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶不同,模塊化革蘭氏陰性菌噬菌體裂解酶均具有C 端EAD 和N 端球形蛋白結合域(PBD),其識別革蘭氏陰性細菌中常見的PG成分[13]。

圖3 針對革蘭氏陰性細菌的球狀和模塊化裂解酶的結構安排Fig.3 Structural arrangement of spherical and modular lyases for Gram-negative bacteria

1.2 裂解酶作用機制

噬菌體介導的裂解有兩種基本策略:一種策略是單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA)噬菌體通過抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成,依靠單基因編碼的蛋白質分解細菌;而另一種策略是95%以上的已知雙鏈DNA(dsDNA)噬菌體(如λ噬菌體)利用至少兩種蛋白質,如絕大多數采用“穿孔素(holin)-裂解酶”裂解系統。大部分裂解酶沒有信號肽,因此它們不會通過細胞質膜轉位攻擊肽聚糖中的底物,這種運動由裂解系統中的第2個噬菌體基因產物穿孔素控制。在穿孔素的作用下造成細菌細胞膜穿孔,使裂解酶順利作用于肽聚糖靶點,導致宿主細胞溶解[13]。隨著噬菌體在被感染細菌中發育,裂解酶在細胞質中積累,等待噬菌體成熟。在基因的調控下,穿孔素分子被插入細胞質膜形成斑塊,最終導致細胞膜的廣泛破壞[14]。裂解酶快速降解肽聚糖層,導致其滲透溶解,革蘭氏陽性細菌容易受到裂解酶的影響,而革蘭氏陰性細菌則具有天然的抵抗力。將外膜透過劑與噬菌體裂解酶共同作用于革蘭氏陰性菌,可提高其抗菌活性,發揮裂解酶的作用[15]。且細菌能夠被以重組蛋白形式進行外源表達的裂解酶殺死[16],這就可以通過基因工程手段克隆到表達載體進行大量制備,并配合外膜透過劑進行殺菌。因此,噬菌體裂解酶以一種普遍的物種特異性方式快速切割肽聚糖的獨特能力,使其成為有前途的潛在抗菌劑。

2 噬菌體裂解酶在動物疾病臨床診療中的應用

國內外已利用基因重組技術,先后制備出多種噬菌體重組裂解酶,包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、布魯菌、鏈球菌噬菌體裂解酶等,可用于治療金黃色葡萄球菌、鏈球菌導致的奶牛乳腺炎;養殖環境的消殺;肉、蛋等畜禽產品的凈化;此外,噬菌體重組裂解酶作為飼料添加劑應用于畜禽養殖還可提升畜禽產品質量等[17]。楊瑞思等[18]以3 日齡白羽肉雞為試驗對象飼喂復合噬菌體裂解酶,試驗28 d后檢測腸道菌群結構和肝臟抗氧化物酶的變化。結果顯示,復合噬菌體裂解酶可提高腸道有益菌群數量和肝臟抗氧化能力。王子晶[19]建立了2型豬鏈球菌致小鼠菌血癥模型,使用200 μg/只的噬菌體裂解酶Ply1228 進行治療后,可顯著降低各個組織器官及血液的載菌量,顯著減輕炎癥及病理變化,對小鼠的保護率高達100%。張楸楊[20]構建了高效表達噬菌體裂解酶LySP2 畢赤酵母菌株,通過誘導后,其體外抗菌效果良好,對雞白痢沙門菌雛雞感染模型的保護率高達70%,對肝臟及腸道沙門菌的清除率為100%和50%。Zhang等[21]研究發現,噬菌體裂解酶LysGH15具有對表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和人型葡萄球菌形成的葡萄球菌浮游細胞和生物被膜的清除能力。有研究通過構建表皮葡萄球菌菌血癥小鼠模型進行體內試驗,結果顯示,腹腔注射20 μg/只的LysGH15 24 h后,小鼠血液中表皮葡萄球菌細胞計數比未處理的對照小鼠降低4個對數單位,器官中降低3個對數單位;同時血液中的細胞因子水平也有所降低,器官病理變化得到改善。綜上,LysGH15表現出治療由不同葡萄球菌引起的生物膜相關或非生物膜相關感染的潛力。

Ding 等[22]鑒定了一種新的內切酶LysSE24 并進行異源表達和純化,發現其在0.1 μmol/L 濃度下對腸炎沙門氏菌ATCC 13076 具有最佳殺菌活性;在體外與外膜滲透劑聯合培養10 min 后,沙門氏菌群顯著減少。此外,內切酶LysSE24 還顯示了對23 種經測試的多重耐藥沙門菌菌株的抗菌活性。Xu 等[23]發現了1 種新型的噬菌體裂解酶PlyEc2,對關鍵的革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌、沙門菌、志賀氏菌、不動桿菌和假單胞菌)具有強大的殺菌活性;在一定條件下,PlyEc2對產志賀毒素大腸桿菌O157:H7顯示出較高的殺菌活性。此外,這種裂解酶還能夠在體外將幾種致病菌株的細菌滴度降低5個對數單位以上,從而實現完全滅菌。劉曉航[24]通過分子生物學技術將亞棲熱菌和棲熱菌噬菌體的兩種裂解酶基因MMP phg和TSP phg進行拼接,后將融合片段克隆到表達質粒上,得到兩種融合酶的表達系統,結果表明,融合酶對兩種噬菌體宿主菌均具有明顯的裂解作用。噬菌體對細菌具有高度特異性,只能夠裂解其對應的菌株,而大多數表達純化的噬菌體裂解酶的抗菌譜則更廣,這表明更多的細菌種類具有某一裂解酶的細胞壁識別位點。

3 噬菌體裂解酶的改造及相關應用

噬菌體編碼的裂解酶被認為是對抗革蘭氏陽性菌的有效替代品,為了發揮裂解酶在對抗多重耐藥細菌中的全部潛力,人們越來越關注能夠使裂解酶克服靶向革蘭氏陰性菌的外膜屏障[25]。由噬菌體裂解酶衍生的新型抗菌劑也不斷出現??咕模╝ntimicrobial peptides,AMPs)是由生物體產生的陽離子肽,通常由20~60個氨基酸殘基組成。在許多結構-功能關系定量研究中,AMPs的正電荷數和疏水性是膜破裂的關鍵結構參數。雖然裂解酶在抑制革蘭氏陰性菌中的應用有限,但AMPs 是噬菌體裂解酶未能突破革蘭陰性菌外膜的潛在解決方案。Ning 等[26]設計的陽離子肽嵌合裂解酶Lysqdvp001-5aa、Lysqdvp001-10aa 和Lysqdvp001-15aa 是基于副溶血性弧菌噬菌體qdvp001 中的溶血素Lysqdvp001 設計的,通過將陽離子肽融合到Lysqdvp001 的C 末端,增強其對副溶血性弧菌的殺菌能力。這些嵌合裂解酶對副溶血性弧菌的抗菌活性以及內外膜通透性優于原噬菌體裂解酶,且其抗菌譜比噬菌體qdvp001 寬得多,Lysqdvp001-15aa 的MIC 和MBC 分別使牡蠣中副溶血性弧菌的數量減少了3、4 個對數單位。MBC 的Lysqdvp001-15aa 清除了約50%的副溶血性弧菌生物膜,并抑制了90%以上的細菌生物膜的形成。Nie等[27]通過生物信息學分析和設計,獲得了4 種新型嵌合裂解酶(P361、P362、P371 和P372),它們是沙門菌噬菌體裂解酶和新型抗菌肽LeuA-P的融合。重組嵌合裂解酶在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達,對沙門氏菌表現出高度特異性的抑制作用。Lu 等[28]將抗菌肽A 肽殘基與噬菌體MK54的內溶素LysG24連接,構建1種新的肽修飾內溶素LysCA,研究LysG24 和LysCA 的抗菌活性。結果表明,LysG24 和LysCA 的裂解譜比噬菌體MK54 的裂解譜寬。體外試驗表明,LysG24和LysCA在6 h內殺死了99%的宿主菌,LysCA 的溶解能力和環境適應性明顯強于LysG24。體內試驗表明,LysG24 和LysCA 在感染肺炎克雷伯菌(LPKP)的小鼠肺炎模型中均能夠有效減少肺部炎癥反應,治療組肺炎克雷伯菌(LPKP)載菌量明顯低于細菌組,其中LysCA治療效果更明顯。Wang等[29]從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)噬菌體JD007中鑒定出1種細胞壁水解酶JDlys,將JDlys 與細胞穿透肽(CPPTat)融合,用于消滅細胞內耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染。結果發現,CPPTat-JDlys 融合后幾乎不影響JDlys 的溶菌活性,能夠有效消除細胞內耐藥金黃色葡萄球菌,減輕MRSA引起的炎癥反應和細胞損傷??咕?裂解酶嵌合體策略激發了噬菌體裂解酶在體外無法特異性抑制外膜致密的革蘭氏陰性菌,開發通用嵌合裂解酶跨越革蘭氏陰性菌的外膜屏障,克服針對裂解酶的免疫反應。

除了修飾改造外,裂解酶與抗生素聯用也可提高抗菌活性、降低細菌耐藥性[30]。Indiani 等[31]研究發現,鏈球菌裂解酶CF-301與達托霉素或萬古霉素的組合具有協同作用,與人體血液中的兩種特定成分(即溶菌酶和白蛋白)之間也存在協同作用,該結果證明了CF-301 作為靜脈內給藥抗微生物劑治療金黃色葡萄球菌菌血癥和心內膜炎的潛在有效性。納米封裝可通過保護蛋白質不被降解、提供持續釋放,從而提高裂解酶的穩定性、保質期和治療效果,從而幫助實現更好的治療效果。Kaur等[32]研究發現,藻酸鹽-殼聚糖納米顆粒(Alg-Chi-NPs)可做作為裂解酶LysMR-5的載體,通過鈣離子誘導藻酸鹽核的預凝膠化及其與殼聚糖的絡合,制備了LysMR-5負載納米顆粒,包封后裂解酶結構完整生物活性不變,對金黃色葡萄球菌具有殺菌效果。

4 結論

與抗生素相比,噬菌體裂解酶治療細菌感染具有以下明顯優勢:具有一定的特異性,避免了生物失衡和引發繼發感染;不會使細菌產生耐藥性;快速發揮殺菌作用;與針對耐藥菌的新型抗生素相比,裂解酶制劑研發時間更短。雖然不同種類的裂解酶靶向特異性差異很大,但通過分子生物技術的改造可以發揮其抗菌潛力。

許多裂解酶在治療抗生素耐藥細菌方面顯示出良好的效果,但其應用與后續研究同樣面臨挑戰。外膜的存在導致裂解酶對革蘭氏陰性菌的治療活性較低;裂解酶體內半衰期短,使用時引發免疫反應,在體內易失去酶解活性;噬菌體治療缺乏可靠的臨床試驗數據和相應的監管批準;給藥方式、劑量不明確;裂解酶蛋白外源表達中存在諸多問題等。具有廣譜裂解能力的酶篩選及改造、裂解酶輔助因子的探索、裂解酶規?;a、裂解酶克服體內代謝的成藥方式、成藥后用藥方式劑量等均是未來值得深入研究的方向。面對飼料端禁抗的大背景,噬菌體裂解酶勢必會成為新一代對抗細菌性疾病的“利刃”,在對抗耐藥細菌、清除生物被膜、作為飼料添加劑應用于畜禽養殖中發揮其潛力。

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