串聯熒光標記LGG-1檢測秀麗線蟲表皮自噬流

朱 怡, 嚴晨嘯,2, 楊玉妍,3, 傅 容*

(1. 蘇州大學生物醫學研究院, 江蘇蘇州 215123; 2. 南京醫科大學基礎醫學院, 南京 211166; 3. 蘇州貝康醫療器械有限公司, 江蘇蘇州 215123)

自噬是一種進化上保守的分解代謝機制,通過該機制,真核細胞運用膜運輸途徑降解循環胞內成分。自噬可降解錯誤折疊的蛋白質、清除受損的細胞器,并為細胞提供可持續的生物分子和能量,從而在饑餓、氧化、熱激等應激條件下維持細胞穩態。因此,自噬與許多生理病理過程均密切相關,例如胚胎的發育、衰老、饑餓、感染免疫等。自噬主要有3種類型,即微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬(CMA)。本研究關注的是巨自噬(以下簡稱自噬)的檢測。自噬涉及一系列動態的膜形成和融合過程,自噬被誘導后,首先會形成1個月牙形的雙膜囊,稱為吞噬泡(phagophore); 這個囊進一步膨脹并最終閉合,產生1個包裹著自噬底物的雙膜隔室,稱為自噬小體(autophagosome); 自噬小體進一步與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome), 最終完成成熟過程并降解自噬底物。從自噬小體被誘導生成到自噬小體被溶酶體融合消化的整個動態過程又稱為自噬流(autophagic flux)[1]。在哺乳動物活體內實時觀察特定組織中的自噬過程具有相當大的難度,秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)則為解決這一問題提供了良好的生物模型。秀麗隱桿線蟲不僅有高度保守的自噬基因,而且通體透明,因此極大方便對其活體各個組織的自噬情況進行顯微觀察。

與哺乳動物相比,秀麗隱桿線蟲表皮結構簡單,主要由一層多核上皮細胞構成,是研究表皮細胞生理病理機制的理想模型。近年來研究顯示自噬在線蟲表皮的發育,免疫防御和結構損傷中發揮重要作用[2-4]。而深入解析表皮細胞自噬的調節機制則需要實時檢測表皮細胞在不同發育階段及環境刺激下的自噬流變化情況,但目前尚缺乏準確且特異性地檢測表皮細胞自噬流的方法。哺乳動物LC3的同源蛋白LGG-1是在線蟲中最常用于檢測自噬的標記蛋白。LGG-1及其同源蛋白LC3一樣通過C末端的脂化而被募集到自噬小體膜上。2003年, Melendez及其同事構建了第1個由其本身的啟動子驅動表達GFP::LGG-1的蟲株[5], 該蟲株迅速成為在秀麗隱桿線蟲中標記自噬小體最常用的方法(蟲株DA2123[6])。但由于GFP在酸性壞境下易被淬滅,因此GFP::LGG-1只能顯示自噬小體而不能顯示自噬溶酶體。而自噬的誘導增強,自噬溶酶體的形成障礙或溶酶體降解功能異常均可導致GFP::LGG-1聚集增加,因此需要采用其他方法進一步分辨以上不同的自噬調節狀態。鑒于GFP和mCherry對溶酶體的酸性pH值具有不同的敏感性,因而串聯融合蛋白GFP::mCherry::LGG-1被構建,這使得自噬溶酶體(僅mCherry陽性)和自噬小體(GFP和mCherry雙陽性)不僅都能被顯示出,還可被區別開來,從而實現對自噬流更全面的監測,但目前該融合蛋白分別構建在PIE-1啟動子和LGG-1自身啟動子的下游[7-8]。PIE-1啟動子只表達于早期胚胎和生殖細胞[9], 而LGG-1自身啟動子表達組織眾多,因此用于監測表皮細胞自噬情況時容易受到相鄰組織自噬信號的干擾。

本課題組采用表皮特異性啟動子DPY-7P構建DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株。接著通過RNAi敲降自噬負向調控因子mTOR的同源蛋白LET-363和自噬溶酶體形成的必需成分RAB-7, 然后利用激光共聚焦顯微鏡觀察并統計DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1所標記的自噬小體和自噬溶酶體數量,從而驗證該報告系統可有效檢測自噬流的誘導和抑制。此外,研究也利用該報告系統進一步證實機械損傷在單個表皮細胞內產生對自噬的遠端促進效應。因此本研究開發的DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株可用于進一步探究表皮細胞在各種生理病理過程中的自噬,為解析表皮自噬機制和生理意義提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 蟲株和菌株

1) 試驗動物: 野生型秀麗隱桿線蟲

2) 細菌品系: 大腸埃希菌菌株OP50-尿嘧啶缺陷型線蟲飼養菌種、感受態細胞DH5α

3) RNAi文庫:C.elegansChr RNAi library (英國Source Bioscience公司)。

1.2 主要試劑

硼酸、Tris堿、膽固醇、Tween-20、IPTG、EDTA、瓊脂、瓊脂糖等(上海生工生物工程公司), Peptone (北京索萊寶科技公司), NGM瓊脂(德國Calbiochem公司), 各種限制性內切酶(美國NEB公司), ClonExpress MultiS (南京諾唯贊生物科技公司), PrimeSTAR GXL Premix (日本TaKaRa公司), 膠回收試劑盒(德國Qiagen公司), 質粒提取試劑盒(美國Axygen公司), QIAquick spin miniprep kit (德國Qiagen公司), 線蟲NGM培養基、M9緩沖液、bleach溶液(自配)。

1.3 線蟲培養

將OP50單菌落接種至50 mL的LB液體培養基中, 37 ℃振蕩培養過夜。吸取200 μL經檢驗無污染的大腸埃希菌OP50菌液于6 cm NGM固體培養基上,過夜晾干后在37 ℃培養箱中倒置培養。挑取健康的野生型秀麗隱桿線蟲放置其中,線蟲在20 ℃培養箱中培養,注意觀察線蟲的生長狀態并及時分盤培養。

1.4 重組質粒DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1的構建

1.4.1 利用PCR技術獲得目的基因LGG-1和mCherry的片段

1) 引物序列: LGG-1-F為5′-GCATGGACGAGCTGTACAAGATGAAGTGGGCTTACAAGGAG-3′, LGG-1-R為5′-ACCGGCGCTCAGTTGGAATTTTTGTGTCTTCTTCGTTTATTCATG-3′; mCherry-F為5′-ACAAACAGCATTCGTATAATCTCGAGATGGTGAGCAAGGG-3′, mCherry-R為5′-CT

TGTACAGCTCGTCCATGCC-3′。

2) PCR擴增及切膠回收: 使用PimeSTAR GXL Premix, 根據說明書配置反應體系,進行PCR反應,使用膠回收試劑盒進行切膠回收。

1.4.2 重組質粒的構建

1) 連接: 使用ClonExpress MultiS試劑盒進行連接反應。

2) 轉化: 使用感受態細胞DH5α進行轉化試驗,最后將菌液均勻涂布于含氨芐的LB固體培養基上,然后在37 ℃條件下培養過夜。

1.4.3 重組質粒的篩選鑒定

1) PCR擴增: 挑取單菌落使用PrimeSTAR GXL Premix進行PCR反應,陽性對照是從野生型線蟲中提取的DNA模板,陰性對照是從陰性克隆菌落提取的DNA模板。

2) 酶切鑒定: 使用質粒提取試劑盒提取重組質粒進行酶切驗證,使用限制性內切酶StuI 和SpeI, 得到3個酶切片段,長度分別為4 518、1 845和222 bp。

3) 樣品送蘇州金唯智生物科技公司進行測序。

1.5 DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株的構建

1.5.1 試驗前準備

1) 挑選生長狀態良好、處于年輕成蟲階段的野生型秀麗隱桿線蟲備用。

2) 制備顯微注射針及載有瓊脂糖的蓋玻片,并在烘箱中烘干備用。

3) 使用QIAquick spin miniprep kit提取質粒備用。

4) 配制注射液,成分為10 ng·μL-1質粒DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1, 20 ng·μL-1標記基因表達載體MYO-2P::GFP (咽部表達綠色熒光蛋白), 450 ng·μL-1載體質粒pPD49.78。

1.5.2 顯微注射

將配制的注射液注入線蟲生殖腺,一次注射約30條線蟲,將注射好的線蟲置于20 ℃培養箱內培養恢復。

1.5.3 篩選

待顯微注射過的線蟲恢復正常狀態后,在NGM固體培養基上單獨培養P0代線蟲直到F1代線蟲大量出現,在熒光體式顯微鏡下觀察并挑取咽部表達GFP的F1代線蟲于新的NGM固體培養基上,從而篩選出傳代率較高的蟲株。

1.6 RNAi

1.6.1 RNAi培養基的制備

根據所需敲降基因的基因序列號,查找其對應的RNAi克隆在RNAi文庫里的位置,劃板搖菌后提取質粒測序驗證,將驗證正確的RNAi單菌落進行RNAi培養基制備。

1.6.2 線蟲同步化

1) 將DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株用線蟲NGM培養基培養至有較多的成蟲。

2) 用1 mL M9緩沖液收集線蟲于潔凈的1.5 mL EP管中,待線蟲沉降至管底后棄上清,重復此步驟直至溶液澄清(約2～4次)。

3) 加入1 mL現配的bleach溶液,室溫靜置60 s。

4) 以3 800 r·min-1轉速離心60 s。

5) 棄去上清,加入1 mL M9緩沖液,以3 800 r·min-1轉速離心60 s。

6) 棄去上清,留存溶液約50 μL, 將管底的混合物轉移到普通的線蟲NGM培養基上。

7) 20 ℃培養12 h, 待卵孵化后備用。

1.6.3 RNAi處理

將同步化后孵化的L1轉基因蟲株轉移到上述制備完成的RNAi固體培養基上, 20 ℃培養至成年。

1.6.4 制片觀察

快速地挑取足量的線蟲放在制備好的瓊脂糖載玻片上,瓊脂糖上已提前滴加適量鹽酸左旋咪唑溶液,小心蓋上蓋玻片,并用膠布將蓋玻片固定在載玻片上。沿蓋玻片邊緣加入適量M9緩沖溶液,從而避免線蟲干涸死亡。使用激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.7 表皮機械損傷

挑取成蟲至預冷的NGM培養皿上,手持顯微注射針對其進行針刺損傷,在線蟲身體前端制造1個傷口。損傷后的線蟲轉移至新培養皿上恢復1.5或3 h后進行GFP::mCherry::LGG-1熒光信號采集。

1.8 自噬點測量統計

1) 測量: 選取同一視野下紅綠熒光雙通道、紅色熒光單通道和綠色熒光單通道3張圖像。在線蟲表皮細胞處選定面積為631.2 μm2的矩形測量框(保存備用,所有樣本測量均使用同一測量框), 對測量框內聚集的熒光點用圓形工具圈定,分別測量該熒光聚集點的紅色熒光和綠色熒光的強度并保存。以上操作均使用Image J 圖像處理系統。

2) 數據統計: 紅光熒光強度與綠光熒光強度比值>0.47記為自噬溶酶體(autolysosome); 紅光熒光強度與綠光熒光強度比值≤0.47, 若綠色熒光通道沒有明顯聚集點,計為無效數據,反之記為自噬小體(autophagosome)。統計分析采用unpairedt檢驗。

2 結果與分析

2.1 構建DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1質粒和轉基因蟲株

首先通過 PCR 獲得mCherry和LGG-1的基因片段,然后將其插入到DPY-7P::GFP載體中,經過PCR 鑒定和酶切鑒定(圖1.A—C), 經測序驗證DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1質粒構建成功,顯微注射入線蟲,構建出傳代率較高的轉基因蟲株。共聚焦顯微鏡觀察該質粒特異性地在表皮細胞中表達,且綠色通道顯示在正常培養條件下未發生大量聚集(圖1.D), 與先前報道的表皮的自噬水平相當[10]。因此認為該外源表達系統未因過表達而干擾自噬過程,可較好地反映表皮自噬的本底水平。

圖1 構建DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株*Fig.1 Construction of the DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 transgenic strain* A. DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1質粒圖譜; B. 菌落PCR擴增mCherry片段; C. SpeⅠ、StuⅠ雙酶切質粒后的電泳圖; D. DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1在成蟲表皮細胞中的表達情況。右上角顯示實線框區域的放大圖; 比例尺代表20 μm。* A. The DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 plasmid; B. mCherry fragments amplified by colony PCR; C. The electrophoresis of the plasmid digestion by SpeⅠ and StuⅠ; D. The expression of DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 in the adult epidermis. The boxed areas are enlarged in insets. Scale bar is 20 μm.

2.2 利用LET-363/mTOR RNAi誘發自噬檢測DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統的有效性

LET-363是哺乳動物mTOR的同源蛋白質。該蛋白質是已知的負向調控自噬的關鍵蛋白質,先前研究[11]顯示RNAi敲降線蟲的LET-363可誘導表皮細胞發生自噬,因此作者利用LET-363 RNAi來驗證DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統能否反映自噬的激活。DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株從孵化開始喂食表達LET-363 dsRNA的大腸埃希菌直到成年,利用激光共聚焦拍攝其表皮細胞。由于自噬溶酶體中的酸性環境會導致GFP淬滅,因此理論上來說GFP/mCherry雙陽性的黃色聚集點為自噬小體,而mCherry單陽性的紅色聚集點為自噬溶酶體。但由于同等條件下mCherry熒光蛋白本身的強度和GFP不同,單純靠主觀判斷顏色來區分自噬小體和自噬溶酶體并不準確。因此作者根據mCherry和GFP亮度的比值0.47為閾值(https://www.fpbase.org/collection/2/), 聚集點的紅色信號與綠色信號的比值>0.47被計為自噬溶酶體,比值≤0.47則計為自噬小體。使用激光共聚焦顯微鏡采集圖像并統計分析,結果表明LET-363 RNAi顯著增加自噬小體和自噬溶酶體的數量(圖2), 與LET-363 RNAi增強自噬流的報道相符合,說明DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統可有效地反映自噬流的增強。

圖2 DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1顯示自噬流被LET-363/mTOR RNAi誘導*Fig.2 DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 shows the induction of autophagic flux by LET-363/mTOR RNAi* 在對照L4440和LET-363 RNAi處理的成年線蟲表皮中, DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1標記的自噬小體和自噬溶酶體的排布情況(A)和數量統計(B、C)。比例尺代表10 μm。 *P<0.05, *** P<0.001 (t檢驗)。* The pattern (A) and number (B, C) of PDPY-7::GFP::mCherry::LGG-1 labeled autophagosomes and autolysosomes in the adult epidermis treated with L4440 or LET-363 RNAi. Scale bar is 10 μm. *P<0.05, *** P<0.001 (t-test).

2.3 利用RAB-7/RAB7A RNAi阻斷自噬檢測DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統的有效性

RAB-7/RAB7A具有 GTPase活性, 是自噬溶酶體形成的必需成分[8]。因此作者利用RAB-7 RNAi來驗證DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統能否反映自噬溶酶體形成障礙所導致的自噬流阻斷。DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株從孵化開始喂食表達RAB-7 dsRNA的大腸埃希菌直到成年,然后利用激光共聚焦拍攝其表皮細胞。檢測結果表明RAB-7 RNAi導致自噬小體數量大幅度增加,而自噬溶酶體數量無明顯變化,與自噬溶酶體形成過程受阻的試驗預期相符合(圖3)。綜合LET-363 RNAi的結果可見, DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統能很好地分辨自噬的誘發增強與自噬溶酶體的形成障礙。

圖3 DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1顯示自噬流被RAB-7/RAB7A RNAi抑制*Fig.3 DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 shows the inhibition of autophagic flux by RAB-7/RAB7A RNAi* 在對照L4440和RAB-7 RNAi處理的成年線蟲表皮中, DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1標記的自噬小體和自噬溶酶體的排布情況(A)和數量統計(B、C)。比例尺代表10 μm。**** P<0.000 1; ns. 無顯著性(t檢驗)。* The pattern (A) and number (B, C) of DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 labeled autophagosomes and autolysosomes in the adult epidermis treated with L4440 or RAB-7 RNAi. Scale bar is 10 μm. **** P<0.000 1; ns. no significant (t-test).

2.4 DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1檢測機械損傷對表皮自噬的調節

上皮組織構成人類大多數器官的物理屏障,并不斷面臨物理損傷和各種結構損傷的挑戰。然而,上皮細胞機械損傷或支撐結構的破壞是否影響以及如何影響受損細胞本身的自噬過程仍不完全清楚。最近,利用線蟲表皮上皮細胞層作為模型進行研究,發現機械損傷引起的結構破壞在單個表皮細胞內可產生對自噬的近端抑制和遠端促進的效應[4]。為更詳細地觀察機械損傷傷口附近以及遠離傷口區域的自噬狀態,作者利用DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1報告系統呈現針刺損傷下表皮不同區域的自噬小體和自噬溶酶體的變化。與已報道的DPY-7P::GFP::LGG-1轉基因觀察結果[4]一致的是,傷口附近的自噬小體沒有增加,而在遠離傷口的蟲體后端,自噬小體和自噬溶酶體的數量均增多,說明遠離傷口的區域自噬的活性是增強的。此外,值得注意的是,損傷1.5 h后紅色通道顯示GFP::mCherry::LGG-1在傷口附近形成的聚集小體增多,且這些紅色的聚集小體在恢復3 h后進一步形成了管狀; 另一個有意思的現象是,在損傷恢復3 h后, GFP::mCherry::LGG-1還形成圍繞傷口的環狀結構(圖4)。

圖4 機械損傷對表皮細胞自噬的調節*Fig.4 Autophagy regulation by mechanical injury in epidermal cells* A. 針刺損傷線蟲的示意圖, 三角形指示的是針刺的位置, 正方形標注的是線蟲前半身和后半身的拍攝區域。B. DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1在對照或針刺損傷恢復1.5或3 h后的成年線蟲表皮中的排布情況。實線框顯示針刺區域并于右上角放大展示, 箭頭所指的為傷口區域, 虛線框標注紅色管狀結構并于左上角放大展示。比例尺代表20 μm。* A. Schematic diagram of a worm injured by needle, the triangle indicates the injury site, the boxes mark the imaging area of the anterior and posterior part. B. The pattern of DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1 in the adult epidermis with or without needle injury after 1.5 or 3 hours recovery, the solid boxes are enlarged in right insets, the arrows point to the injury site. Dashed areas with red tubular structures are enlarged in left insets. Scale bar is 20 μm.

3 討論

串聯融合蛋白GFP::mCherry::LGG-1/LC3已廣泛用于不同生物體的自噬研究[8,12-13]。但該系統的測量方法仍存在一定的問題。首先在同等條件下mCherry (15.8)本身的亮度是弱于GFP (33.6)的(https://www.fpbase.org/collection/2/), 其次研究發現與溶酶體共定位的mCherry::GFP::LC3聚集點仍然存在綠色信號,說明自噬小體與溶酶體融合過程中GFP并沒有立即淬滅[14]。這些問題導致通過主觀判斷聚集點的顏色來分辨自噬小體和自噬溶酶體是不準確的。作者以mCherry和GFP的亮度比0.47為閾值,根據定量結果分辨自噬溶酶體和自噬小體可提高準確度。但這個閾值是根據理論推理設定的。接下來還需要進一步驗證該報告系統的測量方法是否準確以及是否具有更加普遍的有效性。例如,可通過分析DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1與溶酶體的共定位試驗,將分辨自噬小體和自噬溶酶體的紅綠信號比值的進一步精確化。此外,該報告系統還存在一個缺陷,即在正常情況下紅色通道顯示GFP::mCherry::LGG-1形成聚集,這些聚集可能是由mCherry熒光蛋白本身易發生聚集的性質導致的而不是LGG分子本身的生理狀態,在利用該工具時應予以注意。

先前研究發現線蟲表皮支撐結構MUP-4的破壞可導致溶酶體活性增強[15]。有意思的是,作者發現紅色通道顯示GFP::mCherry::LGG-1在傷口附近形成的聚集小體增多,而綠色的自噬小體并沒有增多。因此,推測傷口處增多的紅色GFP::mCherry::LGG-1聚集小體可能不是自噬溶酶體,而是因結構損傷導致的溶酶體活性增強從而增加對GFP::mCherry::LGG-1的吞噬而導致的; 且在損傷后3 h, 紅色通道顯示GFP::mCherry::LGG-1標記了管狀結構的形成。而先前的研究顯示溶酶體活性增強會形成管狀結構[15], 這就支持了機械損傷傷口處溶酶體活性增強的假設。而這一假設還需要溶酶體染色或標記進一步證明。

利用小鼠模型的研究發現表皮細胞自噬通過調控細胞因子CCL2促進表皮細胞的遷移和增殖以及成纖維細胞的活化從而幫助傷口愈合[16]。然而自噬在受損細胞自身修復中的作用尚不清楚。線蟲的表皮主要由一個大的多核細胞Hyp7組成,是研究受損細胞自身修復機制的良好模型。有意思的是,作者發現GFP::mCherry::LGG-1在線蟲表皮受傷3 h后圍繞傷口形成了環狀結構(圖4)。而先前的研究報道了線蟲表皮細胞傷口愈合時肌動蛋白在受傷后30 min即可在傷口處形成完整的環狀[17]。最近研究[4]發現敲除線蟲自噬基因ATG-3或ATG-18并不影響傷口愈合過程中肌動蛋白環的形成。鑒于LGG-1聚集到傷口處形成環的時間晚于肌動蛋白,作者推測自噬并不參與肌動蛋白環的形成,而可能參與肌動蛋白環的降解或其他過程。

上皮細胞覆蓋于機體與外部環境接觸的表面,往往受到各種各樣的外界刺激,是機體應激反應的重要屏障,而自噬是細胞應對不利條件的重要自救手段。本研究構建的轉基因蟲株提供了一種方便且特異性的方法用于檢測線蟲表皮自噬流的情況,將為更加深入地了解線蟲表皮細胞中的自噬機制提供了有力的研究工具。

4 結論

本研究構建的DPY-7P::GFP::mCherry::LGG-1轉基因蟲株,不僅利用表皮特異性啟動子DPY-7P有效避免其他組織中熒光信號的干擾,而且在串聯融合蛋白mCherry::GFP::LGG-1的基礎上設計了對自噬溶酶體和自噬小體更客觀的定性定量方法。在蟲株構建完成后,通過RNAi敲降自噬調節因子LET-363/mTOR和RAB-7/RAB7A, 證明了該報告系統的測量方法既可以反映自噬誘導的增加也可反映自噬溶酶體形成的障礙。作者進一步利用該報告系統驗證了機械損傷造成表皮細胞遠離傷口的區域自噬增強的結論,并發現機械損傷可能導致傷口區域溶酶體的激活以及LGG-1聚集到傷口處形成環狀結構。