溫度和酸性環境對A型塞內卡病毒穩定性的影響

胡振儒, 趙司淼, 周回迎, 覃 堯, 冉旭華, 聞曉波

(海南大學動物科技學院, ?？?570228)

A型塞內卡病毒(Senecavirus A, SVA)作為豬水皰傳染病病原體之一, 2014年以來陸續在北美、南美及亞洲報道了相關疫情[1]。2015年我國廣東省報道首例因SVA感染的病例[2], 隨后在福建、山東、廣西等14個省份相繼出現SVA感染的報道,表明該病在我國逐漸呈現出區域流行趨勢,需重點加強對SVA的免疫防治工作[3]。鑒于SVA感染引起的新發傳染病在我國境內快速傳播,研發SVA疫苗保證高效接種才是防控傳染病的關鍵[4]。然而無論是滅活疫苗、減毒活疫苗還是病毒顆粒樣疫苗,疫苗效力與疫苗制劑中完整顆粒含量有關。完整的病毒顆粒受溫度變化或pH值降低的影響,病毒顆粒不可逆的裂解為五聚體,既減弱疫苗的免疫原性,也降低疫苗的質量。因此,病毒顆粒穩定性是研發高效疫苗的一個關鍵性因素,有助于提高免疫效力,延長免疫持續時間[5-6]。在小RNA病毒科中,如口蹄疫病毒[7]、脊髓灰質炎病毒[8]、腸道病毒[9]等多數小RNA病毒均具有熱與酸的不穩定性。研究[10]表明同為小RNA病毒科的甲型肝炎病毒具有熱與酸穩定性,甚至在高達80 ℃環境中或pH值<2.0的酸性溶液下仍能保持完整的病毒顆粒。所以僅從病毒分類上無法判斷SVA在溫度和酸性環境中是否具有穩定性。

目前,已知SVA是小RNA病毒科塞內卡病毒屬的唯一成員[11], 屬于無包膜、單股正鏈RNA病毒, SVA基因組約7 300 bp, 僅包含1個開放閱讀框(ORF), 編碼1個多聚蛋白,經蛋白酶水解后加工形成結構蛋白與非結構蛋白。其中VP1、VP2、VP3、VP4 4個結構蛋白構成20面體結構,具有兩重軸、三重軸和五重軸[12]。相關研究表明病毒顆粒的穩定性主要受衣殼蛋白的影響,衣殼蛋白上的靜電相互作用及氫鍵與弱疏水相互作用等非共價相互作用網絡在自身組裝、結構完整性與穩定性方面起著關鍵性作用[13]。然而,衣殼蛋白僅有部分界面殘基參與到組裝過程中,蛋白質相互作用界面上的殘基所形成的非共價相互作用結合能不均勻分布,導致這一部分熱點殘基貢獻出大部分結合能的現象。在高溫或酸性環境影響下,使衣殼蛋白中的熱點殘基提供的靜電相互作用力、氫鍵與鹽橋等穩定因素受到影響,病毒顆粒進而發生構象變化、裂解喪失病毒感染性,從而影響免疫原性[14]。相關研究[15]表明, FMDV衣殼亞基間氨基酸側鏈對顆粒穩定性和病毒的功能影響較大。所以熱點殘基在病毒顆粒穩定性方面的顯著貢獻,對了解SVA的熱穩定性與酸穩定性,以及后續熱穩定機制研究具有重要意義。

本研究使用生物信息學軟件對SVA衣殼蛋白的理化性質、衣殼蛋白間的熱點殘基與作用關系進行深入分析,推測病毒衣殼蛋白在熱或酸性環境下具有不穩定性; 通過在特定溫度與酸性環境下孵育SVA病毒液,使用TCID50檢測SVA病毒滴度,使用RT-qPCR對SVA RNA拷貝數進行定量,探究溫度和酸性環境對SVA穩定性的影響,為后續SVA疫苗的研發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 SVA衣殼蛋白穩定性生物信息學分析

1.1.1 SVA衣殼結構五聚體亞基理化特性分析

使用ProtParam或ProtScale服務器計算SVA衣殼蛋白(PDB:3CJI)的理化性質,包括親水性指數(GRAVY)、脂肪族指數、穩定性指數等參數計算; 使用ChimeraX 1.4分析SVA衣殼蛋白的三維結構;使用I-Mutant 3.0進行殘基突變分析。具體方法參照文獻[16]。

1.1.2 熱點殘基與蛋白質相互作用殘基分析

通過3個熱點殘基預測在線服務器PredHS、PPCHECK與KFC-2分析SVA衣殼蛋白熱點殘基。判定熱點殘基原則為SVA衣殼蛋白數據提交至上述3個熱點殘基分析網站,當被2個網站同時識別才判定為熱點殘基。而后將SVA衣殼蛋白數據提交至蛋白質相互作用、表面和組裝(jsPISA)網絡服務器上,識別SVA衣殼蛋白間相互作用網絡。具體方法參照文獻[17]。

1.2 SVA熱穩定和酸穩定試驗材料

1.2.1 細胞與病毒

SVA與IBRS-2細胞由海南大學動物科技學院動物醫學實驗室保存。

1.2.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(FBS)為美國Invigentech公司產品; TRIzol Reagent、2×SYBR Green qPCR Mix試劑為北京蘭杰柯科技公司產品; Random hexamer、RNase-free ddH2O、5×HiScript II Buffer、dNTP Mix、HiScriptⅡ反轉錄酶、RNA酶抑制劑為南京諾唯贊生物科技公司產品。實時熒光定量PCR儀(型號qTOWER 3)為德國Analytik公司產品。

1.3 SVA熱穩定和酸穩定試驗方法

1.3.1 細胞培養

IBRS-2細胞使用DMEM培養基(含10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,后續用于病毒培養與組織細胞半數感染量(TCID50)測定。

1.3.2 熱穩定和酸穩定試驗

將SVA病毒液設為溫度處理組與酸性環境處理組,其中未處理SVA病毒液作為對照組。溫度處理組孵育過程: 分別在4 ℃孵育4、8、15 d, 25 ℃孵育2、4、8 d, 37 ℃孵育8、16、48 h。酸性環境處理組孵育過程: SVA病毒液分別在pH 4.0、5.8的檸檬酸鹽緩沖溶液和pH 6.6、7.2的磷酸鹽緩沖溶液中以1∶9的比例孵育1 h, 后續用于TCID50測定病毒滴度變化。

1.3.3 病毒滴度測定

溫度處理組、酸性環境處理組和對照組用DMEM培養基進行10倍稀釋, 取10-1～10-10共10個稀釋度分別接種于長滿單層IBRS-2細胞的96孔培養板上, 每個稀釋度以每孔0.1 mL接種8孔,其中以DMEM培養基(含2% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)作為陰性對照、未稀釋病毒液作為陽性對照。經37 ℃、5% CO2細胞培養箱孵育1 h后, 棄病毒液后用0.01 mol·L-1PBS緩沖溶液(pH 7.2)漂洗2次, 每孔加入0.1 mL DMEM培養基(含2% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)。每天觀察并記錄細胞病變情況,按照Reed-Muench方法計算TCID50[18], 同一樣品進行3次獨立的病毒滴度檢測。

1.3.4 引物設計與合成

參考SVA/HB/2018毒株的VP1基因序列(登錄號為MN922286),設計1對特異性引物,上游引物序列為5′-TGGACTGGACATCGTATA-3′, 下游引物序列為5′-TTGCGTAGTAATTGAAGGT-3′。

1.3.5 總RNA提取及cDNA獲取

將SVA分別經溫度和酸性緩沖液孵育后,取100 μL病毒液接種到6孔細胞培養板上, 經37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育2 d, 提取SVA感染細胞后總RNA。利用反轉錄酶等試劑將總RNA反轉錄成cDNA, 具體操作參照文獻[19]。

1.3.6 RT-qPCR檢測及標準曲線的建立

以SVA cDNA為模板進行RT-qPCR檢測。PCR反應體系中, 2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL, 上、下游引物各0.6 μL, cDNA模板0.4 μL, 加ddH2O至20 μL。反應條件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s, 52 ℃ 30 s, 共40個循環。每個樣品做2個重復, 同1個樣品進行3次獨立的熒光定量PCR檢測。

以本實驗室構建的pcDNA3.1-VP1重組質粒為標準質粒,經10倍稀釋后,以拷貝數對數值為結果繪制標準曲線。病毒基因組拷貝數計算公式如下: 拷貝數/copies·μL-1=6.02×1014×質粒濃度(ng·μL-1)/[(質粒分子量+插入片段分子量)×660]。檢測標準質粒濃度為380.40 ng·μL-1, 質粒分子量加上插入片段分子量為6 250 bp, 則拷貝數初始值為5.55×1010copies·μL-1。

1.4 數據及統計學分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析及作圖,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)處理不同時間點的SVA RNA拷貝數,P<0.05表示差異顯著,具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 SVA衣殼蛋白生物信息學分析

2.1.1 SVA結構分析

分析SVA衣殼蛋白結構(圖1)時,發現部分組氨酸在五聚體界面處,如VP3中127 H、106 H與108 H以及VP2中197 H, 增加五聚體界面處的不穩定性[7]。使用I-Mutant 3.0服務器在默認參數下將VP3中127 H突變為R、106 H 突變為R, 則自由能變化值(DDG)>0.5, 說明蛋白質間穩定性得到極大提升。此外,將VP1中158 H突變為K時, DDG>0, 則增加衣殼蛋白間穩定性。

2.1.2 理化性質分析

對SVA衣殼蛋白理化性質分析結果(表1)顯示, SVA衣殼蛋白中VP1與VP4為堿性(PI>7), VP2與VP3為酸性(PI<7), 其中VP1不穩定指數>40, 說明VP1并不穩定。此外, VP1—VP4中親水性總平均值<0、芳香族占比<13.5、形成少量鹽橋,表明VP1—VP4均為穩定性較差的親水性蛋白質,且除VP2外,脂肪族指數均低于80, 意味著衣殼蛋白的耐熱性較低。

2.1.3 SVA衣殼蛋白熱點殘基和相互作用預測

分析衣殼蛋白間的熱點殘基有助于了解病毒衣殼蛋白的穩定性。本研究對SVA衣殼蛋白的熱點殘基進行了識別,結果 (表2)顯示,在VP1—VP4上分別檢測到16、11、16和5個熱點殘基。通過PISA蛋白相互作用分析, SVA衣殼蛋白的多數熱點殘基在界面處與相鄰殘基形成氫鍵,少數熱點殘基形成鹽橋,且至少以1種相互作用力參與到衣殼界面上,但缺少二硫鍵與范德華力等相互作用力[17,20]。

通過SVA衣殼蛋白間理化性質、熱點殘基及相互作用力的分析,推測SVA在高溫或酸性環境中具有熱不穩定性或酸不穩定性。

2.2 熱穩定性試驗

為驗證SVA具有熱不穩定性的推測,將SVA病毒液分別在4、25、37 ℃條件下處理不同時間,檢測病毒滴度的變化。對照組SVA病毒滴度為108.8TCID50·mL-1, 4 ℃處理4、8、15 d, 病毒滴度分別下降100.66、101.14、102.35TCID50·mL-1(圖2.A)。25 ℃處理2、4、8 d, 病毒滴度分別下降102.34、102.64、103.56TCID50·mL-1(圖2.B)。37 ℃處理8、16、48 h, 病毒滴度分別下降100.85、101.57、104.65TCID50·mL-1(圖2.C)。當SVA病毒液在不同溫度下孵育時間延長時, SVA病毒滴度均有不同程度的下降,說明SVA對外界環境中的溫度較敏感(P<0.05)。

圖2 SVA在4 (A)、25 (B)、37 ℃ (C)孵育后的病毒滴度變化☆Fig.2 The viral titer changes of SVA after incubation at 4 (A), 25 (B), and 37 ℃ (C)☆ A. 經4 ℃孵育后SVA病毒滴度下降; B. 經25 ℃孵育后SVA病毒滴度下降; C. 經37 ℃孵育后SVA病毒滴度下降。與CK相比, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.000 1?！?A. The virus titer of SVA decreased after incubation with 4 ℃; B. The virus titer of SVA decreased after incubation with 25 ℃; C. The virus titer of SVA decreased after incubation with 37 ℃. Compared with CK, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.000 1.

為進一步確認溫度對SVA RNA拷貝數的影響,采用RT-qPCR檢測經不同溫度孵育后的SVA病毒液在IBRS-2細胞中的RNA拷貝數情況。繪制的標準曲線為Y=-0.996 8X+38.235, 決定系數R2=0.996 8, 說明具有良好線性關系[Y值為 cycle threshold (Ct值),X值為拷貝數對數]。對照組SVA拷貝數對數值為30.11; 4 ℃處理4、8、15 d, 拷貝數對數值分別為30.07、28.61、8.12 (圖3.A); 25 ℃處理2、4、8 d后, 拷貝數對數值為25.43、22.52、14.36 (圖3.B); 37 ℃處理8、16和48 h后, 拷貝數對數值為28.64、26.19、22.53 (圖3.C)。SVA病毒液在不同溫度下孵育時間延長時, SVA RNA拷貝數顯著下降,導致病毒復制降低。病毒滴度與RNA拷貝數結果說明SVA具有熱不穩定性(P<0.05)。

圖3 SVA在4 (A)、25 (B)、37 ℃ (C)孵育后的拷貝數對數值☆Fig.3 Log copies value of SVA after incubation at 4 (A), 25 (B), and 37 ℃ (C) ☆ A. 經4 ℃孵育后的SVA拷貝數對數值變化; B. 經25 ℃孵育后的SVA拷貝數對數值變化; C. 經37 ℃孵育后的SVA拷貝數對數值變化。與CK相比, ns P>0.05, * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.000 1?！?A. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 4 ℃; B. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 25 ℃; C. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 37 ℃. Compared with CK, ns P>0.05, * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.000 1.

2.3 酸穩定性試驗

為驗證SVA具有酸不穩定性的推測,將SVA病毒液分別在不同pH值的檸檬酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液中孵育1 h, 檢測病毒滴度的變化。由圖4.A可見,對照組病毒滴度為108.42TCID50·mL-1; 在pH 4.0、5.8的檸檬酸鹽緩沖液中孵育1 h, 病毒滴度分別為104.90、105.79TCID50·mL-1; 在pH 6.6、7.2的磷酸鹽緩沖液中孵育1 h, 病毒滴度分別為106.68、107.60TCID50·mL-1。SVA病毒液孵育隨pH值的上升, SVA病毒滴度接近對照組病毒滴度,說明SVA對酸性環境較敏感(P<0.05)。

圖4 SVA在不同pH值孵育后的病毒滴度(A)與拷貝數對數值(B)☆Fig.4 The viral titer (A) and log value of copies number (B) of SVA after incubation in selected pH☆ A. 不同pH值緩沖液孵育后的SVA病毒滴度下降; B. 不同pH值緩沖液孵育后的SVA拷貝數對數值下降。與CK相比, **** P<0.000 1?！?A. The virus titer of SVA decreased after incubation with a buffer solution of selected pH values. B. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with buffer solutions with selected pH values. Compared with CK, **** P<0.000 1.

為進一步確認酸性環境對SVA RNA拷貝數的影響,將SVA病毒液在不同酸性緩沖液中孵育1 h, 通過RT-qPCR檢測SVA的RNA拷貝數。由圖4.B可見,對照組拷貝數對數值為22.31; SVA在pH 4.0、5.8的檸檬酸鹽以及在pH 6.6、7.2的磷酸鹽緩沖液中孵育1 h, SVA RNA拷貝數對數值分別為11.58、13.81及16.31、17.06, SVA病毒液在酸性環境孵育后,病毒顆粒穩定性受到影響。病毒滴度和RNA拷貝數結果說明SVA具有酸不穩定性(P<0.05)。

3 討論

自2007年美國報道首例SVA感染以來,我國的塞內卡病疫情形勢日益嚴峻。據報道,我國半數省份發現SVA感染的情況[3], 隨著SVA的流行導致毒株間的基因組變異與重組現象,加劇新毒株的形成與流行,進一步阻礙高效疫苗的研發,同時SVA持續的遺傳進化會增加毒力返強的風險[21]。因此,需要持續跟蹤監測SVA的流行情況,制訂合理防疫政策并開發安全高效的疫苗。分析SVA的酸和熱穩定性,為病毒培養、疫苗研發、運輸和儲存等提供一定的數據支持。本研究結果表明SVA具有酸和熱不穩定性,與小RNA病毒科中的甲型肝炎病毒不同,但與同科的口蹄疫病毒、脊髓灰質炎病毒及泰勒式鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)表現出相似特性。接種疫苗是預防傳染病的有效措施,病毒的穩定性對高效疫苗研發與應用至關重要。酸性和溫熱環境嚴重影響口蹄疫病毒、脊髓灰質炎病毒等小RNA病毒的穩定性,進而影響疫苗質量和機體免疫應答的誘導[22]。因此在滅活疫苗、減毒活疫苗等傳統疫苗研發中,提高病毒的熱和酸穩定性是提高疫苗質量和維持高免疫原性的前提[6]。鑒于衣殼結構是熱和酸穩定性的重要影響因素,本研究在對SVA衣殼蛋白結構分析時,發現大量組氨酸位于SVA五聚體界面處,組氨酸殘基質子化誘導的靜電斥力和相鄰五聚體之間的弱相互作用力可降低衣殼蛋白的穩定性[7]。理化性質分析表明VP1具有不穩定性且耐熱性較差,而VP2—VP4較為穩定但耐熱性依次遞減。此外, SVA衣殼蛋白間的熱點殘基較少,殘基間僅形成氫鍵和鹽橋。與泰勒式鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)相比,不僅SVA衣殼蛋白間的熱點殘基數少于泰勒式鼠腦脊髓炎病毒,而且相互作用力也弱于后者[17]。據此推斷,在溫熱或酸性環境下, SVA衣殼蛋白間的相互作用力受到影響,導致病毒顆粒穩定性下降。

溫熱或酸性環境變化可使衣殼蛋白變性,影響病毒衣殼蛋白的結構完整性。張燕紅等[23]在熱穩定性試驗中發現,將SVA在37、50 ℃等溫度下孵育較短時間后,病毒效價明顯下降。本研究在4、25 ℃等溫度下孵育較長時間,發現病毒效價以及在細胞中病毒RNA拷貝數均呈下降趨勢,表明SVA由于衣殼蛋白結構發生改變,從而影響病毒與受體結合,不能有效進入細胞。Strauss等[24]在對SVA病毒顆粒在磷酸鹽緩沖液進行酸穩定性測試時,發現pH<5.0的緩沖溶液中,病毒顆粒全部裂解成12S亞基,影響病毒的侵入和繁殖,本研究檢測的酸處理后病毒滴度減少的結果與此一致。然而,張燕紅等[23]在酸穩定性試驗中發現SVA具有耐酸性。也有研究[9]發現鈉鹽在小RNA病毒中產生很強的衣殼穩定作用,導致SVA酸穩定試驗結果出現差異。Cao等[25]使用冷凍電鏡觀察到酸孵育后的SVA中VP1 GH環和 VP3 GH環的結構發生變化,導致衣殼蛋白間的相互作用減弱,衣殼蛋白間的穩定性降低。Liu等[26]使用新型滅活劑β-丙內酯(BPL)制備SVA滅活疫苗,發現0.3%～0.5% BPL形成的酸性環境會導致病毒顆粒含量下降,影響疫苗的免疫保護效力。綜上,在SVA疫苗生產過程中可采用改造抗原或添加保護劑等方法提高病毒顆粒的穩定性。

小RNA病毒的快速進化使不同毒株在理化性質和熱點殘基上可能存在差異,后續研究將進一步分析。同時,本研究使用重組質粒繪制標準曲線進行絕對定量,質粒模板與SVA cDNA模板的擴增效率可能存在一定差異[27], 但并不影響總體趨勢的判斷?？傊? SVA衣殼蛋白形成病毒顆粒的相互作用力較弱,經高溫或酸性緩沖液孵育后,無論是病毒滴度變化,還是RNA拷貝數的變化,均表現出熱和酸不穩定趨勢。因此,本研究結果表明SVA具有熱與酸不穩定性,在特定條件下會影響病毒顆粒的穩定性。SVA感染引發的特發性水皰病在國內快速流行,研究SVA的熱和酸穩定性,不僅有助于了解病毒的流行潛力,還有助于新型高效疫苗和熱穩定保護劑的研發。

4 結論

本研究使用多個生物信息學軟件對SVA衣殼蛋白的理化性質和熱點殘基進行了分析,發現衣殼蛋白并不穩定,熱點殘基較少,蛋白質間僅通過弱相互作用力結合而形成病毒顆粒。SVA病毒液在不同溫度和不同pH緩沖液中孵育后,病毒滴度和RNA拷貝數均有所下降,證實SVA具有熱和酸不穩定性。