一株海洋真菌與細菌共培養次級代謝產物的研究

朱夏濠, 郝寶聰, 鄭 楊, 李申奧, 徐奧翔, 王夢如, 陳 敏

(揚州大學環境科學與工程學院, 江蘇揚州 225127)

海洋微生物,尤其是海洋真菌,是獲得結構新穎、生物活性顯著的次級代謝產物的重要來源,為海洋藥物先導化合物的篩選和發現提供了豐富的活性模板分子[1]。然而,隨著對海洋真菌研究的不斷深入,部分菌株被重復研究,已知化合物的重復分離率逐漸增加,新化合物的發現概率逐年降低。研究[2]表明,在傳統的試驗培養條件下,微生物只進行一些常規基因的表達,其體內大部分編碼化合物的基因是處于沉默狀態的。因此,為從微生物中分離得到更多的結構新穎的化合物,就必須想方設法激活微生物的沉默基因。共培養策略是利用微生物群落中的種間相互作用,來激發微生物沉默基因簇表達的一種直接有效且簡便易行的方法[3-4]。本研究采用共培養技術,將海洋真菌PenicilliumjanthinellumHK1-6與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 43300共培養,并對其共培養次級代謝產物進行分離與結構鑒定,為新型抗生素類化合物的發現提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Micromass Q-TOF高分辨質譜儀(美國 Waters公司); Bruker amazon SL離子阱液質聯用儀(德國BRUKER公司); AVANCE 600/400核磁共振儀(德國BRUKER公司); WTF-203B暗箱式紫外分析儀(上海精科實業有限公司); KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司); QYC-2112B雙層搖床(上海滬粵明科學儀器公司); CR21GIII超高速低溫冷凍離心機(日本HITACHI公司); L-2000高效液相色譜儀(HPLC) (日本HITACHI公司)。硅膠薄層層析板(煙臺江友硅膠開發公司); 柱層析硅膠48～75 μm (青島海洋化工公司); Sephadex LH-20 (美國Amersham Biosciences公司); ODS反相硅膠(香港優尼康公司); 色譜純甲醇(天津四友精細化學品公司)。

1.2 菌株來源

海洋真菌HK1-6分離于海南東寨港紅樹林自然保護區的海桑根際土壤樣品,經分子生物學及形態學鑒定為微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)[5], GenBank登錄號為KY412802。真菌P.janthinellumHK1-6 與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(S.aureus) ATCC 43300均保存于揚州大學海洋科學與技術研究所。

1.3 發酵、提取與分離

1) 發酵: 采用PDB-LB培養基(每1 L純凈水中加入10 g葡萄糖, 100 g土豆浸出液, 2.5 g酵母膏, 15 g海鹽, 5 g蛋白胨, 2.5 g NaCl, pH 7.0)進行發酵, 每400 mL培養基中接種1 mL真菌以及接種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(吸光度為0.5) 200 μL, 共發酵液15 L, 于28 ℃搖床(140 r·min-1)上培養2周。

2) 提取: 利用超高速低溫冷凍離心機對菌體與發酵液進行分離(8 000 r·min-1離心5 min), 取上清發酵液,用等體積的乙酸乙酯萃取3次,減壓濃縮后得到乙酸乙酯提取物7.5 g。

3) 分離: 上述提取物采用減壓硅膠柱層析,以石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇為溶劑進行梯度洗脫,分為12個組分(Fr.1-Fr.12), 再經反復的正、反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析及HPLC分離純化,最終分別從Fr.2中分離得到化合物4(6.3 mg); 從Fr.3中分離得到化合物3(12.1 mg); 從Fr.4中分離得到化合物2(2.3 mg); 從Fr.6中分離得到化合物1(9.2 mg)和化合物5(12.0 mg)。

1.4 LC-MS/MS測試與分子網絡分析

采用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀對提取物進行檢測。色譜柱為YMC-Park-C18column (5 μm, 250 mm×4.6 mm)。流動相為甲醇與水,流速為0.8 mL·min-1, 梯度洗脫條件如下: 0～7 min, 30%～70%甲醇; 7～14 min, 70%～85%甲醇; 14～20 min, 85%～90%甲醇; 20～25 min, 90%～95%甲醇; 25～27 min, 95%甲醇。進樣量為8 μL。質譜采用正離子模式,離子源為ESI源。

將mzXML格式的質譜數據上傳至GNPS分子網絡平臺構建分子網絡。具體參數設置: 前體離子質量誤差值2.0 Da, 碎片離子質量誤差值0.5 Da, 匹配的二級質譜碎片峰≥6, 節點之間相關余弦值≥ 0.7。 最終生成的質譜分子網絡圖借助Cytoscape軟件實現可視化。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1為白色粉末。其核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)表明結構中含有一個吲哚片段及一個羧基(δC173.5)。具體核磁數據如下:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH10.90 (1H, s, NH), 7.49 (1 H, d,J=8.0 Hz, 7-H), 7.34 (1 H, d,J=8.0 Hz, 4-H), 7.22 (1H, d,J=2.4 Hz, 2-H), 7.07 (1H, td,J=8.0, 1.2 Hz, 5-H), 6.97 (1H, td,J=8.0, 1.2 Hz, 6-H), 3.62 (2H, s, 10-H);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC173.5 (C, C-1), 136.1 (C, C-9), 127.3 (C, C-8), 123.9 (C, C-2), 121.0 (CH, C-6), 118.6 (CH, C-7), 118.4 (CH, C-5), 111.3 (CH, C-4), 107.8 (C, C-3), 31.2 (CH2, C-10)。以上波譜數據與文獻[5]報道基本一致,因此鑒定化合物1為吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid)。

化合物2為無色針狀結晶化合物,核磁數據如下:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH7.89 (1H, s, 4-OH), 5.41 (1H, brs, 6-Ha), 5.32 (1H, brs, 6-Hb), 5.13 (1H, s, 2-H), 3.86 (3H, s, 3-OCH3), 1.66 (3H, s, H-7);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC170.4 (C, C-1), 140.8 (C, C-5), 115.9 (CH2, C-6), 102.8 (C, C-4), 89.9 (CH, C-2), 60.28 (CH3O, C-8), 17.56 (CH3, C-7)。以上波譜數據與文獻[6]報道基本一致,因此鑒定化合物2為青霉酸(penicillic acid)。

化合物3為淡黃色油狀物,是一個對稱結構,核磁數據僅出現一半信號。其氫譜如下:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH11.48 (2H, s, 3-OH, 3′-OH), 6.83 (2H, brs, 2-H, 2′-H), 6.59 (2H, brs, 4-H, 4′-H), 6.03 (2H, d,J=2.6 Hz, 6-H, 6′-H), 2.02 (6H, s, 5-H, 5′-H)。以上波譜數據與文獻[7]報道基本一致,因此鑒定化合物3為二苯醚類化合物diorcinol。

化合物4為棕紅色油狀物。其結構存在對稱軸,部分核磁數值重疊,具體核磁數據如下:1H NMR (acetone-d6, 600 MHz)δH9.03 (1H, s, 3-OH), 6.01 (1H, s, H-4),5.95 (1H, s, H-2), 2.15 (3H, s, H-7);13C NMR (acetone-d6,150 MHz)δC158.4 (C, C-1, C-3), 139.7 (C, C-5), 107.4 (C, C-4, C-6), 99.6 (C, C-2), 20.6 (CH3, C-7)。結合文獻[8]數據,確定化合物4為苯酚類化合物orcinol?；衔?是化合物3的單體結構。

化合物6為棕色油狀物。高分辨質譜HR-ESI-MS給出m/z464.2562 [M+H]+, 提示分子式為C27H33N3O4(C27H34N3O4+理論值為464.2544)。其核磁數據如下:1H NMR (acetone-d6, 600 MHz)δH7.16 (1H, d,J=8.4 Hz, H-4), 6.70 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5), 6.38 (1H, d,J=7.8 Hz, H-24), 4.98 (1H, d,J=7.8 Hz, H-25), 4.28 (1H, brs, Ha-12), 3.91 (1H, brs, Ha-16), 3.41 (1H, brs, Hb-12), 3.16 (1H, overlapped, H-20), 3.03 (1H, m, Hb-16), 2.52 (1H, brs, Ha-10), 2.42 (1H, m, Ha-15), 2.33 (1H, brs, Hb-10), 2.24 (1H, m, Ha-19), 2.10 (1H, m, Hb-19), 2.08 (1H, m, Hb-15), 1.80 (1H, m, H-14), 1.50 (3H, s, H-17), 1.43 (3H, s, H-27), 1.41 (3H, s, H-28), 1.14 (3H, s, H-22), 0.88 (3H, s, H-23);13C NMR (acetone-d6, 150 MHz)δC182.8 (C, C-2), 168.6 (C, C-18), 147.5 (C, C-6), 140.0 (CH, C-24), 136.5 (C, C-7), 134.6 (C, C-8), 125.8 (C, C-9), 122.1 (CH, C-4), 117.8 (CH, C-5), 116.1 (CH, C-25), 80.4 (C, C-26), 72.2 (C, C-13),65.0 (C, C-11), 63.6 (C, C-3), 57.6 (CH2, C-12), 53.5 (CH2, C-16), 52.3 (CH, C-20), 46.7 (C, C-21), 38.5 (CH2, C-15), 36.0 (CH2, C-10), 30.6 (CH3, C-28), 30.4 (CH3, C-27), 23.9 (CH, C-14), 23.1 (CH3, C-23), 20.8 (CH2, C-19), 20.5 (CH3, C-22), 12.4 (CH3, C-17)。通過與文獻[9]數據對比,確定該化合物為吲哚生物堿類化合物paraherquanide N。

2.2 化合物結構

采用共培養技術,將海洋真菌P.janthinellumHK1-6與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(S.aureus) ATCC 43300共培養,并對其共培養次級代謝產物進行分離與結構鑒定,最終獲得5個化合物(圖1), 包括吲哚-3-乙酸(1)、青霉酸(2)、二苯醚類化合物diorcinol (3)、苯酚類化合物orcinol (4)以及吲哚生物堿類化合物paraherquanide N (5)。運用液質聯用技術(LC-MS)獲得共培養產物的二級質譜(MS/MS), 通過全球天然產物分子網絡(GNPS)平臺形成質譜-分子網絡,又鑒定了處于吲哚生物堿類分子簇中的 3 個化合物notoamide B (6)、paraherquanide F (7)及paraherquamide E (8)(圖1)。

圖1 化合物1-8的結構Fig.1 Structures of compounds 1-8

2.3 抗菌活性測試

本課題組在前期研究[10-11]中已測試化合物2和3的抗菌活性, 2個化合物均顯示出較強的抗菌活性,尤其是化合物2顯示出對S.aureusATCC 43300的強抗菌活性。本研究采用濾紙片法[12]測試了化合物1、4、5的抗菌活性,遺憾的是當濃度為100 μg·片-1時, 3個化合物對測試菌株均沒有顯示出抗菌活性。

2.4 質譜-分子網絡分析

本研究采用基于 LC-MS/MS 的分子網絡技術對共培養發酵產物的吲哚生物堿類化合物的化學多樣性進行了重點分析,所形成的質譜-分子網絡見圖2。該分子網絡中共含有257個節點,節點數≥ 3個的分子簇有13個。經與GNPS數據庫檢索比對,可知部分分子簇為甾醇類、吡喃酮類及脂肪酸類化合物。同時還以分離到的吲哚生物堿化合物paraherquanide N (5)對應的節點(m/z464)為指導,凸顯出如圖2紅框所示的吲哚生物堿類化合物分子簇。該分子簇中包含4個母離子節點,除paraherquanide N (m/z464)外,節點m/z448與GNPS數據庫中的notoamide B (6)[13]高度匹配。仔細分析4個節點的MS/MS裂解碎片(表1), 并結合各母離子之間的分子量差異,最終確定節點m/z462為化合物paraherquamide F (7)[14], 節點m/z478為化合物paraherquamide E (8)[15]。真菌P.janthinellumHK1-6在純培養時可代謝產生吲哚生物堿類化合物paraherquanide N (5)和paraherquamide E (8)等[16], 而化合物6和7為首次從該真菌發酵產物中檢測發現,表明細菌與其共培養后,一定程度上激活了真菌分泌吲哚生物堿的代謝潛能。

表1 吲哚生物堿類化合物二級質譜碎片離子Tab.1 Observed MS/MS fragmentation ions of indole alkaloids

圖2 共培養發酵產物的質譜-分子網絡圖Fig.2 Mass Spectrometry-Molecular Network of the co-culture fermentation products

3 小結與討論

吲哚-3-乙酸(1)作為信號分子調控細菌基因表達,并參與調節細菌多種生物學過程和行為[17]; 青霉酸(2)及diorcinol (3)衍生物均具有抗菌、細胞毒等多種生物學活性[10-11];而吲哚生物堿類化合物則具有良好的細胞毒、殺蟲等活性[12-13]。這些化合物作為真菌P.janthinellumHK1-6與細菌S.aureusATCC 43300共培養體系中的主要代謝產物,與2種微生物的化學防御機制密切相關。真菌HK1-6在細菌刺激下,產生強抗菌活性化合物青霉酸(2)及diorcinol (3)來抵御細菌帶來的生存壓力。青霉酸是真菌HK1-6純培養時的主要代謝產物; 當真菌HK1-6與其他真菌共培養時,其代謝產生青霉酸的產量有所提升[18]。由此可見,無論是與真菌還是與細菌共培養,青霉酸均是HK1-6的重要化學防御物質。Diorcinol (3)在真菌HK1-6純培養時并未被發現,其是真菌HK1-6在細菌刺激下產生的。據報道diorcinol (3)經常在真菌被細菌污染的混合培養體系中發現,其與許多真菌的化學防御機制有關[19]。真菌HK1-6在共培養體系中還代謝產生純培養時不曾被發現的具有細胞毒等活性的吲哚生物堿類化合物notoamide B (6)和paraherquamide F (7)。同時,細菌ATCC 43300也通過加強分泌對其生長和機能修復有重要促進作用的吲哚-3-乙酸(1)來提高生存競爭力,在共培養體系中維護自身生長。

綜上所述,在實驗室條件下建立人工微型共培養體系,可有效激活微生物沉默基因簇的表達,產生具有抗菌、細胞毒等活性的化合物,同時提高某些化學防御物質的產量,從而抵御外來微生物帶來的生存競爭,獲得營養物質和生存空間。在共培養體系中被誘導產生的化合物均顯示出多種活性,尤其是抗菌活性。共培養作為一種非靶向的基因激活策略,可刺激微生物產生結構多樣化的抗生素類次級代謝產物,對發現新的抗生素類化合物具有十分重要的意義。