表達PEDV S蛋白重組仙臺病毒的構建及其免疫原性研究

鄒靜嫻, 孟 慧, 潘朔楠, 陳振海,2, 牟春曉,2*

(1. 揚州大學獸醫學院, 江蘇揚州 225009; 2. 揚州大學江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心, 江蘇揚州 225009)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是一種腸道冠狀病毒,能引起感染豬嚴重嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀[1]。各年齡段豬均易感PEDV, 感染仔豬后發病急,病死率高達100%。1970年在歐洲首先發現PEDV G1型[2], 2010年一種高致病性PEDV突變體(G2型)在中國出現,隨后快速傳播至北美、歐洲和亞洲等許多國家[3]。目前,變異PEDV已成為導致仔豬腹瀉和高病死率的主要病原體,給全球養豬業造成重大經濟損失。

PEDV ORF2編碼的纖突糖蛋白(spike, S)屬于亞穩態的Ⅰ類融合蛋白,主要負責病毒與宿主細胞的吸附和膜融合,包括受體結合片段S1 (1～789 aa)和膜融合片段S2 (790～1 383 aa) 2個部分。S1包含優勢抗原COE區域(499～638 aa)及2個B淋巴細胞位點(744～755和756～771 aa), S2的胞外區有胰酶切割位點[4]。S蛋白在與宿主細胞受體的相互作用以及進入宿主細胞的過程中發揮著重要作用,還與病毒的體外適應性生長及體內毒力衰減密切相關[5]。更重要的是, S蛋白是誘導機體發生中和抗體反應的關鍵蛋白,因此S蛋白是設計開發PEDV疫苗的首選抗原蛋白。

2011年以來,我國大部分地區的豬場大規模暴發PED, 新生仔豬病死率達90%以上,說明以CV777毒株為基礎的商品化PEDV滅活、弱毒等傳統疫苗和免疫方式難以控制變異株的流行。因此,利用基因工程技術研發新型疫苗成為當前的熱點。隨著哺乳動物細胞中的基因傳遞和表達技術在現代生物學中的廣泛應用,先進的基因傳遞工具,如反轉錄病毒載體、腺病毒載體和陽離子脂質試劑等,對基因治療和核酸疫苗起到重要的推動作用[6]。盡管目前已開發出多種DNA載體復合物,但重組病毒載體因為其基因表達能力強和感染宿主效果好等優勢,仍是傳遞靶標基因的主要選擇。

仙臺病毒(Sendai virus, SeV)又稱乙型副流感病毒,屬于副黏病毒屬, 1953年在日本分離獲得。近年來學者對仙臺病毒在細胞生物學和工業上有著廣泛的研究,發現仙臺病毒能作為重組病毒載體用于核酸疫苗的研發。仙臺病毒作為病毒載體的優勢在于免疫原性強; 與細胞表面受體的識別、吸附、融合時間短,感染過程不受細胞周期的影響; 外源基因表達效率高且可調控; 病毒復制周期完全在胞質中,安全性高; 基因組為不分節段的單股負鏈RNA, 重組概率大大降低; 可在多種宿主的組織中表達[6]。目前,應用反向遺傳學技術開發的新一代仙臺病毒載體,不僅可進一步提高載體的安全性,還可增加載體的容量,降低機體抗病毒免疫反應。另外,仙臺病毒經呼吸道黏膜感染,能誘導良好的黏膜免疫反應,由于機體的“共同黏膜免疫系統”, 使得仙臺病毒更適合作為黏膜免疫的重組疫苗載體,有效地抵抗黏膜感染的病毒。

本研究擬將PEDV流行株S蛋白全長基因插入仙臺病毒基因組P基因與M基因之間,構建能表達PEDV S蛋白的重組仙臺病毒; 利用大腸埃希菌原核表達純化PEDV截短S蛋白(64～1 140 bp)作為對照,以小鼠為模型評價并比較重組仙臺病毒表達和大腸埃希菌表達的S蛋白所誘導的PEDV特異性免疫反應,為評價該重組仙臺病毒在豬體上的免疫原性和免疫效力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 質粒、細胞、病毒和試驗動物

原核表達載體pET-30(a)、仙臺病毒(SeV)載體系統包括病毒基因組骨架載體pBeloBAC-SeV以及輔助質粒pCAGGS-T7-opt、pCAGGS-SeV-NP、pCAGGS-SeV-P、pCAGGS-SeV-L和對照質粒pBeloBAC-SeV-GFP為本實驗室保存; 豬睪丸細胞(ST)、乳倉鼠腎細胞(BHK-21)和非洲綠猴腎細胞(Vero)由本實驗室保存;E.coliTop 10和BL21(DE3)感受態細胞由本實驗室制備并保存; PEDV-GX6/2021毒株(GenBank登錄號為OP603897)、SeV毒株為本實驗室保存; 6周齡BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心。

1.1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒、DNA聚合酶PrimeStar Max、T4 DNA連接酶和限制性內切酶等為日本TaKaRa公司產品; 反轉錄試劑盒為北京全式金生物技術公司產品; PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均為美國Omega公司產品; 超敏ECL化學發光試劑盒為蘇州新賽美生物科技公司產品; His單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體、Dylight 488標記的羊抗鼠IgG抗體為上海生工生物工程公司產品; DMEM培養基和胎牛血清均為美國Gibco公司產品; Lipofectamine 3000和CFSE熒光染料為美國Invitrogen公司產品; RIPA組織細胞裂解液、IPTG、淋巴細胞分離液、脫脂牛奶等為北京索萊寶生物科技公司產品; PVDF膜和弗氏佐劑為美國Sigma公司產品; SeV P蛋白單克隆抗體、PEDV S蛋白單克隆抗體為本實驗室保存。

1.2 引物的設計與合成

根據PEDV-GX6/2021毒株全基因序列,設計擴增截短的PEDV S 基因(64～1 140 bp)的特異性引物, 引物F1為5′-CTGGGATCCGATGTCACCAGGTGCTCAG-3′, 引物R1為5′-CCGGGAATTCGTAAGTGTCACTTTAAG-3′, 在上游引物5′端引入酶切位點BamHⅠ, 在下游引物5′端引入酶切位點EcoRⅠ, 用于構建原核表達S蛋白的重組質粒; 另設計擴增全長PEDV S 基因(4 140 bp)的特異性引物, 引物F2為5′-GCTTTCACGGCGCGCCACCATGAAGTCTTTAACCTACTTCTGGTTGTTCTTACC-3′, 引物R2為5′-AGGATGGGACGTCTTAAACTTCGTAAGGTTGAAGTCTAGGAC-3′, 在上游引物5′端引入酶切位點AscⅠ, 在下游引物5′端引入酶切位點AatⅡ, 用于構建重組表達S蛋白的SeV感染性克隆質粒。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 原核表達PEDV S蛋白重組質粒的構建

使用病毒RNA提取試劑盒提取PEDV-GX6/2021毒株全基因組RNA,并將其反轉錄成cDNA。以該cDNA為模板、F1和R1為引物PCR擴增截短的S基因。將擴增的S基因進行膠回收純化,利用酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ連入載體pET-30(a), 構建重組質粒pET-30(a)-PEDV-S, PCR鑒定和序列測定驗證后保存備用。

1.4 原核表達PEDV S蛋白誘導表達與純化

將重組質粒pET-30(a)-PEDV-S轉化至BL21(DE3)感受態細胞中,挑取單菌落培養過夜,按照1∶100 的比例擴大培養,當細菌D600 nm值達到0.4～0.6時,加入0.2 mmol·L-1IPTG于16 ℃誘導培養20 h; 5 000 r·min-1離心10 min收集菌體并超聲破碎,分別收集全菌、上清、沉淀,加入5×蛋白質電泳緩沖液煮沸,經SDS-PAGE檢測,驗證S蛋白表達位置及可溶性,同時設置pET-30(a)空載體作為陰性對照。

將收集的重組蛋白樣品進一步切膠純化, SDS-PAGE電泳后將蛋白膠轉至預冷的KCl溶液(0.25 mmol·L-1)中5 min, 使蛋白質條帶呈現白色。根據先前實驗室確定的S蛋白表達的位置,切下含目的蛋白的膠條與PBS溶液混合裝入透析袋中, SDS-PAGE電泳液進行電洗脫, 3 h后去掉膠塊,上清裝入透析袋中并透析過夜。次日,檢測原核表達的S蛋白濃度并濃縮至1 mg·mL-1。同時取少量純化后的蛋白質進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白質純度。

1.5 重組仙臺病毒感染性克隆的構建

以方法1.3中獲得的PEDV cDNA為模板, F2和R2為引物進行PCR擴增全長S基因。將擴增的S基因進行膠回收純化,用AscⅠ和AatⅡ對S基因片段和載體pBeloBAC-SeV進行雙酶切,并用T4 DNA連接酶構建重組SeV感染性克隆質粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S, PCR鑒定和序列測定驗證后保存備用。

1.6 重組仙臺病毒的拯救與鑒定

將pBeloBAC-SeV-PEDV-S及其輔助質粒,按pCAGGS-T7-opt 0.4 μg、pCAGGS-SeV-NP 0.2 μg、pCAGGS-SeV-P 0.2 μg、pCAGGS-SeV-L 0.6 μg、pBeloBAC-SeV-PEDV-S 1.1 μg的比例,利用Lipofectamine 3000轉染至BHK-21細胞中,同時設置轉染pBeloBAC-SeV-GFP及輔助質粒作為陽性對照; 37 ℃、5% CO2培養至陽性對照細胞出現明顯的綠色熒光時,收獲轉染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的細胞上清,獲得SeV-PEDV-S重組病毒。

將重組病毒SeV-PEDV-S進一步感染ST細胞,并設置未感染病毒的細胞為對照, 37 ℃、5% CO2培養,觀察細胞病變并進行間接免疫熒光染色(IFA)。細胞單層用4%多聚甲醛進行室溫固定10 min, PBS清洗后, 將0.2% Triton X-100和4% BSA按1∶1的比例混勻加入細胞單層進行細胞膜打孔和封閉孵育30 min; 隨后,運用SeV P蛋白單克隆抗體作為一抗37 ℃孵育1 h, Dylight 488標記羊抗鼠IgG作為二抗室溫避光孵育1 h; 最后使用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光,以檢測重組病毒SeV-PEDV-S是否成功拯救。

1.7 重組仙臺病毒生長曲線的測定

將ST細胞鋪于6孔板中,以MOI=0.01分別感染SeV和SeV-PEDV-S, 同時設置未接毒細胞作為對照; 置于37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h后, 棄去上清并加入含2%血清的培養基; 繼續培養6、12、24、36、48、60 h, 分別收集病毒液并進行病毒效價測定,將ST細胞鋪于96孔板中, 收集的病毒液用含2%血清的培養基梯度稀釋后感染ST細胞, 每孔100 μL, 每個梯度設置4個重復; 置于37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h, 每孔補加50 μL含2%血清的培養基繼續培養; 觀察細胞病變情況并標記,按照Karber法計算病毒效價。

1.8 PEDV S蛋白表達的Western blot鑒定

將重組病毒SeV-PEDV-S感染ST細胞,并設置未接毒細胞作為對照, 37 ℃、5% CO2培養48 h后, RIPA緩沖液裂解細胞,取上清進行SDS-PAGE電泳。將分離膠的蛋白質電轉移至PVDF膜上, 用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h, TBST清洗后, 以PEDV S蛋白單克隆抗體作為一抗孵育過夜, HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗室溫孵育2 h, 最后使用超敏ECL化學發光試劑盒進行顯影,觀察條帶。

取純化后的原核表達S蛋白進行SDS-PAGE電泳,同時設置對照。按照上述Western blot試驗方法,以S蛋白單克隆抗體作為一抗, HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗檢測原核表達S蛋白的特異性。

1.9 小鼠的免疫與抗S蛋白特異性抗體的鑒定

取36只6周齡BALB/c雌性小鼠,隨機均分為4組, 分別以滴鼻和每只皮下注射250 μL的方式免疫SeV-PEDV-S組(106.2TCID50·mL-1)、SeV組(107TCID50·mL-1)、PEDV-S蛋白組(1 mg·mL-1+弗氏佐劑)和DMEM組。首免后第3、5周分別加強免疫。第3次免疫后10 d對各組小鼠進行采血,并運用分離的血清作為一抗進行IFA和Western blot試驗,鑒定小鼠血清中特異性抗體產生情況。

以方法1.6中IFA試驗鑒定小鼠血清中特異性抗體的產生情況, PEDV按MOI=0.05感染Vero細胞, 48 h后棄去培養基,以小鼠血清作為一抗(1∶200稀釋), Dylight 488標記羊抗鼠IgG作為二抗分別進行孵育,最后觀察特異性綠色熒光。以分離的SeV-PEDV-S組小鼠血清作為一抗, HRP標記羊抗鼠IgG作為二抗,以方法1.7中Western blot試驗檢測血清中特異性抗體的產生情況。

1.10 免疫后小鼠血清中和抗體的測定

對第3次免疫后10 d的小鼠血清進行中和抗體滴度測定,將PEDV (100 TCID50)與倍比稀釋的血清等體積混合, 37 ℃作用1 h后加到96孔板培養的Vero細胞單層上, 37 ℃、5% CO2吸附2 h后棄去上清,加入正常培養基繼續培養2～3 d; 顯微鏡下觀察并記錄病變產生情況,血清抗體中和PEDV的滴度按照Karber方法計算。

1.11 免疫后小鼠T淋巴細胞增殖的檢測

第3次免疫后10 d每組選取5只小鼠,處死并無菌分離小鼠脾臟,并研磨成單細胞懸液,利用淋巴細胞分離液分離T淋巴細胞并計數。按照107個·mL-1的濃度加入CFSE熒光染色液, 37 ℃避光孵育10 min, 隨后加入預冷且含10%血清的培養基終止染色反應, PBS清洗后獲得綠色熒光標記的T淋巴細胞。分別向每個免疫組的T淋巴細胞中加入105TCID50的PEDV, 置于37 ℃、5% CO2條件下培養4～5 d, 收集細胞并用流式細胞術檢測每組中T淋巴細胞的增殖情況。采用FCS Express 4軟件對流式細胞檢測數據進行分析。

1.12 統計學分析

2 結果與分析

2.1 原核表達PEDV S蛋白重組質粒的鑒定

使用S基因特異性引物,以PEDV cDNA為模板,成功擴增出目的基因片段1 077 bp (圖1)。將該片段克隆至pET-30(a)載體中,構建重組質粒pET-30(a)-PEDV-S, 酶切重組質粒鑒定,根據核酸電泳結果,得到了重組質粒(圖1)。

圖1 原核表達PEDV S蛋白重組質粒的構建*Fig.1 The construction of recombinant plasmid pET-30(a)-PEDV-S* M1. DL2000 DNA分子量標準, 1. 截短S基因PCR擴增; M2. DL5000 DNA 分子量標準, 2. 重組質粒pET-30(a)-PEDV-S酶切鑒定, 3. 重組質粒pET-30(a)-PEDV-S電泳鑒定。* M1. DL2000 DNA marker, 1. PCR amplification of truncated S gene; M2. DL5000 DNA marker, 2. identification of pET-30(a)-PEDV-S by reconstriction enzymes, 3. identification of pET-30(a)-PEDV-S by agarose gel electrophoresis.

2.2 原核表達PEDV S蛋白的表達純化與鑒定

重組質粒pET-30(a)-PEDV-S轉化至感受態細胞BL21(DE3)中, 使用IPTG低溫誘導蛋白表達,收集細菌并超聲破碎。根據SDS-PAGE電泳結果可以發現,截短的S蛋白主要在細菌裂解沉淀中表達,蛋白質大小約為39.3 ku, 融合6×His標簽后大小約為45 ku, 符合預期結果。經過切膠純化后,獲得純度和濃度較高的重組PEDV S蛋白(圖2.A)。對原核表達S蛋白的特異性進行Western blot檢測,結果發現,原核表達S蛋白泳道出現特異條帶,融合蛋白分子量約為45 ku, 符合預期結果,而對照樣品泳道中未出現特異條帶(圖2.B)。

圖2 原核表達PEDV S蛋白的表達純化與鑒定*Fig.2 The expression, purification, and identification of PEDV S protein* A圖中, M. 蛋白質分子量標準, 1. pET-30(a)全菌, 2. pET-30(a)上清, 3. pET-30(a)沉淀, 4. pET-30(a)-PEDV-S全菌, 5. pET-30(a)-PEDV-S上清, 6. pET-30(a)-PEDV-S沉淀, 7. 純化的S蛋白; B圖中, M. 蛋白質分子量標準, 1. BL21(DE3)上清, 2. 純化的S蛋白。* In figure A, M. protein marker, 1. pET-30(a) whole cell, 2. pET-30(a) supernatant, 3. pET-30(a) precipitation, 4. pET-30(a)-PEDV-S whole cell, 5. pET-30(a)-PEDV-S supernatant, 6. pET-30(a)-PEDV-S precipitation, 7. purified S protein; In figure B, M. Protein marker, 1. BL21(DE3) supernatant, 2. purified S protein.

2.3 重組仙臺病毒感染性克隆的鑒定

將擴增得到的全長S基因克隆于pBeloBAC-SeV, 構建重組質粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S并進行PCR擴增鑒定重組質粒。根據核酸電泳結果,成功擴增出4 140 bp的S基因片段(圖3.B), 鑒定發現,成功得到重組質粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S (圖3.C)。

圖3 重組仙臺病毒感染性克隆的構建與鑒定*Fig.3 The construction and identification of the recombinant SeV plasmid* A圖中, 重組質粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S構建示意圖; B圖中, M1. DL5000 DNA分子質量標準, 1. 全長S基因PCR擴增(4 140 bp); C圖中, M2. DL15000 DNA分子質量標準, 2. 重組質粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S電泳鑒定, 3. 重組質粒pBeloBAC-SeV-PEDV-S的PCR鑒定。* In figure A, the construction diagram of recombinant plasmid pBeloBAC-SeV-PEDV-S; In figure B, M1. DL5000 DNA marker, 1. PCR amplification of S gene (4 140 bp); In figure C, M2. DL15000 DNA marker, 2. identification of pBeloBAC-SeV-PEDV-S by agarose gel electrophoresis, 3. identification of pBeloBAC-SeV-PEDV-S by PCR.

2.4 重組仙臺病毒的鑒定

為獲得SeV-PEDV-S重組病毒,將pBeloBAC-SeV-PEDV-S及其輔助質粒按比例轉染細胞,同時轉染pBeloBAC-SeV-GFP和輔助質粒作為陽性對照。逐日觀察陽性對照的綠色熒光強度,結果發現第4天陽性對照有明顯的綠色熒光,收集轉染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的細胞上清接種ST細胞,經觀察轉染pBeloBAC-SeV-PEDV-S的細胞上清能引起細胞病變,且IFA檢測有特異性熒光,而對照細胞中未出現特異性熒光和細胞病變(圖4.A), 說明成功獲得SeV-PEDV-S重組病毒。運用Western blot試驗對SeV-PEDV-S重組病毒中S蛋白的特異性進行檢測,結果發現, SeV-PEDV-S重組病毒感染的細胞樣品泳道出現特異條帶,分子量約為180 ku, 而對照樣品泳道中未出現特異條帶(圖4.B)。通過對重組仙臺病毒生長曲線的測定,發現該SeV-PEDV-S重組病毒與野生型SeV生長趨勢一致,且毒價為106.2TCID50·mL-1(圖4.C)。

圖4 重組仙臺病毒的鑒定和生長曲線的測定*Fig.4 The determination and growth curve of recombinant SeV* A. SeV-PEDV-S感染后的細胞病變觀察和IFA鑒定, 標尺為50 μm; B. Western blot試驗檢測SeV-PEDV-S中S蛋白的表達, M. 蛋白質分子量標準, 1. SeV感染的ST細胞樣品, 2. SeV-PEDV-S感染的ST細胞樣品; C. 重組仙臺病毒的生長曲線測定。* A. the cytopathological observation and IFA identification after SeV-PEDV-S infection, bar is 50 μm; B. detection of S protein expression in SeV-PEDV-S by Western blot, M. protein marker, 1. SeV infected ST cells, 2. SeV-PEDV-S infected ST cells; C. the growth curve of recombinant SeV.

2.5 免疫后小鼠血清特異性抗體的產生

以各免疫組小鼠第3次免疫10 d后采集的血清作為一抗,對PEDV感染的Vero細胞進行IFA和Western blot試驗,以驗證各組免疫后小鼠體內是否產生S蛋白的特異性抗體,結果發現, SeV-PEDV-S免疫的小鼠血清作為一抗,在IFA和Western blot試驗中均具有較好的特異性(圖5.A、B)。PEDV-S蛋白組血清在IFA試驗中出現特異性熒光(圖5.A), 而其他免疫組的小鼠血清均沒有特異性熒光和特異性條帶出現。這說明SeV-PEDV-S免疫能顯著的誘導小鼠產生抗PEDV S蛋白的特異性抗體。

圖5 免疫后小鼠血清中特異性抗體的檢測*Fig.5 The anti-PEDV S antibody in immunized mice* A. IFA試驗鑒定血清中特異性抗體, 標尺為50 μm; B. Western blot檢測血清中特異性抗體, M. 蛋白質分子量標準, 1. 對照小鼠血清, 2. SeV-PEDV-S免疫的小鼠血清。* A. identification of S-specific antibodies by IFA, bar is 50 μm; B. detection of S-specific antibodies by Western blot, M. protein marker, 1. serum of control mice, 2. SeV-PEDV-S immunized mouse serum.

2.6 免疫后小鼠血清中和抗體效價的評價

為比較不同組免疫小鼠產生的抗S蛋白抗體對流行毒株PEDV-GX6/2021的中和活性,對第3次免疫后10 d的小鼠血清中和抗體滴度進行測定,結果顯示, SeV-PEDV-S免疫組血清對PEDV-GX6/2021毒株有中和作用,平均中和滴度為1∶80, 而其他免疫組血清均沒有中和活性(圖6), 說明SeV-PEDV-S誘導小鼠產生的抗PEDV S蛋白的特異性抗體能有效地發揮中和活性。

圖6 免疫后小鼠血清中和抗體效價☆Fig.6 The neutralization activities of immunized mice serum☆ T1. DMEM; T2. SeV; T3. SeV-PEDV-S; T4. PEDV-S。** P<0.01。圖7 免疫后小鼠脾臟T淋巴細胞的增殖☆Fig.7 The T lymphocyte proliferative activity in immunized mice☆ T1. DMEM; T2. SeV; T3. SeV-PEDV-S; T4. PEDV-S。** P<0.01。A. 流式細胞術檢測T淋巴細胞增殖; B. 淋巴細胞增殖的統計。A. The detection of T lymphocyte proliferation on by flow cytometry; B. Statistics on the lymphocyte prolif-eration.

2.7 免疫后小鼠脾臟T淋巴細胞的增殖

為檢測不同組小鼠的特異性T細胞免疫,對免疫后的小鼠脾臟T淋巴細胞進行分離和標記,PEDV病原刺激后,檢測T淋巴細胞的增殖情況,結果發現, SeV-PEDV-S組T細胞的增殖活性顯著高于其他組(圖7), 說明SeV-PEDV-S能有效激活小鼠的特異性T淋巴細胞反應。

3 討論

近年來,以PEDV為主要病原的豬腹瀉疫情在中國、意大利、德國和美國等國家大規模發生,其中仔豬病死率達100%, 給養豬業造成嚴重的經濟損失?？刂芇ED疫情最重要的方法之一是接種疫苗,亞洲國家常規使用的是PEDV減毒疫苗和滅活疫苗。在母豬分娩前進行疫苗接種,誘導母豬體內產生特異性抗體并分泌到乳汁中,通過乳汁將母源抗體傳遞給新生仔豬而獲得免疫保護作用[7]。滅活疫苗雖然安全性高,但免疫有效期短,且需要適當的佐劑才能誘導有效的免疫反應[8]。PEDV野毒株進行連續傳代獲得的減毒活疫苗,雖然對同源毒株有一定的防控作用,但難以控制變異株,且研發周期長,還存在重組的安全性問題[9]。因此,探究新型高效的疫苗是目前防控PEDV的關鍵策略。

合適的抗原靶標是疫苗研發的首要因素。在冠狀病毒編碼的蛋白質中, S蛋白含有多個中和表位,是其主要的免疫原。多項研究指出,基于S蛋白不同結構域的抗原在免疫動物后顯示出良好的免疫反應。利用豬細胞真核表達的重組S1蛋白免疫懷孕母豬后,可通過被動免疫保護新生仔豬免受PEDV的感染[10]。表達S蛋白的復制型重組人腺病毒免疫小鼠后能刺激小鼠產生特異性體液和細胞免疫應答。重組PEDV COE區域的益生菌(乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌)在免疫動物后,發現S蛋白均有良好的免疫原性[5,11]。此外,昆蟲細胞表達的帶有S、M和E蛋白的包膜病毒樣顆粒也能有效地誘導與滅活PEDV疫苗相同的中和抗體滴度[12]。本研究選用PEDV流行毒株的S蛋白全長和截短的多肽免疫小鼠,能誘導特異性免疫反應。

仙臺病毒載體已在減毒活疫苗和基因治療等領域進行了臨床使用檢驗,其在分子生物學中的應用依賴于高效的外源基因表達、廣泛的宿主細胞特異性、低致病性和強免疫原性等優勢。仙臺病毒與人副流感病毒1型(hPIV-1)具有相同的抗原性,能作為一種異種減毒活疫苗鼻內免疫誘導產生抗hPIV-1的免疫反應,且對人體無不良影響[6]。表達H5N1流感病毒M2蛋白的重組仙臺病毒鼻內免疫小鼠,不僅能誘導小鼠產生特異性免疫反應,還能對其他物種的流感病毒產生交叉保護作用[13]。表達口蹄疫病毒(FMDV) P1蛋白的重組仙臺病毒能有效誘導BHK-21細胞產生IFN-α和IFN-β, 免疫后可誘導較高水平的FMDV特異性ELISA抗體、中和抗體和γ干擾素表達[14]。

一個組織部位的黏膜感染或黏膜免疫可在機體其他的黏膜表面產生SIgA并提供免疫保護,這種現象稱為“共同黏膜免疫系統”[16]。由于并非所有的黏膜表面都是相互連接的,機體的黏膜表面可細化為“分隔”或“整合”的黏膜免疫系統[17]。例如,鼻腔接種疫苗可保護陰道,通過氣管上皮的免疫可賦予腸道免疫力[18]。不同黏膜表面之間由黏膜淋巴結中活化的淋巴細胞遷移或“歸巢”到黏膜表面來進行相互連接[19]。這種組織特異性遷移是由細胞上特異性黏附分子和趨化因子受體(α4β7, CCR9)結合僅存在于黏膜組織上的配體完成[20]。本研究中PEDV通過腸道黏膜感染機體,其疫苗能有效誘導黏膜免疫反應,對PEDV的防控至關重要。仙臺病毒從呼吸道黏膜感染,作為誘導黏膜免疫反應的適合重組疫苗載體[15]。本研究中構建的重組仙臺病毒(SeV-PEDV-S)經Western blot驗證發現,全長S蛋白的理論大小為150.8 ku, 而實際表達的大小約為180 ku, 說明仙臺病毒可有效表達PEDV S蛋白并能對S蛋白進行糖基化修飾,從而保證S蛋白的正確折疊和發揮正常的生物學功能。SeV-PEDV-S在小鼠體內能誘導顯著的PEDV特異性免疫反應,包括特異性抗體、中和抗體和細胞免疫水平。這證明SeV作為一種預防PEDV感染的新型疫苗載體具有巨大的潛力。

4 結論

本研究中構建并拯救了表達PEDV S蛋白的重組仙臺病毒(SeV-PEDV-S), 經鑒定發現, SeV-PEDV-S能成功表達全長PEDV S蛋白,并能有效地對S蛋白進行修飾,確保S蛋白的正常生物學功能。此外, SeV-PEDV-S能誘導小鼠產生PEDV特異性體液免疫、細胞免疫和中和抗體反應,為防控PEDV的新型疫苗研究提供新的方向。