不同礦化水對納米纖維素-鐵螯合物的影響及其在矯治梨缺鐵黃化中的應用

邊藝偉, 郭獻平, 王東升*, 姚春玲 , 毋青男, 趙 凡, 吳中營, 何 睿, 王合中

(1. 鄢陵縣甘羅養生養老有限公司, 河南許昌 461200; 2. 河南省農業科學院園藝研究所, 鄭州 450002; 3. 河南農業大學植物保護學院, 鄭州 450002)

植物生長在石灰性(高濃度碳酸鈣)或堿性土壤(pH 7～9)中,土壤中鐵以植物難以利用的形式存在,易出現缺鐵黃化現象[1]。鐵是植物生長所必需的微量營養元素,缺鐵會嚴重影響植物的光合作用[2]。梨樹屬于對鐵營養素敏感的植物,我國陜西、湖北、河南以及沿海地區的大部分梨園均存在不同程度的缺鐵黃化現象[3], 導致梨樹果實產量下降[4]。

納米科技與農業科技的相互滲透,為農業科學研究提供了新的理論、方法和技術手段。納米材料通常是指那些在三維空間中至少一維的尺寸在1～100 nm范圍內的材料[5]。纖維素是植物或細菌生物合成的產物,納米纖維素(nanocellulose, NC)是指具有納米尺度結構的纖維素提取物或加工材料[6]。納米纖維素因其可再生性、良好的生物相容性、可修飾的表面化學等獨特性質,因而在材料科學和生物醫學工程領域得到了廣泛應用[7]。據報道[8], 納米纖維素具有優異的化學吸附性能,其表面的功能性基團可通過與重金屬離子以共價鍵的方式進行螯合,可用于污水中重金屬離子的去除。Anayet等[9]研究發現,在納米纖維素表面引入聚電解質可提高其金屬離子螯合能力,在酸性和堿性條件下均可高效地螯合Fe (Ⅱ)。有機螯合鐵化合物,如Fe-EDDHA (乙二胺二鄰羥苯基乙酸鐵)是矯治植物缺鐵黃化常用的土施鐵肥[10]; 用[Fe(mpp)3](3-羥基-4-吡啶酮)螯合鐵噴施黃化葉片,可提高葉綠素含量和根生物量[11], 但這些傳統有機物對土壤和水源的危害性極大[12]。近年來, (S S)-乙二胺-N,N-二琥珀酸三鈉鐵[13]、腐殖質納米鐵肥[14]、N,N-二羥基-N,N’-二異丙基己二胺和偶氮螯合素[15]等可生物降解的新型鐵螯合劑引起了人們廣泛關注。納米螯合鐵肥因其獨特的性能可提高鐵營養素向植物的輸送效率,使水稻等作物增產[16], 是一類環境友好型鐵肥。

作者[17]前期研究表明,納米纖維素與鐵在電荷密度比1∶(300～30 000)的范圍內可有機螯合。在透射電鏡下,可觀察到納米纖維素-鐵仍然保持晶須狀的形態,且粒子的尺寸較納米纖維素的尺寸稍大,同時還觀察到納米纖維素粒子的表面有一些點狀物(Fe)。在等同于硫酸亞鐵噴施濃度為0.002～0.01 mg·L-1的劑量時,用去離子水按納米纖維素、鐵的電荷比為1∶300、1∶3 000、1∶30 000來配制納米纖維素-鐵螯合物(NC-Fe)并進行生物試驗,能顯著提高缺鐵黃化杜梨葉片的葉綠素含量和有效鐵含量, 3種電荷比配制的NC-Fe處理后葉片SPAD值高于化學螯合鐵Fe-EDTA, 也高于單獨噴施FeSO4, 且以1∶3 000效果最佳; 顯著提高凈光合速率,且上調鐵蛋白基因的表達,下調果膠甲酯酶基因的表達[18]。通過轉錄組分析, NC-Fe可調動更多的基因和代謝通路,使葉片的復綠效果強于FeSO4處理[19]。但在生產上一般采用地下水或自來水作為水源配制鐵肥。根據地下水環境質量標準(GB 14848-93), 地下水礦化度(溶解性總固體)分為5類,即≤300 mg·L-1為Ⅰ類, 300～500 mg·L-1為Ⅱ類, 500～1 000 mg·L-1為Ⅲ類, 1 000～2 000 mg·L-1為Ⅳ類, >2 000 mg·L-1為Ⅴ類[20]。梨樹缺鐵黃化主要發生在石灰性土壤地區,該地區生產用水礦化度較高,因此選用750、1 500、3 000 mg·L-1離子濃度的溶液,模擬生產用水礦化度,探究其對NC-Fe以電荷比1∶3 000螯合物的響應,以及對黃化梨樹的復綠效果,為生產應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

溶解級軟木硫化紙(Temalfa 95A, 美國Rayonier Advanced Materials公司); 95%～98%濃硫酸(洛陽昊華化學試劑公司); 超純水(去離子水)用純水儀(Direct-Q 5 UV, 美國密理博公司)自制; 高精度即用型透析袋(JMD45-1214-0.5, 北京索萊寶科技公司); 其他化學試劑碳酸鈣、碳酸氫鈉、七水硫酸亞鐵(純度>98%)、氯化鈉、氯化鉀、鹽酸(36%～38%)和氫氧化鈉等均為分析純(上海生工生物工程公司); TIANGEN植物總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(FSQ-101)[東洋紡反轉錄試劑盒(上海)]; 杜梨種子、進口丹麥泥炭基質土[品氏托普園藝(上海)公司], 吐溫-80 (TW-80,試劑級,上海生工生物工程公司)。

1.2 試驗設計

配制750、1 500、3 000 m·L-1離子濃度的礦化水溶液, pH值分別為6.54、6.44、6.40; 對預黃化杜梨苗(葉片SPAD值在20～30之間)進行5個處理, 每處理3個重復(表1)。FeSO4噴施濃度為2 mmol·L-1, 表面活性劑采用0.15%吐溫-80 (0.15% TW)。每處理噴施1次, 處理72 h后采樣。

表1 不同處理噴施的溶劑Tab.1 Treatments with different formulations

1.3 測定項目與方法

1.3.1 納米纖維素制備

采用硫酸水解法制備納米纖維素懸浮液[18]。將20 g軟木硫化紙與45 ℃、64%濃硫酸(200 mL)混合, 45 ℃反應45 min, 以制備納米纖維素懸浮液。

1.3.2 納米纖維素表征

1) 納米纖維素濃度及電荷密度: 采用干燥失重法測定納米纖維素濃度,電導率滴定法檢測電荷密度[21]。向25 mL納米纖維素中滴加5 μL的5 mol·L-1NaCl以調整滴定體系的離子濃度,逐滴加入0.02 mol·L-1NaOH 40 μL, 并記錄電導率,計算納米纖維素的電荷密度。電荷密度/mmol·g-1=出現拐點時滴加的NaOH體積×NaOH濃度/(納米纖維素濃度×納米纖維素初始體積)。

2) 納米纖維素粒徑、Zeta電位檢測: 根據動態光散射(dynamic light scattering, DLS)原理,將納米纖維素懸浮液稀釋20倍,用馬爾文粒度儀(Zetasizer ZS90, 英國馬爾文公司)進行粒徑、電位的測量。

1.3.3 NC-Fe理化性質檢測

1) X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)檢測: 測試使用Al靶,單色化AlKa 源,能量為1 486.6 eV。

2) 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)檢測: 采用KBr壓片法進行制樣,儀器以4 cm-1的分辨率運行,樣品的掃描速度為45次·s-1, 分析波數為4 000～400 cm-1的吸收峰。

3) X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)檢測: 選用波長為1.540 60 ?的銅靶,測試范圍為10°～80°, 以2°·min-1的速度進行掃描,并計算相對結晶度ε。ε=Ic/(Ic+Ia)×100%, 式中Ic為結晶峰的積分強度,Ia為非晶峰的積分強度。

1.3.4 黃化梨苗培養

杜梨種子經層積后播種,當其長出5片真葉時轉入霍格蘭營養液中培養,生長穩定后,轉入含鐵量為1×10-8mol·L-1的缺鐵營養液中,并加入0.15 g·L-1NaHCO3、0.3 g·L-1CaCO3, 以穩定營養液的pH值。培養約30 d后得到杜梨黃化苗[22]。

1.3.5 礦質營養元素含量測定

將葉片105 ℃殺青30 min, 80 ℃烘干至恒重, 取0.1 g烘干葉片,在1 mol·L-1HCl (10 mL)中浸提,連續振蕩24 h, 過濾后用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)測定浸提液中礦質營養元素含量[19]。

1.3.6 鐵蛋白基因表達量測定

設計杜梨葉片鐵蛋白基因PbFER1引物,以梨Actin基因作為內參:Fer1-F序列為GGGCCATTTCGACGTTTTCC,Fer1-R序列為TTTTCGAGTTTTCGCTGCG;Actin-F序列為CTTCCCGATGGCCAAGTCAT,Actin-R序列為CATGAATGCCAGCAGCTTCC。實時熒光定量PCR反應體系按下述進行: 95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性15 s, 60 ℃退火延伸1 min, 共40個循環。數據采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.4 統計分析

用Excel軟件進行數據的記錄與統計,用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 納米纖維素的相關表征

納米纖維素濃度為8.51 g·L-1時,粒徑為75.63 nm, Zeta電位為-34.93 mV (圖1); 通過電導滴定法測定納米纖維素的電荷密度,根據數據作出典型的V型滴定曲線(圖2), 與文獻[21]報道的一致,測得的納米纖維素電荷密度為0.213 5 mmol·g-1。

圖1 納米纖維素的粒徑及Zeta電位Fig.1 Particle size and Zeta potential of NC

圖2 測定納米纖維素綜合電荷密度的電導率滴定曲線示意圖Fig.2 Conductometric titration curve for determination of net charge density of NC

2.2 NC-Fe的螯合作用

2.2.1 X射線光電子能譜分析

由圖3.A可知,納米纖維素呈現出3個基本電子能譜O1s、C1s和S1s, 分別在532.0、286.4、165.3 eV處,其中S來源于磺酸基。在FeSO4的電子能譜中, 鐵的電子能譜在710 eV處(圖3.D)。在以1∶3 000電荷比配制的NC-Fe的XPS能譜中,由于納米纖維素量少, C1s未能檢測到,顯示鐵的電子能譜峰值接近于FeSO4(圖3.C)。 當電荷比為1∶30時,可看到XPS譜圖中C1s明顯呈現(圖3.B)。據前期研究[18]結果和生產實際需要, NC-Fe以1∶3 000的電荷比配制的螯合物,極少量的納米纖維素仍能提高葉片有效鐵含量,促進光合作用,有效地矯治梨葉片的缺鐵黃化。

圖3 X射線光電子能譜譜圖*Fig.3 XPS spectrum* A. 納米纖維素; B. 納米纖維素-鐵凈電荷比1∶30的混合物; C. 納米纖維素-鐵凈電荷比1∶3 000的混合物; D. FeSO4。* A. NC; B. the chelates formulated at a ratio of net charge density of NC to Fe 1∶30; C. the chelates formulated at a ratio of net charge density of NC to Fe of 1∶3 000; D. FeSO4.

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析

圖4 納米纖維素、FeSO4、NC-Fe的紅外吸光度掃描圖像*Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) patterns of nanocrystal cellulose (NC), NC-Fe and FeSO4* NC-Fe凈電荷比為1∶30的混合物。* The che-lates were formulated at a ratio of the net charge density of NC to Fe of 1∶30.圖5 納米纖維素、FeSO4、NC-Fe的XRD圖像*Fig.5 XRD patterns of nanocrystal cellulose (NC), NC-Fe and FeSO4* NC-Fe凈電荷比為1∶30的混合物。* The chelates were formulated at a ratio of the net charge densi-ty of NC to Fe of 1∶30.

2.2.3 NC-Fe螯合物的晶型變化

純納米纖維素具有高結晶度[23]。納米纖維素的結晶度為63.12%, 分析純FeSO4粉末的結晶度為97.75%。當納米纖維素以電荷比1∶30加入FeSO4后, NC-Fe的結晶度為29.60%, 總體的結晶度下降,結晶性變差; 與納米纖維素相比,加入FeSO4后納米纖維素在20°處有Fe峰出現,且在16°、17°、23°處的峰強明顯變弱(圖5)。

2.3 礦化水中金屬離子對NC-Fe螯合物的影響

與以去離子水制備的NC-Fe粒徑和Zeta電位相比,隨水礦化度的增大, NC-Fe粒徑呈上升趨勢(圖6.A), 以濃度為3 000 mg·L-1的礦化水制備的NC-Fe粒徑與以濃度為1 500、750 mg·L-1的礦化水制備的NC-Fe粒徑有顯著差異。水礦化度越高, NC-Fe的Zeta電位越大(圖6.B), 且以濃度為3 000 mg·L-1的礦化水制備的NC-Fe電位與1 500、750 mg·L-1的礦化水制備的NC-Fe電位有顯著差異。

圖6 不同濃度礦化水對NC-Fe的粒徑(A)和Zeta電位(B)的影響*Fig.6 Effects of different concentrations of mineralized water on particle size (A) and Zeta potential (B) of NC-Fe chelate* 不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.4 不同噴施處理對葉片營養元素含量的影響

由圖7可知,不同噴施處理對葉片營養元素含量有明顯的影響。各處理活性鐵含量由高到低依次為T2、T3、T4、T5、T1、CK處理,與T2處理相比, T3、T4、T5處理分別下降9.1%、23.6%、40.3%; 與T3處理相比, T4處理顯著下降16.0%, T5處理顯著下降34.4% (圖7.A)。葉片內的全鈣含量關系由高到低依次為T2、T3、T4、T1、CK、T5處理 (圖7.B), 全鎂含量由高到低依次為T2、T3、T1、CK、T4、T5處理 (圖7.C), 全鈉含量由高到低依次為T5、T4、T3、T1、T2、CK處理 (圖7.D), T5處理全鈉含量最高, CK全鈉含量最低。

圖7 不同處理72 h后葉片中各營養元素含量*Fig.7 Contents of nutrient elements in leaves after 72 h treatments* 不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters indicate significant differences (P<0.05).

2.5 葉片鐵蛋白相對表達量

由圖8可見,杜梨葉片鐵蛋白基因Fer1的相對表達量發生了明顯變化, T2處理相對表達量顯著高于CK、T1、T3、T4、T5處理, T2處理相對表達量是T3處理的1.3倍,是T4處理的1.9倍,是T5處理的3.6倍。此外, T3處理相對表達量顯著高于CK、T1、T4、T5處理; T3處理相對表達量是T4處理的1.5倍, 是T5處理的2.7倍,且與T1處理相比, T3處理鐵蛋白基因Fer1的相對表達量顯著增加1.0倍。

圖8 杜梨葉片鐵蛋白基因Fer1的相對表達量*Fig.8 The relative expression level of ferritin gene Fer1 in pear leaves* 不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters indicate significant differences (P<0.05).

3 討論

3.1 礦化水中金屬離子對NC-Fe螯合的影響

在納米纖維素的制備過程中, C6被氧化,纖維素表面引入磺酸基。在水溶液中,磺酸基去質子化后呈離子狀態而使納米粒子帶負電。由于帶負電荷的硫酸酯基團之間的靜電排斥作用,納米纖維素顆粒能很好地分散在超純水中。在納米纖維素水懸浮液中增加無機陽離子會導致納米纖維素聚集。有研究[23]表明,在0～50 mmol·L-1的Na+濃度范圍以及在0～5 mmol·L-1的Ca2+濃度范圍內,納米纖維素的粒徑和Zeta電位均呈一定的上升趨勢, Ca2+溶液中的納米纖維素穩定性比在Na+溶液中差。NC-Fe在用濃度低于1 500 mg·L-1的礦化水作為配制溶劑時,對杜梨黃化葉片的補鐵效果高于單獨噴施FeSO4; 且由于礦化水中金屬陽離子的干擾,納米纖維素的粒徑和Zeta電位均有變化,對納米纖維素的特性均產生一定的影響,比如攜帶的電荷量減少,粒徑增大。與上述研究相比,隨著金屬陽離子濃度的增大,粒徑和Zeta電位增大的趨勢相一致,從而印證礦化水中的金屬陽離子會干擾納米纖維素和鐵的螯合,且對納米纖維素的性質有一定的影響,因此納米纖維素螯合的鐵量減少,造成噴施的一部分Fe2+與空氣中的氧氣接觸而氧化,而Fe3+不溶于水,不能被葉片所利用[1]。理論上, Zeta電位越高,粒子的分散度越好,但金屬離子與NC-Fe 螯合物中的Fe2+有競爭關系,可能影響鐵與納米纖維素的螯合,當處于動態平衡時, Zeta電位增加,說明系統中來源于礦化水中的金屬離子越多,或游離,或替代鐵與納米纖維素螯合,因而葉片中的有效鐵含量下降,黃化效果減弱。

3.2 不同濃度礦化水中NC-Fe處理葉片礦質營養元素含量的變化

活性鐵是葉片中鐵營養水平的指標。本研究結果顯示,與CK和T1處理相比, T2、T3、T4、T5處理活性鐵含量均高于其他兩組,且隨礦化度的升高,活性鐵含量逐漸下降。T2、T3處理葉片的全鎂、全鈣含量均高于CK、T1處理,也高于T4、T5處理,濃度越高,葉片的全鎂、全鈣含量越低。Ca2+在植物葉片中主要用于合成新的細胞壁,植物膜功能的正常運行也離不開鈣,且低水平的鈣肥可提高葉片葉綠素含量,提高植物的抗逆性[25-26]。而Mg2+是葉綠素分子的中心原子,調節關鍵光合酶活性[27], 葉面噴施鎂肥對釀酒葡萄葉片的光合特性改善作用顯著[28]。因此葉片的活性鐵含量、全鈣含量、全鎂含量間接反映了葉片的光合作用強弱, 3個指標均隨礦化度的增大而下降,說明黃化葉片的復綠效果隨礦化度的升高而越來越差。

對玉米葉片研究發現,當植物細胞鹽離子濃度過高時會引起離子毒害和離子不平衡,高濃度Na+可置換出細胞質膜和內膜系統中的Ca2+[29]。鈉鹽濃度在100 mmol·L-1及其以上時均會造成葉片中Na+濃度上升,而高濃度Na+會阻礙葉片對Ca2+的吸收[30]。鹽脅迫下,植物體內的Na+會引起K+、Ca2+、Mg2+濃度的變化[31], 孫景波等[32]研究發現當Na+濃度逐漸逼近并超過150 mmol·L-1的過程中,桑樹葉片中Na+濃度逐漸上升直至達到飽和,且迫使葉片中K+、Ca2+、Mg2+濃度下降。本研究中噴施鐵肥時Na+濃度已引起黃化葉片的鹽脅迫,結果顯示,葉片中全鈉含量逐漸上升,與全鈣及全鎂含量的變化趨勢截然相反,且T5處理全鈣、全鎂含量低于CK, 證實了鹽脅迫下Na+與Ca2+、Mg2+的拮抗關系。鹽脅迫會影響植物的葉綠素含量和光合熒光參數[33], 葉片光合作用減弱,葉片復綠效果變差。

3.3 不同濃度礦化水中NC-Fe處理葉片鐵蛋白基因相對表達量的變化

鐵蛋白是一種由24亞單位組成的多聚體蛋白質,其中心腔內可容納約4 500個鐵原子[34]。本研究對葉片鐵蛋白基因的表達量進行了分析, T3處理表達量顯著高于T4處理,也顯著高于T1、T5處理和CK; 且與T1處理相比, T3處理提高99%, T4處理提高37%, 說明低濃度礦化水會影響NC-Fe矯治梨樹缺鐵黃化的效果,但仍比單獨噴施FeSO4效果好。T5處理稍低于T1處理,一方面是由于Na+濃度過高而引起葉片的鹽脅迫,另一方面可能是因為杜梨鐵蛋白家族基因的積累通過不同的轉導途徑進行。李希寬等[35]對梨樹葉片的4個鐵蛋白基因(Fer1、Fer2、Fer3、Fer4)的表達模式進行了研究,結果顯示,這4種基因在非生物脅迫和激素刺激的情況下會出現差異性表達,在鹽脅迫6 h后Fer1基因的表達量顯著增加。

4 結論

纖維素是一種可再生的生物材料,其特殊的理化特性使其在諸多領域得到廣泛應用。由酸水解制備的納米晶體纖維素須帶有從酸中引入的負電荷,因而具有很好地螯合鐵離子的能力。而含有其他金屬陽離子的礦化水配制的納米纖維素-鐵(NC-Fe)對梨樹缺鐵黃化的矯治效果下降。但當生產用水的礦化度小于1 500 mg·L-1時配制NC-Fe螯合物,與噴施FeSO4相比,對活性鐵含量、鐵蛋白Fer1表達仍有顯著的促進作用,本研究可作為螯合鐵在植物缺鐵黃化病防治理應用的參考和補充策略。