正交優化超聲輔助法提取土黨參中黨參炔苷的工藝研究

陸廷祥，韓忠耀，徐英志，劉明濤，劉承貴，黃華軍

(黔南民族醫學高等?？茖W校，貴州 都勻 558013)

土黨參為桔?？平疱X豹屬植物金錢豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的干燥根，主產于我國貴州、四川、湖北、湖南等地[1]。土黨參作為藥食同源植物，目前已列入貴州省苗族等少數民族藥材目錄，收錄于《貴州省中藥材及民族藥材質量標準》(2003年版)[2]。土黨參以野生為主，資源蘊藏量低[3]，其性平味甘，歸脾、肺經，有補中益氣，潤肺生津，止血，通乳之功效，常用于治療虛勞內傷，脾虛泄瀉，肺虛咳嗽，乳汁不多，小兒疳積，小兒遺尿[4]。由于土黨參功效顯著，現已被開發為多種制劑及列入保健品專利[5-7]。

土黨參中主要化學成分為黨參炔苷、多糖、甾體、三萜、黃酮、蛋白質等多種物質[8-10]，藥理研究表明黨參炔苷有促進潰瘍愈合，修復胃黏膜損傷[11]的作用，與其補中益氣的功效相符，土黨參多糖具有保護腦損傷、提高學習記憶力、抗疲勞、抗缺氧、抗腦缺血[12-15]等生物活性。

目前，對土黨參中活性物質黨參炔苷的提取工藝未見報道，對其開展深入研究，有助于更好的開發利用土黨參資源。由于黨參炔苷屬于聚乙炔類化合物，含共軛三鍵，具有不飽和性，易發生加成、氧化等反應，故提取工藝對黨參炔苷的提取有重要的影響。超聲波輔助提取技術是近年來中藥材提取常用的一種新技術，具有提取率高、提取速度快的優點。因超聲波可在液體中有效的攪動與流動，使樣品破碎，減小顆粒大小，擴大樣品與溶劑的接觸面積，從而提高傳質速率，使被測組分快速轉入溶劑中，促進樣品中有效成分與提取溶劑充分混合，達到快速提取[16-17]。本文應用超聲波輔助技術對土黨參中的黨參炔苷進行提取，以黨參炔苷的含量為考量指標，分別進行單因素和正交試驗，從而對土黨參中黨參炔苷的提取工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 土黨參采集于貴州省都勻市勻東鎮，經黔南民族醫學高等?？茖W校王傳明副教授鑒定為金錢豹(CampanμmoeajavanicaBL.)的根；黨參炔苷對照品(批號：CHB180122，純度：≥98%)：成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

Agilent 1260高效液相色譜儀(DAD檢測器，四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱，美國安捷倫科技公司)；AS10200A型超聲儀(杭州匯爾公司)；DV215CD電子分析天平(d=0.000 01 g，美國OHAΜS公司)；AE240電子分析天平(d=0.000 1 g 瑞士METTLERTOLEDO公司)；電熱鼓風干燥箱101-3AB型(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsiL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)(18∶82)；檢測波長為268 nm；流速：1 ml·min-1；柱溫：30℃。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷對照品，置于25 ml棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為0.252 0 mg·ml-1的對照品儲備溶液。

1.2.3 樣品預處理 土黨參凈選后，切制成厚片，置于電熱干燥烘箱中60℃烘烤8 h；干燥后，用粉碎機磨細，過60目標準分樣篩備用。

1.2.4 土黨參供試品溶液的制備 精密稱取“1.2.3”項樣品1 g，置于具塞錐形瓶中，加入設定濃度和體積的溶劑，按照設定的溫度、時間進行超聲提??；將提取液放置于離心機中，以轉速為4 000 r/min離心5 min ，收集上清液，再加入同等濃度的甲醇定容至100 ml，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續濾液得到供試品溶液。

1.2.5 黨參炔苷含量的測定 (1)系統適應性實驗。分別取對照品溶液和供試品溶液10 μl，按“1.2.1”項色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果見圖1，結果表明，在此條件下，黨參炔苷分離度大于1.5，具有良好的分離效果。(2)線性關系考察。標準曲線的制作：別取0.252mg·ml-1黨參炔苷對照品溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 ml，置于10 ml棕色容量瓶，用甲醇稀釋至刻度。按“1.2.1”色譜條件進行測定，以黨參炔苷質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=1 404x-16.24，R2=0.999 9，表明黨參炔苷質量濃度在0.012 6～0.201 6 mg·ml-1范圍內，有良好的線性關系。精密度實驗、穩定性實驗和重復性實驗的方法及結果見參考文獻[18]，結果表明所用儀器精密度良好，供試品溶液中的黨參炔苷在24 h內穩定性，該實驗方法重復性良好。加標回收率：取同一批次土黨參樣品，按“1.2.4”中方法制備6份樣品溶液，分別精密加入1.8 mg黨參炔苷標準品，制成加標回收率供試品溶液，測定并計算樣品中黨參炔苷的回收率，結果見參考文獻[18]，結果表明該樣品中黨參炔苷平均加標回收率為98.8%，RSD為1.02%(n=6)，符合要求。(3)黨參炔苷含量的測定。移取供試品溶液，按照“1.2.1”項色譜條件進行測定，根據公式計算不同實驗中土黨參中黨參炔苷的含量。黨參炔苷的含量(mg·g-1)=CV/M式中：C為提取液中黨參炔苷的濃度(mg·ml-1)；V為提取液的最終體積(ml)；M為土黨參樣品的質量(g)。

圖1 黨參炔苷對照品(a)和供試品(b)溶液的HPLC色譜圖

1.2.6 單因素實驗考察 (1)甲醇濃度的影響 設定超聲溫度40℃，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取時間40 min。甲醇濃度分別取50%、60%、70%、80%、90%進行提取實驗，研究甲醇濃度與黨參炔苷含量的變化趨勢。(2)料液比的影響 設定超聲提取溫度40℃，甲醇濃度60%，提取時間40 min。料液比分別取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g·ml-1)進行提取實驗，研究料液比與黨參炔苷含量的變化趨勢。(3)提取溫度的影響 設定甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)、提取時間40 min。提取溫度分別取10、20、40、60、80℃進行提取實驗，研究提取溫度與黨參炔苷含量的變化趨勢。(4)提取時間的影響 設定甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)、提取溫度40℃。提取時間分別取10、20、30、40、50 min進行提取實驗，研究提取時間與黨參炔苷含量的變化趨勢。

1.2.7 土黨參黨參炔苷超聲波輔助提取工藝優化 根據單因素試驗考察結果，確定各單因素的最優工藝水平，選擇甲醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間作為考察因素，以土黨參黨參炔苷含量為考察指標，采用正交試驗L9(34)選取的最佳工藝條件。設計的因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果及分析 正交實驗安排及結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

通過表3中試驗數據中K值和R值的大小分析可知，當組合為A1B2C3D2時，黨參炔苷含量最大，由R值大小可知，影響黨參炔苷提取含量大小的因素主次順序B>C>D>A，即料液比影響較大，溫度次之，甲醇濃度較小，超聲時間影響最小，最優組合A1B2C3D2。綜合各因素作用，最終選定土黨參中黨參炔苷的最優提取工藝為：甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取溫度60℃，提取時間40 min。由方差分析表3中試驗數據可以看出，料液比、溫度達到顯著 (P<0.05)水平，表明料液比、溫度兩個因素均顯著地影響土黨參中黨參炔苷的含量。其他兩個因素無顯著性影響。

2.2 驗證試驗 用試驗結果中提取最優的工藝條件：甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取溫度60℃，提取時間40 min，同時制備6份平行試樣，測定黨參炔苷的含量，其平均含量為 2.989 mg·g-1，均高于正交實驗設計中的9組實驗結果的黨參炔苷含量。結果見表4。

表4 驗證性實驗結果

3 討論

黨參炔苷作為土黨參的質量評價重要指標，有關文獻[20]報道使用甲醇溶劑提取黨參炔苷效果較好，采用甲醇溶劑對土黨參中黨參炔苷進行含量測定[21]，但由于黨參炔苷對溫度較為敏感，高溫會影響其穩定性[22]。本實驗為了優化土黨參中黨參炔苷的提取工藝，以黨參炔苷含量作為評價指標，根據單因素試驗和正交實驗結果，得到最優工藝為甲醇濃度60%，料液比1∶40 (g·ml-1)，提取溫度60℃，提取時間40 min，此條件下，黨參炔苷含量高達2.989 mg·g-1。通過方差分析，料液比和溫度兩因素為顯著因素，這是因為黨參炔苷的結構式中有易發生氧化還原反應的炔鍵，所以分子極性偏大。在提取工藝設計過程中，特設定溫度因素，是為了驗證溫度的影響，同時有利于找出較合適的提取溫度。

前期實驗組分別采用回流提取法、超聲提取法及微波提取法進行對比研究，前兩種提取方法較好，且含量相差微小。故采用超聲提取法，它消耗時間短，適應性廣，且成本低，易于操作，節約資源的優勢，為土黨參中黨參炔苷的提取工藝提供了參考，為有效地控制土黨參質量提供依據。