產腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的多重PCR 檢測方法構建

牛靈玥，王慧，楊俊，杜麗飛，劉俊琦,2※，周望平※

（1.湖南省畜牧獸醫研究所，湖南 長沙 430131；2.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128）

雞腹瀉性疾病是細菌、病毒、環境等多種因素均可引發的常見群發性疾病，臨床上主要表現為患病雞食欲下降，生長減緩，產蛋量降低[1]。大腸桿菌和沙門氏菌是導致雞腹瀉病的兩種重要且常見的食源性病原微生物。沙門氏菌每年引起全世界超過13 億人口感染，超過20 萬例死亡[2]。沙門氏菌在成年雞體內一般呈隱性感染，垂直傳染給下一代或通過肉、蛋等制品進入人體，引起食物中毒，嚴重危害養殖業發展和公共健康[3]。大腸桿菌通常存在于哺乳動物和禽類的胃腸道及其他黏膜表面，分為共生菌株和致病菌株[4,5]。共生菌株與宿主共同生存，互惠互利；致病菌株則會導致嚴重的感染性疾病，且飼養環境不當、應激、其他疾病后的繼發感染都可導致其病發生，對宿主機體造成嚴重破壞[4-7]。其中產腸毒素大腸桿菌是致病菌株中的一種，主要引起禽類腹瀉甚至死亡，給家禽養殖業造成嚴重的經濟損失。

目前，對禽產腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的感染診斷主要通過細菌分離鑒定、生化試驗、分子生物學技術和免疫學技術等，常規的檢測方法耗時長，且對操作人員、技術、時間都有較高的要求[8,9]。單重PCR 技術彌補了這一不足，降低了對人員和耗時的要求，但單次只能檢測一種基因的限制使得其仍然不適應集約化大量養殖的現狀。多重PCR技術基于PCR 技術發展而來，可以實現兩種以上的基因同步檢測，進一步提升檢測速度和通量，在檢測效率和靈敏度方面都有較大提升[9-11]。

1 材料

1.1 菌株來源

產腸毒素大腸桿菌及沙門氏菌的菌種均由湖南農業大學動物醫學院實驗室進行分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑

DNA 聚合酶、dNTP Mix 和PCR 緩沖液均購自杭州博日科技股份有限公司；DNA marker、標準leader 均購自北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自Omega Bio-Tek 公司。

1.3 主要儀器與耗材

移液槍、移液槍頭、PCR 管、核酸電泳儀、PCR儀、凝膠成像設備、恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺等。

2 方法

2.1 細菌培養與基因組DNA 模板提取

將菌種在普通培養基上培養過夜，再按照細菌基因組DNA 提取試劑盒步驟提取細菌基因組DNA作為模板，并于-20 ℃保存。

2.2 引物設計

根據GENBANK 和參考文獻[2,3,12,13]，選擇產腸毒素大腸桿菌特征性毒力基因hlyE 基因和沙門氏菌特征基因invA 基因作靶標，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，使產物長度大小相差100 bp 行比對，引物由北京擎科生物有限公司合成。引物及產物長度如表1。

表1 設計使用的引物

2.3 多重PCR 方法的建立及優化

以沙門氏菌和產腸毒素大腸桿菌基因組DNA為模板，加入相應引物進行PCR 擴增，構建50 μL體系，DNA 聚合酶2 μL、5× Buffer 20 μL、TP Mix 2 μL、A 模板和上、下游引物分別各1 μL、ddH2O 補足到50 μL，進行初次雙重PCR 實驗，驗證引物可信度。而后分別調整DNA 聚合酶、dNTP、Mg2+、引物濃度以及退火溫度等條件，確立最佳反應體系及反應條件，建立多重PCR 方法。

2.3.1 酶的優化

保持dNTP、Mg2+、模板和引物濃度不變，改變加入酶的量為0.125、0.25、0.5、0.75 μL，加水配平至50 μL 體系，進行PCR 擴增，而后進行凝膠電泳實驗驗證結果。

2.3.2 dNTP 的優化

將酶優化的結果帶入體系，Mg2+、模板和引物濃度及反應條件不變，每管分別加入dNTP 1、2、3、4、5、6、7 μL，并加水配平50 μL 體系，進行PCR 擴增，而后進行凝膠電泳實驗驗證結果。

2.3.3 Mg2+的優化

將酶和dNTP 優化的結果帶入，保持模板和引物濃度及反應條件不變，每管分別加入Mg2+buffer 2、3、4、5、6、7、8 μL，進行PCR 擴增和凝膠電泳檢測驗證。

2.3.4 引物的優化

將前文體系優化結果帶入，配平模板后取引物梯度0.5、1、1.5、2 μL，兩種引物兩兩配對，共16 種進行PCR 擴增與凝膠電泳檢驗。

2.3.5 退火溫度的優化

將體系優化結果帶入，構建50 μL 體系，應用梯度PCR 儀設置55～62 ℃的溫度梯度，間隔1 ℃，共8 個梯度，進行PCR 擴增和凝膠電泳檢測。

2.4 靈敏性檢測

分光光度計測得產腸毒素大腸桿菌濃度187.85 ng/μL、沙門氏菌濃度7.9 ng/μL，以1∶23比例混合均勻，10 倍倍比稀釋得DNA 濃度為15.3、1.53、0.153、0.0153 ng 的梯度為模板，以優化后的多重PCR 方法擴增，并對結果進行凝膠電泳檢測。

2.5 特異性檢測

用優化后的多重PCR 方法，分別檢測實驗室已分離的產腸毒素大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌等細菌的DNA 模板，以驗證多重PCR 方法的特異性。

2.6 檢測方法的應用

從某養禽場采集腹瀉糞便樣本59 份，用普通肉湯進行37 ℃增菌培養，取少量培養后的菌液于無菌EP 管內，沸水煮10 min 后轉冰浴10 min，再放入離心機12 000 r/mim 離心5 min，取上清液進行PCR 檢測。

3 結果與分析

3.1 多重PCR 方法的建立和優化

分別以產腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌DNA 為模板進行單重PCR 和雙重PCR 擴增試驗，均可擴增到符合預期大小的特異性條帶。在單重PCR 的基礎上，優化酶、dNTP、Mg2+、引物濃度和退火溫度建立多重PCR 方法（圖1～5）。結果顯示，在50 μL 體系中，BioReady Pfu（5 U/μL）0.5 μL，10× Reaction Buffer（含20 mmol MgSO4）5 μL，2.5 mmol dNTP Mixture 3 μL，兩種引物分別各（10 μmol）1 μL，核酸模板各1 μL，水37.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，重復30 個循環，72 ℃終延伸10 min。此時可高效且特異性擴增出目的條帶并無雜帶出現。

圖1 酶的優化

圖2 dNTP 優化

圖3 鎂離子優化

圖4 引物優化結果

圖5 退火溫度優化

3.1.1 酶優化結果

凝膠電泳實驗結果表明BioReady Pfu（5 U/μL）酶最優量為0.5 μL。

3.1.2 dNTP 優化結果

凝膠電泳實驗結果表明2.5 mmol dNTP Mixture 最優量為3 μL。

3.1.3 Mg2+優化結果

凝膠電泳實驗結果表示加入10× Reaction Buffer（含20 mmol MgSO4）的最優量為5 μL。

3.1.4 引物優化結果

凝膠電泳實驗結果顯示，分別為1 μL 引物時結果較好。

3.1.5 退火溫度優化結果

凝膠電泳結果顯示，退火溫度取57 ℃與58 ℃間為最優結果。

3.2 靈敏性檢測

靈敏性檢測結果表明，多重PCR 方法對產腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的最低檢測限度分別為1.53 ng 和0.153 ng（圖6）。

圖6 靈敏性檢測

圖7 特異性檢測

3.3 特異性檢測

特異性檢測結果顯示，只有產腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌DNA 模板有明顯的擴增條帶，其他細菌模板均無條帶顯示。

3.4 樣品檢測

在養殖場采集到的59 份糞便樣品中，檢測到13 份產腸毒素大腸桿菌陽性，陽性率為22.0%；7份沙門氏菌陽性，陽性率為11.8%，7 份同時表現沙門氏菌和產腸毒素大腸桿菌陽性。

表2 樣品檢測統計

4 討論

禽大腸桿菌病和沙門菌病不僅是危害養禽業的重要細菌病，給養禽業造成了重大困擾和經濟損失，還是重要的食源性病原，可感染人類致病甚至引起死亡。因此，建立快速準確的檢測方法，對養殖業及公共衛生具有重要意義。

傳統的細菌鑒定方法需要經過分離培養、生化試驗和血清凝集試驗或通用引物擴增測序等方式，操作繁雜、費用昂貴，不能滿足養殖場生產實際的檢測需求。常規PCR 檢測方法具有靈敏度高，特異性好等特征，但一個體系只能擴增同一個靶片段，影響檢測效率。采用多重PCR 進行檢測，該方法具有高效快速、經濟簡便等優點，可以大大縮短常規PCR 的檢測時間。

本研究選擇沙門氏菌高度保守的特異性基因invA[14]和產腸毒素大腸桿菌致病性毒力基因hlyE基因[12,15]作為靶標進行引物設計。多重PCR 影響因素復雜，除引物和模板外，dNTP、Mg2+、酶濃度同樣會產生復雜的影響[10]，因此，對反應體系和反應條件進行優化，以優化后的方法對目的菌株和非目的菌株進行擴增，僅目的菌株存在目的片段，重復性實驗結果相同，證明本反應體系穩定，引物特異性良好。

此方法對產腸毒素大腸桿菌和沙門氏菌的檢測靈敏度可以達到1.53 ng 和0.153 ng，與相關研究中10 pg～1 ng 范圍重疊[3,10,13,16]，與魏娟文[13]等對大腸桿菌的檢測最低1 ng 結果相符，與梁華[16]等建立的多重PCR 方法100 pg 檢測結果相同，優于劉東海[3]等對沙門氏菌檢測最低0.5 ng 靈敏度。

在部分完成種源凈化的養殖場中，由于沙門氏菌的水平傳播能力強，仍會出現沙門氏菌的感染，而因應激、環境不適、繼發感染等因素導致的致病性大腸桿菌感染同樣常見。因此，及時快速地對環境、食水、養殖人員、腹瀉雞糞便進行檢測與隔離病雞，可以有效地阻止兩種病菌的水平傳播，保護健康雞不被傳染從而減少養殖戶的損失?！?/p>