On-line SPE HPLC-MS/MS 測定生物檢材中的2-氯地西泮及其代謝物*

林賢文 朱煥慧 張海雁 孫立敏

（廣州市刑事科學技術研究所，廣東 廣州 510030）

從近年來案件檢驗情況來看，涉案藥物以苯二氮卓類藥物居多，涉新型苯二氮卓類化合物案件也時有發生，近期廣州市轄區連續發生多起利用藥物2-氯地西泮（diclazepam）進行違法犯罪的案件。2-氯地西泮是一種新型苯二氮卓類化合物，其結構式及代謝過程（見圖1）。由于該類藥物作用快、使用劑量少，受害者尿液、血液等生物檢材提取不及時易造成漏檢。目前，毒物分析檢驗方法所涉及的前處理和儀器分析大多是分開進行的，前處理方法主要有液液提?。?］、離線固相萃?。?］等，分析方法主要有氣相色譜、氣質聯用、液相色譜、液質聯用等。前處理是必不可少的關鍵步驟，但傳統的前處理方法存在操作繁瑣、步驟多、重現性差、抗污染能力差、耗時費力等問題。與傳統的液液萃取、離線固相萃取前處理方法相比，近年來發展起來的在線固相萃取技術顯著簡化了樣品前處理工作，具有自動化程度高、富集效果好、樣品損耗量低、SPE 柱可重復使用等優點，在藥物、毒物等分析檢測領域得到越來越廣泛的關注和應用。本文利用在線固相萃取-液質聯用技術建立了生物檢材中2-氯地西泮及其代謝物勞拉西泮、氯甲西泮、地洛西泮的分析檢驗方法，該方法簡便快捷、靈敏度高，能夠滿足基層日常案件檢驗需求。

圖1 2-氯地西泮結構式及其代謝過程

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

在線固相萃取模塊、1290 超高效液相色譜儀、6470 三重四極桿串聯質譜儀（安捷倫公司），離心機SIGMA 3-18K（SIGMA 公司）。

2- 氯地西泮、氯甲西泮（購自Sigma-Aldrich)，地洛西泮、勞拉西泮（購自北京迪朗生化科技有限公司），均為1mg/mL（甲醇）儲備液；乙腈、甲醇、甲酸、醋酸銨（色譜純，均購自Fisher 公司）；超純水由Milli-Q 超純水機（Millipore 公司）制取。

1.2 標準溶液的配制

其他系列標準工作溶液均從上述儲備液用甲醇配制成所需濃度。

1.3 在線SPE 和液相色譜條件

在線SPE 柱：Agilent PLRP-S (15-20μm，2.1×12.5mm), Agilent 1260 在線SPE 四元泵，流動相：A 為5%甲醇水，B 為乙腈。分析柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 （3.0×150mm，2.7μm），Agilent 1290 二元分析泵，流動相：A 為5 mmol/L 醋酸銨緩沖液（含0.1%甲酸），B 為乙腈。柱溫40°C，進樣量20μL。六通閥切換、梯度上樣及洗脫程序（見表1)，On-line SPE-LC-MS/MS 流路（見圖2）。

圖2 ON-LINE SPE-LC-MS/MS 流路示意圖

1.4 質譜條件

電噴霧正離子模式（ESI+），多反應監測掃描模式（MRM）；毛細管電壓3500V，噴嘴電壓500V，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量11 L/min，干燥氣300°C，干燥氣流量5 L/min。4 種藥物質譜參數（見表2）。

表2 4 種藥物質譜參數

1.5 樣品處理

取血液、尿液0.1 mL 置于15mL 離心管中，加入0.4 mL 乙腈沉淀蛋白，渦旋高速離心10 min，取上清液用純水1：1 對等稀釋，用0.45μm 濾膜過濾備檢。

2 結果與討論

2.1 在線SPE 條件優化

空白血按1.4 樣品處理方法處理后全掃描分析，1.5 min 后基線回落走平，所以洗雜去除鹽分、水溶性的蛋白等物質至少需要1.5 min，本方法六通閥上樣切換時間選擇3 min。

實驗發現，4 種藥物空白血液添加樣品，在SPE 泵流速分別為0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min 情況上樣分析，4 種藥物的回收率差別不大，綜合考慮后端色譜峰形、洗雜效果等因素，本方法SPE 上樣流速選擇1.0 mL/min。

分別考察100% 純水、 水（ 含0.1% 甲酸）、95%水（含0.1%甲酸）+5%乙腈、95%水+5%甲醇4 種SPE 上樣流動相對萃取率的影響。實驗結果表明，4 種物質在SPE 柱上保留效果較好，4 種流動相下各組分萃取率差別不大?？紤]到樣品洗雜效果、回收率等因素，上樣SPE 流動相選擇95%水+5%甲醇。

洗脫步驟完成后SPE 柱需要切換回SPE 流路，對SPE 柱再切換回SPE 流路時間進行考察，結果表明2-氯地西泮在SPE 柱上保留能力較強，至少需要20min 才能從SPE 柱上完全轉移至分析柱上，此時SPE 柱及時切回SPE 回路，既可以保證待測組分回收率，又可以用高有機相沖洗雜質，活化SPE 柱，同時避免雜質等污染物進入分析柱及質譜中，根據實驗結果，本方法SPE 柱從分析流路切換至SPE 流路時間點設置為20min。

2.2 色譜條件及在線SPE 條件的優化

從系統壓力、分離效果、靈敏度等角度考慮，本方法選擇5 mmol/L 醋酸銨緩沖液（含0.1%甲酸）、乙腈作為色譜分析流動相，由于目標物結構基團能夠吸收電子，流動相中加入甲酸可以適當提高離子化效率。實驗結果表明 4 種藥物通過分析柱Poroshell 120 EC-C18 后，色譜峰出峰時間可以完全分離，結果如圖3 所示。

圖3 四種藥物色譜圖

2.3 質譜條件優化

使用單標溶液，選擇ESI（+）電離模式，利用儀器自帶Optimizer 自動優化軟件分別對4種藥物的母離子、子離子、Fragment 電壓、碰撞能量等質譜參數進行確定優化，選擇強度最高的兩對離子作為定性分析離子，選擇強度最強的離子作為定量離子，質譜主要參數（見表2）。

2.4 方法的工作曲線、檢測限及回收率

在空白血液樣品中添加2-氯地西泮工作液， 得到2.5、5、50、250、500、1000 ng/mL 系列濃度的加標樣品溶液，按上述1.5 方法對樣品進行處理。以定量離子峰面積對目標物濃度進行線性回歸，建立工作曲線y= 279101.543047x + 139.202842， 相關系數R2=0.999 3，滿足定量分析要求。按3 倍信噪比確定檢出限為1 ng/mL，按10 倍信噪比確定定量限為2.5 ng/mL。

3 結論

本文建立了生物檢材中2-氯地西泮及其代謝物的On-line SPE LC-MS/MS 分析檢驗方法。實驗證明該方法具有操作簡單方便、靈敏度高、樣品需求量少等特點，適合于血液、尿液等檢材中2-氯地西泮及其代謝物的分析檢驗，能夠滿足實際案件檢驗需求。

4 應用案例

近期廣州市先后發生兩起麻醉強奸案件，檢驗人員使用本方法成功地從送檢尿液等檢材中檢測出2-氯地西泮及其代謝物勞拉西泮、氯甲西泮、地洛西泮成分，為案件的定性及后續偵查提供可靠的技術支撐。