lnc-ob1通過促進白色脂肪棕色化改善肥胖小鼠胰島素抵抗

吳 霜，鄭鴻宇，李雪楊，甘麥鄰，沈林園，朱 礪*

（1.四川農業大學動物科技學院，四川省畜禽遺傳資源發掘與創新利用重點實驗室，成都 611130；2.四川農業大學動物科技學院，農業農村部畜禽生物組學重點實驗室，成都 611130）

肥胖造成脂肪組織異位沉積，脂肪組織功能失調伴隨了游離脂肪酸、炎癥物質、ROS的分泌，會促使全身低度炎癥[1]。過量的脂質在不同器官中沉積，產生脂毒性擾亂細胞器正常功能，發生線粒體、溶酶體、內質網功能失調，進一步加劇炎癥物質和ROS 的釋放，進而擾亂胰島素的信號傳導途徑[2]。此外，脂質過度沉積會干擾葡萄糖平衡，推動了胰島素抵抗的進程[3]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度通常大于200 個堿基沒有特定蛋白編碼能力的核苷酸序列。隨著對非編碼RNA 探究的深入，逐漸揭示了lncRNA 參與轉錄調控、表觀遺傳修飾、蛋白質翻譯后修飾以及穩定性等廣泛的生物調節[4]。在脂肪的發育調控中，長鏈非編碼RNA（lncRNA）發揮著關鍵的作用，其調控機制在脂肪分化、代謝和功能方面有顯著意義。研究指出lncOb家族參與瘦素調節基因的定性和定量表達[5]，lnc-BATE1的反式作用是BAT 發育和維持產熱功能的必需lncRNA[6]，lnc uc.417則會通過抑制p38/MAPK 通路的磷酸化阻礙UCP1的激活負向調節棕色脂肪產熱[7]。

ENSMUSG00000092381 在成骨細胞中高度富集，在小鼠組織中被命名為lnc-ob1（lncRNA osteoblastogenesis associated 1）,特異性敲入lnc-ob1能夠上調成骨轉錄因子Osterix，促進成骨細胞鈣化[8]。

本課題組前期研究發現，在肥胖小鼠模型的不同類型脂肪組織中觀察到lnc-ob1的差異表達，這提示lnc-ob1可能在脂肪細胞的分化以及功能履行中發揮特定調控作用。為了進一步探究這種可能性，本試驗采用生物信息學結合活體注射的方式，初步探究了lnc-ob1對脂肪組織棕色化的調控作用。

1 材料和方法

1.1 數據PC庫及軟件

NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載lncRNA-seq 轉錄組數據；ensembl 數據庫（http://asia.ensembl.org/index.html）中獲取lnc-ob1序列信息；UCSC 數據庫（https://genome.ucsc.edu）分析lncob1的保守性；RNAfold 網站（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預測lncRNA二級結構；CPC（http://cpc2.gao-lab.org/）編碼潛能預測；image J軟件統計脂肪細胞面積。

1.2 試驗材料

1.2.1 實驗動物

雄性6 周齡C57BL/6J 小鼠購于成都達碩實驗動物有限公司。試驗獲四川農業大學動物科技學院實驗動物護理和使用委員會批準。

1.2.2 試驗試劑

牛胰島素購置于北京索萊寶科技有限公司；TRlzol RNA抽提試劑購置于Invitrogen公司（美國）；Hiscript Ⅲ RT SuperMix for qPCR購置于Vazyme公司；TB GreebTMPremix Ex TapTMⅡ購置于Takara公司；甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測試盒均購置于南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 顯色液購置于上海碧云天公司；Anti-UCP1（ab209483）抗體購置于abcam，β-actin（200068-6D7）購置于成都正能生物技術公司，Goat anti-rabbit IgG（AS070）購置于ABclonal生物公司。

1.2.3 試驗儀器設備

試驗所用主要儀器設備見表1。

表1 試驗主要儀器設備表Table 1 Main test instruments and equipment

1.3 試驗方法

1.3.1 過表達載體構建與引物設計合成

lnc-ob1過表達pCDNA3.1（+）質粒購置于上海擎科生物有限公司。ENSMUSG00000092381 是位于小鼠第七號染色體（Chromosome 7:19 448 941～19 455 656）的反義lncRNA，轉錄本長度618 bp。對應人源lnc-ob1（ENSG00000267282）位于人19 號染色體（Chromosome 7：44 882 027～44 890 876），轉錄本長度426 bp，序列如表2。

lnc-ob1引物序列設計于Primer3Plus 在線網站（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）。脂肪棕色化、產熱等相關基因參考序列信息從Genbank 中檢索下載，用Primer 5.0軟件設計9對引物（表3）。引物由擎科生物公司（成都）合成。

表3 引物序列Table 3 The primer sequences

1.3.2 實驗動物分組及處理

健康C57Bl/6J 雄性6 周齡小鼠18 只，隨機分為3 組：正常飲食對照組（normal diet，ND）、高脂飼喂組（high fat diet，HFD）、高脂飼喂+lnc-ob1過表達試驗組（HFD+lnc-ob1），3 組小鼠均自由采食飲水，其中n=6。HFD 組通過高脂飼喂構建肥胖小鼠模型，飼喂4 周后超過對照組平均體質10%為構建成功。lnc-ob1過表達通過腹腔注射過表達載體實現，且ND組和HFD組注射等體積生理鹽水。

飼喂4 周后進行組織樣本采集，眼球取血法采取全血，室溫靜置2 h后3 000 rpm離心15 min，取上清置-80 ℃冰箱保存。采血后對小鼠進行斷頸處死法，采取肝臟（liver）、腹股溝脂肪（inguinal white adipose tissue,iWAT）、肩胛棕色脂肪（brown adipose tissue,BAT）和性腺脂肪（gonadal white adipose tissue,gWAT）并稱量，部分組織去除血污后利用4%多聚甲醛固定，用于制作H&E 染色切片；部分組織置于液氮速凍后迅速轉移至-80 ℃冰箱保存，用于后續試驗檢測。

1.3.3 逆轉錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

組織樣本用高速研磨儀破碎，用Trizol法提取組織mRNA，在ND-2000 分光光度計（NanoDrop）上檢測mRNA完整性和濃度。使用Hiscript Ⅲ RT Super-Mix for qPCR 試劑盒將mRNA 逆轉錄為cDNA，隨后用TB GreebTMPremix Ex TapTMⅡ進行RT-qPCR 檢測，反應體系配比為：5 μL TB Green，3 μL DEPC水，上下游引物各0.5 μL和1 μL cDNA。CFX96熒光定量儀反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，反應39 個循環，72 ℃延伸1 min。mRNA的內參基因為β-actin，基因表達量采用2-△△Ct法計算[9]。實時熒光定量PCR所用引物序列見表3。

1.3.4 Western blot

凍存的小鼠脂肪組織用研磨儀破碎，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，BAC 試劑盒（碧云天）檢測蛋白濃度，變性后按照25 ug 蛋白量上樣，15%SDS-PAGE 電泳，轉膜、封閉后，孵育UCP1 一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶5 000） 4 ℃過夜，TBST震蕩清洗后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 震蕩清洗3次，ECL顯色法在凝膠影像分析儀成像。

1.3.5 GTT和ITT檢測

腹腔注射葡萄糖耐量試驗（GTT）操作如下：試驗處理4周后，試驗提前12 h對小鼠禁食，試驗當天檢測小鼠體重，按照2 g/kg 根據體重計算20%葡萄糖溶液注射量，在0、15、30、60、90、120 min 時間點用羅氏試紙血糖儀檢測小鼠尾靜脈血糖。

腹腔注射胰島素耐量試驗（ITT）操作如下：操作同GTT，根據小鼠體重將胰島素（4 U/mL）按照0.75 U/kg劑量注射，在0、15、30、60、90 min 5個時間點檢測小鼠尾靜脈血糖。

1.3.6 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色

小鼠部分組織用4%多聚甲醛固定，經脫水、石蠟包埋、切片，二甲苯浸泡后置于無水乙醇脫蠟，隨后依次置于95%、85%、70%乙醇中水化樣本。PBS清洗3次后，蘇木素染色5～10 min，蒸餾水洗去多余染色液后用1%鹽酸乙醇分化，細胞核反藍后蒸餾水清洗5 min。伊紅染液染色3 min，隨后脫水封片，顯微鏡鏡檢，進行圖像采集分析。

1.3.7 生化指標檢測

血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）經試劑盒檢測含量。肝臟組織樣本按照肝臟重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入無水乙醇，在冰浴下機械研磨為勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清用于后續檢測。TC檢測操作：在96 孔酶標板上分別加2.5 μL 蒸餾水、標準品、待測樣本，再分別加入250 μL工作液，37 ℃孵育10 min，酶標儀檢測510 nm 波長處吸光度值。TG 檢測操作同TC，檢測波長為500 nm。HDL-L 檢測操作：96 孔酶標板上分別加2.5 μL 蒸餾水、標準品、待測樣本，再分別加入180 μL 工作液R1，37 ℃孵育5 min，酶標檢測546 nm 波長吸光度A1，各孔添加60 μL 工作液R2，37 ℃孵育5 min，酶標檢測546 nm波長吸光度A2，根據公式計算濃度。

1.3.8 數據處理與分析

試驗數據采用GraphPad Prism 9.0 （GraphPad software，San Diego，CA，USA）分析，相關性分析采用D'Agostino-pearson 進行相關分析。試驗結果采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 lnc-ob1 在肥胖小鼠脂肪組織中差異表達，進化上具有高度保守性

lnc-ob1（ENSMUSG00000092381）位于小鼠第七號染色體（Chromosome 7:19 448 941～19 455 656）的反義lncRNA（圖1A-B）。隨后鑒定了lnc-ob1在豬、人、鼠等多個物種中高度保守，進化上的序列保守為lnc-ob1的功能保守提供了基礎條件（圖1C-E）。且編碼能力預測顯示lnc-ob1不具備編碼潛能（圖1F）。此外，我們從NCBI 數據庫下載了高脂誘導肥胖小鼠及其對照的LncRNA-seq 數據，差異表達分析鑒定出lnc-ob1在高脂誘導小鼠的肩胛脂肪中表達量異常下降，為了進一步確定lnc-ob1對脂肪發育的潛在影響，我們在高脂飼喂小鼠中腹腔注射裸質粒過表達lnc-ob1。通過RT-qPCR 檢測不同脂肪組織（n=5）中lnc-ob1表達量變化，結果顯示過表達組lnc-ob1表達量顯著高于對照組和高脂飼喂組。在HFD誘導肥胖小鼠的腹股溝脂肪中lnc-ob1表達量顯著降低，表明lnc-ob1表達與脂質代謝相關，同時證明腹腔注射質粒顯著增加了lnc-ob1在脂肪組織中的表達（圖1G）。

圖1 lnc-ob1保守性分析以及不同脂肪組織中差異lncRNA分析Figure 1 Conservative analysis of lnc-ob1 and differential lncRNA analysis in different adipose tissues

2.2 lnc-ob1 過表達抑制小鼠肥胖癥發展，緩解肥胖小鼠的胰島素抵抗

初始體重趨于一致的小鼠，飼喂高脂日糧小鼠的體重從飼喂起第2 周呈現顯著差異（圖2A，P<0.05），高脂飼喂組葡萄糖耐量試驗（GTT）曲線下面積（AUC）顯著升高（圖2B～C）且HFD組胰島素耐量試驗的AUC 也顯著增加（圖2D-E），說明高脂飼喂造成小鼠葡萄糖穩態的破壞和胰島素敏感性降低，且該現象被lnc-ob1過表達挽救。

圖2 過表達lnc-ob1高脂誘導肥胖小鼠以及對照組的體重以及血液指標檢測Figure 2 Effects of lnc-ob1 overexpression on body weight and blood indexes

與對照組相比，HFD組在總甘油三酯（圖2F）和總膽固醇（圖2G）兩項血液生化指標檢測中都顯著升高，lnc-ob1過表達組的TG、T-CHO 和HDL-C 與HFD組相比均顯著下降（圖2F～H）。

過表達lnc-ob1顯著抑制了高脂飼喂導致的小鼠肝臟重量增加（圖3A），改善了肥胖誘導的肝臟細胞間距增加的NAFLD樣變化（圖3D）。同時極顯著地降低了肝臟總甘油三酯和膽固醇的含量（圖3B-C）。以上結果證明，過表達lnc-ob1具有調節小鼠脂肪代謝、緩解肥胖小鼠胰島素抵抗的功能。

2.3 lnc-ob1過表達降低肥胖小鼠的脂肪質量和脂肪細胞面積

HFD 小鼠肩胛脂肪和性腺脂肪相對于對照組增加（圖4A），肩胛和性腺脂肪的器官指數顯著增加（圖4B～C）。lnc-ob1過表達顯著降低了HFD誘導的性腺白色脂肪重量增加，同時抑制了性腺白色脂肪的脂肪面積增大，與HFD 相比lnc-ob1過表達的脂肪組織間毛細血管增加。

圖4 lnc-ob1對小鼠肩胛和性腺脂肪組織的影響Figure 4 Effect of lnc-ob1 on the adipose tissue of interscapular and gonadal

HFD 處理組的腹股溝白色脂肪（iWAT）的脂肪細胞面積和重量顯著高于對照組（圖5A～D），表現出了更嚴重的脂肪堆積。lnc-ob1的過表達顯著抑制了iWAT 的脂肪面積增加（圖5B～D），HE 染色表現出更明顯的脂肪棕色樣變化的血管分布（圖5A）。且Pearson相關性分析（Pearsonr=0.912 2）顯示lnc-ob1表達量與腹股溝脂肪細胞面積呈現強相關（圖5E）。

圖5 lnc-ob1對小鼠腹股溝脂肪組織的影響Figure 5 Effect of lnc-ob1 on the inguinal fat in mice

2.4 lnc-ob1 通過促進白色脂肪棕色化緩解脂質聚集

在過表達lnc-ob1的腹股溝脂肪中檢測到，白色脂肪棕色化傳統調控通路的UCP1基因表達和蛋白活性加強（圖6A～B）。q-PCR 結果顯示，與高脂飲食（HFD）組相比，過表達組脂肪細胞產熱相關基因表達量增加，包括解偶聯蛋白1（UCP1）、PR 結構域蛋白16（PRDM16）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助激活因子-1α（PGC-1α）。同時，線粒體β 氧化調控基因過氧化物酶體增值無激活受體-α（PPAR-α）、過氧化物酶體增值物激活受體-γ（PPAR-γ）以及上游調控因子LPIN1和HSL表達量呈現相同趨勢，差異具有統計學意義。

圖6 lnc-ob1調控小鼠脂肪代謝和棕色化基因表達變化Figure 6 lnc-ob1 regulates lipid metabolism and browning gene expression in mice

3 討論與結論

動物能量攝取超過能量消耗量時，多余的能量會以脂質的形式儲存在脂肪細胞和其他代謝組織中，長期慢性能量攝入過剩則可能導致肥胖并誘發2型糖尿病[10]。棕色脂肪組織（BAT）通過UCP1解偶聯呼吸鏈與ATP合成，甘油三酯儲存的能量在氧化后以熱量的形式耗散從而產熱[11]。多項研究指出，在特定刺激下，如冷刺激、低氧、腎上腺素能激動劑，WAT內的部分脂肪細胞發生棕色樣的變化行使BAT的功能，被稱為第三類脂肪組織“米色脂肪”[12-13]。

lnc-ob1功能保守，在多個物種（小鼠、豬、人）中基因組位置、全長已知。從超級保守區（UCR）轉錄的RNA（T-UCR），擁有較高的進化保守性，在不同哺乳動物的進化中都得到了保留，暗示了其在疾病或生理功能中的重要調控作用[14]。

C57Bl/6J 小鼠品系在高脂飲食飼喂條件下，容易出現胰島素抵抗、肝臟脂肪變性的變化。肥胖帶來胰島素和葡萄糖代謝紊亂，lnc-ob1外源性過表達抑制了高脂日糧飼喂的小鼠的體重增長，降低了小鼠的空腹血糖水平，增加了小鼠的胰島素敏感性，緩解了高脂飼喂誘發的肥胖和胰島素抵抗。葡萄糖經由肝臟代謝轉化為甘油三酯和脂肪酸，作為極低密度脂蛋白的成分被脂肪細胞攝取，隨后存儲于白色脂肪組織[15]。慢性營養過剩造成的肥胖，促使小鼠肝臟脂肪生成和糖異生作用增強，發生顯著的肝臟脂肪性病變[16]。脂肪組織功能障礙伴隨的慢性炎癥和脂肪因子的釋放，進一步促使肝臟脂質代謝紊亂產生脂毒性，共同加劇胰島素抵抗[15]。通過H＆E染色和肝臟甘油三酯、膽固醇水平的檢測，明確了lnc-ob1對脂肪細胞的調控作用。試驗結果表明，lnc-ob1抑制了高脂飼喂對于脂肪沉積的不良影響，緩解了肝臟的NAFLD樣變化。

肩胛和甲狀腺周圍脂肪棕色化標志基因表達量高，腹股溝脂肪（WAT）為代表的皮下脂肪高度表達成脂功能相關基因，性腺脂肪（腎周、腸系膜等內臟脂肪）高度表達炎癥因子[17]。圍繞3 個具有代表性的部位脂肪展開研究，探究lnc-ob1對于胰島素抵抗的作用。試驗中觀察到lnc-ob1過表達顯著減弱腹股溝脂肪細胞的細胞面積，表明脂肪細胞的大小或是區別于數量導致腹股溝白色脂肪墊重量減少的原因，進一步證明lnc-ob1調控脂質代謝而非脂肪細胞形成。

經典組成棕色脂肪的細胞存在于肩胛和腎周脂肪中，源自myf-5肌肉樣細胞系，白色脂肪和棕色化的白色細胞源于的脂肪前體細胞[18]。白色脂肪組織的UCP1基因基礎表達量非常低，但經過寒冷或c-AMP等途徑長期刺激，會促發細胞產生多房性的棕色脂肪特征，并激活UCP1表達開啟產熱功能[19]。PRDM16促進白色脂肪棕色化阻斷脂肪細胞纖維化，同時能夠刺激骨骼肌成肌細胞向棕色脂肪細胞分化，驅動完整脂肪棕色化的基因表達程序[18]。lnc-ob1通過增加棕色脂肪的含量/活躍度從而增加能量消耗，減少脂質囤積，改善胰島素抵抗，降低肥胖小鼠的體重量。產熱基因UCP1、PGC-1α的激活，代表線粒體β氧化功能的PPAR-α表達量上升，證明lnc-ob1促進iWAT 棕色化轉變為具有產熱功能的米色脂肪組織[20]。

臨床上利用胰島素增敏劑促進前脂肪細胞向脂肪細胞的轉化，促進脂肪細胞對血液游離脂肪酸和甘油三酯的攝取，從而降低血液中脂肪酸含量，缺點是易造成肥胖的副作用[21]。利用基因調控脂肪代謝，促進白色脂肪棕色化從而增強胰島素敏感性的方法能降低藥物的副作用，對于胰島素抵抗和肥胖癥或許有更大的治療潛力[22]。

綜上所述，本試驗驗證了在高脂飼喂誘導的肥胖小鼠脂肪發育中，不同脂肪組織的lnc-ob1表達量差異，過表達lnc-ob1促進了腹股溝脂肪的棕色化，減輕了小鼠的胰島素抵抗，為后續研究lnc-ob1在白色脂肪棕色化中的作用機制提供了理論基礎。