寄生蟲14-3-3蛋白的生物學功能研究進展

李艷娥，古小彬

（四川農業大學動物醫學院，成都 611130）

14-3-3蛋白最先由Moore 和Perez 兩位研究人員于牛腦組織提取的神經元蛋白中發現，之后被命名為14-3-3[1]，又稱為酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白[2]，該蛋白廣泛分布于動物、植物、真菌等多個物種。近年來，隨著對14-3-3蛋白的深入研究，越來越多新的生物學功能逐漸被發現，該蛋白參與多種細胞活動的調節，包括細胞周期控制、細胞凋亡、信號轉導、細胞的增殖分化等[3-4]。因此，對寄生蟲14-3-3 蛋白功能的研究，可更好的了解其在寄生蟲致病過程中所發揮的重要作用，為臨床上防治寄生蟲疾病提供新的靶標。本文主要對近10年（2013—2023）寄生蟲14-3-3 蛋白的結構、定位以及生物學功能的最新研究進展進行綜述。

1 14-3-3蛋白的分型與結構

1.1 14-3-3蛋白的分型

在高等真核生物中存在多種14-3-3亞型，且不同的物種之間含有的亞型數目各不相同。如哺乳動物有7種14-3-3亞型，分別用β、ε、η、γ、θ、ζ、σ來表示，而植物的14-3-3 亞型可多達15 種[5]；單細胞或者低等真核生物通常有1-2種14-3-3亞型[6]。

目前已報道14-3-3 蛋白的寄生蟲有糞類圓線蟲（Strongyloidesstercoralis）[7]、旋毛蟲（Trichinella britovi）[8]、弓形蟲（Toxoplasmagondii）[9]、犬新孢子蟲（Neosporacaninum）[10]、惡性瘧原蟲（Plasmodiumfalciparum）[11]、溶組織內阿米巴原蟲（Entamoebahistolytica）[12]、柔嫩艾美耳球蟲（Eimeriatenella）[13]等，但它們的14-3-3 亞型數量和類型存在差異（表1）。溶組織內阿米巴原蟲至少有3 種亞型[12]；豬帶絳蟲（Taeniasolium）報道了6 個14-3-3 基因，其中有2 個基因尚未明確其蛋白亞型，故通常認為是4 種亞型[14]。

表1 近十年內報道的寄生蟲14-3-3蛋白亞型Table 1 Isoform of parasite 14-3-3 protein reported in the last decade

1.2 14-3-3蛋白的結構

14-3-3蛋白的分子量在25-33 kDa 之間，由247-280 個氨基酸組成[19-20]，其二級結構主要由α-螺旋，β-轉角，擴展鏈和無規則卷曲4 種結構組成[14]，其中α-螺旋結構所占比例最高，其他3種結構在不同種寄生蟲中占比不同[9,14,21]。14-3-3 蛋白的三級結構主要以兩個反向平行的單體締合成同源或者異源二聚體的形式存在（圖1），依靠Leu、Ala、Ile和Tyr的氨基酸側鏈之間的疏水力和靜電力驅使兩個單體間形成一個“U”形或杯型凹槽[20]，不變殘基多分布于凹槽內壁，而可變殘基位于凹槽的突出面外壁上[22]，該凹槽具有兩親性，兩側分別攜帶極性殘基和疏水殘基構成極性面和非極性面，用于結合靶蛋白上的磷酸化殘基[11]。

圖1 細粒棘球絳蟲14-3-3蛋白各亞型同源二聚體建模3D結構[23]Figure 1 3D structure modeling of homologous dimers of14-3-3 protein isoform of Echinococcus granulosus[23]

2 寄生蟲14-3-3蛋白的表達與定位

2.1 寄生蟲14-3-3蛋白的表達

吸蟲研究發現，14-3-3 蛋白在日本血吸蟲（Schistosomajaponicum）的成蟲和童蟲階段均有轉錄表達，但其在毛蚴的表達量高于成蟲[24-25]；14-3-3蛋白在麝貓后睪吸蟲（Opisthorchisviverrine）的蟲卵、尾蚴和成蟲階段具有轉錄表達，但在成蟲階段的轉錄表達量最高[26]。

絳蟲14-3-3 蛋白主要在豬帶絳蟲的成蟲和囊尾蚴階段轉錄表達，但該蛋白不同亞型在不同階段的表達量存在差異，如14-3-3.1-4在囊尾蚴階段表達水平更高，且表達量以14-3-3.2、14-3-3.4、14-3-3.1、14-3-3.3 的順序遞減，而14-3-3.5-6 在成蟲階段的表達水平更高[14,27-28]。

14-3-3 蛋白在細粒棘球絳蟲（E.granulosus）的棘球蚴階段的表達量最高[23]。14-3-3 蛋白在旋毛蟲的肌幼蟲和成蟲階段也都均有轉錄表達[26]。14-3-3蛋白主要在柔嫩艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的子孢子和第二代裂殖子階段轉錄表達，且表達水平會隨著寄生蟲的生長而逐漸降低[13,16]。

2.2 寄生蟲14-3-3蛋白的定位

吸蟲日本血吸蟲14-3-3 蛋白分布于蟲體的皮層、皮下層、肌層和實質層[24]，且在蟲卵內毛蚴的體壁和左右兩側腺體中含量尤其高，體壁是血吸蟲生長發育的關鍵部位，提示14-3-3可能在蟲體的生長發育過程中發揮重要作用[29]；而曼氏血吸蟲（S.mansoni）14-3-3 蛋白主要分布于成蟲的排泄系統和生殖系統，包括在卵黃細胞和卵母細胞的胞漿、胞核中都有分布，同時在尾蚴的皮層和肌層也有分布[30]。

華支睪吸蟲（Clonorchissinensis）14-3-3 蛋白天然蛋白則主要分布于成蟲的外表面、吸盤和囊蚴的囊壁上，在生殖系統（如精母細胞）中也有部分定位表達[31]。

線蟲旋毛蟲14-3-3 蛋白主要分布于成蟲和童蟲的蟲體兩端[26]。

原蟲犬新孢子蟲14-3-3 蛋白主要定位于蟲體的細胞質和細胞膜，同時還在寄生泡中存在，能夠促進寄生泡膜的形成[10,15]；布氏錐蟲和溶組織內阿米巴原蟲的14-3-3 蛋白定位于細胞質[1,12]；而惡性瘧原蟲14-3-3I主要定位于成熟裂殖體和游離裂殖子的細胞外圍[11]。

3 寄生蟲14-3-3蛋白的生物學功能

14-3-3 蛋白發揮其生物學功能多是與其他蛋白結合，通過蛋白間相互作用來實現的。能夠與14-3-3 蛋白結合的互作蛋白高達200 多種，包括Raf 激酶，磷酸酶和跨膜受體等[2,32]，14-3-3 蛋白利用其結構凹槽來結合這些磷酸化或非磷酸化配基，通過調控靶蛋白從而參與到寄生蟲的生長發育、運動與入侵以及對宿主的免疫調控和信號傳導等重要的過程當中。

3.1 14-3-3蛋白調控寄生蟲的生長發育

14-3-3 蛋白在大多數寄生蟲的生長發育過程中都能表達，其可通過影響酶活性或干擾細胞分裂周期等多種形式來對自身發育進行調控，表明該蛋白在寄生蟲的生長發育等過程中至關重要。柔嫩艾美耳球蟲14-3-3 蛋白基因與端粒酶逆轉錄酶的RNA 結合域直接結合，抑制端粒酶活性，對細胞的持續增殖和寄生蟲生命周期發揮調控作用[33]；布氏錐蟲14-3-3蛋白多以異源二聚體的形式存在，已證明這種形式不僅有助于維持亞型的穩定水平，而且還能有效控制細胞周期和胞質分裂[17]；藍氏賈第鞭毛蟲（Giardialamblia）14-3-3 與肌動蛋白絲的形成有關，除維持G/F-肌動蛋白穩態外，似乎還可能在肌動蛋白復合物的亞功能化中起作用[34]。

3.2 14-3-3蛋白調控寄生蟲入侵宿主過程

有關14-3-3 蛋白在寄生蟲入侵宿主組織中的作用的報道多集中于原蟲，如溶組織內阿米巴原蟲的滋養體前緣和偽足部位有大量14-3-3.3（EhP3）富集，推測該蛋白可能與阿米巴原蟲的運動性相關，此外，在紅細胞附著于滋養體時，EhP3會迅速募集于附著點直至吞噬過程完成，提示該蛋白還可能會參與紅細胞的吞噬過程[12]。

惡性瘧原蟲裂殖子14-3-3I可與宿主的鈣依賴性蛋白激酶1（CDPK1）、蛋白激酶A 的調節亞基（PKAr）相互作用形成多蛋白復合物，其中14-3-3作為支架蛋白介導并參與信號復合物磷酸化依賴性組裝，從而在瘧原蟲入侵紅細胞過程中發揮作用[11,35-36]；而柔嫩艾美耳球蟲14-3-3 蛋白同樣可以與CDPK作用，參與球蟲對宿主的入侵[13]。

除上述與宿主蛋白酶類發生互作參與入侵細胞過程外，寄生蟲14-3-3蛋白還可增加感染宿主細胞的運動能力，如弓形蟲14-3-3蛋白大量集中于寄生泡中，且能夠誘導寄生性樹突狀細胞和小膠質細胞的過度遷移，推測14-3-3蛋白在蟲體向宿主組織的入侵過程中發揮作用[37]。

3.3 寄生蟲14-3-3蛋白調控宿主免疫

多種寄生蟲的14-3-3 蛋白都可以調控宿主的免疫功能，其可通過改變宿主分泌細胞因子、NO的產生和抗體水平，以及調控宿主免疫細胞的增殖、凋亡或遷移來調控宿主免疫，但不同種類的寄生蟲14-3-3蛋白調控宿主免疫應答存在一定差異。

吸蟲大片吸蟲（Fasciolagigantica）重組14-3-3ε 蛋白可增強山羊外周血單個核細胞（PBMCs）分泌IL-10，并抑制IL-4、IFN-γ 的分泌，還可促進細胞分泌TGF-β，并在高濃度條件下（80μg/mL）促進NO 產生，同時該蛋白還可明顯抑制山羊PBMCs增殖和吞噬能力，且在蛋白濃度為20 μg/mL時促進細胞遷移，在40和80 μg/mL 時抑制細胞遷移，并誘導細胞凋亡[38]。

日本血吸蟲14-3-3 蛋白除可促進T 淋巴細胞比例增加外，還顯著促進小鼠脾細胞的凋亡[39]。

絳蟲多房棘球絳蟲（E.multilocularis）重組14-3-3蛋白可改變小鼠血清中IFN-γ、IL-4的分泌水平，誘導小鼠產生Th1/Th2混合型免疫應答[21]；細粒棘球絳蟲原頭蚴重組14-3-3 蛋白可提高小鼠血清中IL-2的水平和抗體IgG、IgE水平[40-41]。

線蟲捻轉血矛線蟲（Haemonchuscontortus）重組14-3-3蛋白（rHCftt-2）刺激山羊PBMCs分泌IL-10、IL-17和IFN-γ，抑制IL-4和NO的分泌，同時還可促進PBMCs細胞的遷移，但細胞的增殖水平卻以劑量依賴性方式顯著降低[42]，而旋毛蟲重組14-3-3蛋白可促進小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5水平升高，誘導小鼠Th1/Th2混合型免疫應答[26]。

原蟲巨型艾美耳球蟲重組14-3-3 蛋白可促進雞血清中IFN-γ、IL-2、IL-4 和TGF-β4 等細胞因子水平的升高[16]；犬新孢子蟲重組14-3-3蛋白以不依賴于TLR2 的方式激活MAPK、AKT 和NF-κB 信號通路，誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α 等細胞因子從而調節小鼠先天性免疫應答[10]，同時還能夠增加CD8+T淋巴細胞比例，而在蛋白濃度高于100 μg/mL時顯著抑制小鼠腹腔巨噬細胞的增殖[10,15]。

3.4 寄生蟲14-3-3作為多種寄生蟲疫苗候選抗原

目前已報道有寄生蟲14-3-3 蛋白的DNA 疫苗、重組亞單位疫苗和活載體疫苗，其中大部分寄生蟲14-3-3蛋白的疫苗進行了保護性效果評價，但它們的保護效果存在差異。

吸蟲肝片吸蟲（F.hepatica）重組14-3-3蛋白疫苗免疫山羊后，血清中IgG特異性抗體水平升高，但免疫后山羊的肝臟損傷程度與未免疫的山羊接近[43]。

絳蟲細粒棘球絳蟲14-3-3 亞單位疫苗免疫的小鼠對原頭蚴攻擊具有85.3%和84.47%的保護力，可顯著降低其肝臟和腸系膜處的棘球蚴包囊數目和包囊大小[40-41]，另外，該蛋白與疫苗佐劑MPLA形成的脂質體疫苗可進一步提高宿主對細粒棘球絳蟲感染的抵抗力，高達95.07%[44]。

線蟲旋毛蟲14-3-3 蛋白聯合佐劑ISA50v2免疫小鼠，肌幼蟲減蟲率可達46.2%[26]；捻轉血矛線蟲重組14-3-3蛋白（rHcftt-2）疫苗免疫的山羊僅產生較弱的保護力，免疫組山羊排出的每克糞便蟲卵數（EPG）和蠕蟲負荷數較未免疫組相比分別降低26.46%、32.33%，同時減少了宿主血紅蛋白的損失[45]；而糞類圓線蟲14-3-3重組蛋白亞單位疫苗無任何保護力，免疫后小鼠血清中的IL-10、TGF-β、IL-13 和TNF-α 細胞因子水平雖然升高，但小鼠體內的蟲體和蟲卵數目甚至還高于未免疫小鼠[7]。

原蟲堆型艾美耳球蟲（E.acervulina）14-3-3蛋白DNA疫苗免疫的雞對柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的單獨或混合感染都呈現良好的抗球蟲效應，混合感染時抗球蟲指數（ACI）可達170.92，雞群相對體重增加86.82%，卵囊減少率為39.33%，且腸道損傷減輕（病變評分降低3.11±1.08）[46]，巨型艾美耳球蟲14-3-3 蛋白疫苗亦呈現良好的抗球蟲效應，攻蟲后的ACI可達166.96，卵囊減少率75.91%，也可明顯降低雞的腸道損傷評分[16]。

弓形蟲重組14-3-3蛋白聯合其他蛋白（MIF和CDPK3）組成的雞尾酒疫苗可有效抵抗致死性弓形蟲的感染，其體內包囊減少82.7%，且90%的免疫小鼠可存活[47]，而其14-3-3 蛋白DNA 疫苗雖可延長免疫組小鼠約11天的壽命，但無法抵抗致死性弓形蟲感染[48]。

犬新孢子蟲重組14-3-3蛋白免疫小鼠后，小鼠體內的蟲體負荷量顯著降低，組織病變也較輕，可顯著延長攻蟲后小鼠的壽命，但其存活率僅40%[15]。

3.5 寄生蟲14-3-3 蛋白作為潛在的血清學診斷靶標

除上述功能外，14-3-3蛋白還有望被用作寄生蟲疾病的血清學診斷。日本血吸蟲重組14-3-3 蛋白與其天然蛋白均能夠被日本血吸蟲感染患者和感染兔的血清識別[49]，旋毛蟲重組14-3-3蛋白同樣可以被早期感染旋毛蟲的豬或小鼠的血清所識別[50]，表明日本血吸蟲和旋毛蟲重組14-3-3蛋白具有作為血清學診斷靶標的潛力；糞類圓線蟲14-3-3蛋白所建立的血清學診斷方法具有較高的靈敏度（96%），且其特異性與市售試劑盒（Novatech）相似，表明14-3-3 蛋白可作為糞類圓線蟲的有效候選診斷抗原[51]。

4 展望

隨著近些年對寄生蟲14-3-3蛋白研究的深入，發現14-3-3蛋白與寄生蟲的生長發育和入侵有關，且能夠調節宿主免疫反應，其可作為潛在的寄生蟲病血清學診斷靶標和疫苗候選抗原。然而，關于寄生蟲14-3-3 蛋白在信號通路中的作用報道較少，14-3-3 蛋白在寄生蟲致病過程中具體的分子作用機制也尚未闡明，解決類似問題將為寄生蟲疾病的防治提供新思路。