己酮可可堿對冷凍前后精子的影響

王榮 宋春英 邢麗俊 王靜 李曉蓉 王慧芳

近年來男性不育發病率則逐年上升[1]。治療男性不育,提高精子質量,已經成為目前生殖研究的重中之重[2-3]。隨著體外受精技術的日漸成熟,已有不少研究通過體外精子優選和化學試劑體外刺激精子,從而有效提高精子的活力和受精能力,最終提高人工授精和體外受精-胚胎移植的妊娠率[4]。

己酮可可堿(pentoxifylline,PF)屬于甲基黃嘌呤類化合物,可以改善少弱精子的活力[5]。通過短時間用PF處理精子,可以有效提高精子活動率和精子運動能力[6]。但隨著PF處理精子時間的延長,精子膜的完整性明顯降低,增加了精子的死亡率[7]。同時過高的PF濃度也會造成精子功能減退及與透明帶結合能力的喪失。因此,出于安全性考慮PF在體外提高精子活動率和精子運動能力的特性,只能在低濃度、短時間下應用[8-9]。

本文旨在探討不同濃度PF較短作用時間下對精子冷凍前后活力和復蘇率的影響及其在對精子具體運動功能參數的影響,確定PF的作用濃度和作用時間,尋找出一種采用PF提高精子復蘇率和精子活力的方法,以期為人工授精和體外受精技術的研究和實踐提供依據,同時也為精子的體外處理技術的發展提供參考。

對象與方法

1.研究對象:選擇2019年 4月—12月,在本院精子庫健康體檢者的精液標本作為研究對象,所有研究對象均依據第五版世界衛生組織(WHO)精子的診斷標準,經醫院倫理委員會批準。納入標準:(1)年齡≥20歲且≤45歲;(2)血常規、肝腎功能正常;(3)獲得知情同意,簽署知情同意書。排除標準:(1)合并心肺、肝腎功能嚴重異常者;(2)精神疾病者;(3)傳染病患者;(4)有遺傳病家庭史或遺傳病的。最終納入了30例健康體檢者,年齡21～30歲,平均(24.12±3.82)歲;職業:大學在校生11例,公司白領7例,公務員7例,其他5例;

2.標本處理和觀察指標:

(1)冷凍前:所有研究對象均禁欲 3～7 d后試驗。采用手淫法取得全份新鮮精液標本,將其放置于 37℃條件下,恒溫孵育箱中 30 min 左右,完全液化后備檢。將精液分裝到5組冷凍管中,每管0.2 mL,其中的4組分別加入配有PF的保護液,使其終濃度分別為0.6 mmol/L、1.2 mmol/L、2.4 mmol/L、3.6 mmol/L,充分混合,對照組加入等體積的保護液。在孵育10 min后,用計算機輔助精子分析儀(computer-aided sperm analysis,CASA)檢測精子各項參數,每份標本,觀察精子數≥200個,觀測3個視野,測定精子濃度和活力不同濃度PF作用下的精子活力[前向運動型(progressive,PR)、 非前向運動型(non-progressive,NP)、完全不動型(immotile,IM)]變化。并進行活力檢測及精子運動功能檢測[包括精子直線速度straight line velocity,VSL)、曲線速度(curvilinear velocity,VCL)、擺動性(wobble,WOB)、側擺幅度(amplitude of lateral head displacement,ALH)、直線性(linearity,LIN)]。

(2)冷凍后:使用Grant EF 600 程序降溫儀冷凍精子,按照設置好的精子冷凍曲線,進行冷凍,當溫度達到-80℃時,轉移到液氮中,在-196℃下保存24 h,然后進行復蘇操作。將精液標本冷凍管從液氮中取出,迅速置于37℃水浴中。保溫復蘇10 min后,取出備檢。

結果

1. PF對精子濃度及復蘇率的影響:冷凍前和復蘇后的各組精子濃度相互之間沒有顯著性差異(P>0.05),說明精液混勻程度高,結果可信。與對照相比,添加PF的各組精子復蘇率均有增加,其中0.6 mmol/L組、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L組的則有明顯增加(P<0.05)見表1;但是增加趨勢并未出現明顯的濃度依賴性。

表1 不同濃度PF體外對精子濃度及復蘇率的影響

2.PF對精子活力的影響:在精子冷凍前,與對照組相比各組精子PR均沒有明顯增加(P>0.05);1.2 mmol/L組和3.6 mmol/L組精子NP出現顯著減少(P<0.05),其余兩組減少不顯著(P>0.05);各組精子IM均沒有明顯減少(P>0.05)。其余組之間沒有統計學差異,見表2。在精子復蘇后,與對照相比各組精子PR均有增加,其中0.6 mmol/L組、2.4 mmol/L組和3.6組精子出現顯著增加(P<0.05);各組精子NP出現增加,其中2.4 mmol/L組精子出現顯著增加(P<0.05);各組精子IM均明顯減少(P<0.05)。但減少幅度并沒有濃度依賴性。

表2 不同濃度PF體外對精子的活力的影響,(%)

3.PF對精子運動功能的影響:各組的精子VSL均沒有顯著性差異。與對照相比,1.2 mmol/L組、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L 組的精子VCL均有明顯增加(P<0.05);1.2 mmol/L組、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L 組的精子ALH均有明顯增加(P<0.05);1.2 mmol/L、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L 組的精子WOB均有明顯減少(P<0.05);1.2 mmol/L、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L 組的精子LIN均有明顯減少(P<0.05);并且1.2 mmol/L、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L 組的VCL、ALH、WOB和LIN的變化幅度均出現了一定的濃度依賴性,見圖1。

注:a代表與對照組比較p<0.05;b代表與0.6 mmol/L組比較p<0.05;c代表與1.2 mmol/L組比較p<0.05,mM為Mmol/L的簡寫。

與對照相比,4個組的精子VSL均有明顯增加(P<0.05);0.6 mmol/L組、2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L組的精子VCL均有明顯增加(P<0.05);2.4 mmol/L組和3.6 mmol/L組的精子ALH均有明顯增加(P<0.05);1.2 mmol/L組和2.4 mmol/L組組的精子WOB均有明顯減少(P<0.05);4個組的精子LIN均沒有顯著性差異,見圖2。

注:a代表與對照組比較P<0.05;b代表與0.6 mmol/L組比較P<0.05;c代表與1.2 mmol/L組組比較P<0.05,mM為Mmol/L的簡寫。

討論

精子的運動是需要耗能的,能量一般認為是由精子線粒體提供,而線粒體的供能受糖酵解及一系列磷酸化作用所調節,受到腺苷酸環化酶系統的控制[10]。PF提高精子活力及運動功能的機制尚不十分明確,普遍認為可能與環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)有關。cAMP可以調節磷酸化作用,從而影響精子供能,可以影響精子尾部軸絲的運動,還能調節精子細胞膜上離子流動,尤其是鈣離子的轉運,這些因素均可最終影響到精子運動[11]。PF是一種為黃嘌呤衍生物,屬于非特異性的磷酸二酯酶抑制劑,可以cAMP轉為腺苷酸(adenosine monophosphate,AMP),升高精子細胞內cAMP濃度,最終提高精子的運動功能[12]。

相較于健康人群,少弱精子癥患者的精子冷凍保存難度更大,因而目前PF的研究和應用大多集中在該類患者的精子冷凍上,但是其冷凍復蘇原理與健康人群是相通的,已酮可可堿的作用機制是一致的。本實驗選取的是健康體檢者檢查剩余的精液標本,實驗對象的精子本身的活動率都>60%,采用正常精液研究的好處是不需要進行精液離心上游,精子優選等操作,能夠更好的排除各種培養液的干擾,從而為臨床更好的提供數據支持。

為減少對精子的損傷,本實驗主要考慮了:已酮可可堿的濃度、孵育時間和添加順序這三個因素。通過文獻調研發現,體外應用已酮可可堿的常見濃度有:0.1、0.3、0.6、1、1.8、2、3、3.6、4、5、7.2、8、16 mmol/L等;作用時間有:5、10、30、60、120 min等[10,12-13]。經過預實驗摸索,最終選取了0.6 mmol/L、1.2 mmol/L、2.4 mmol/L、3.6 mmol/L四個濃度梯度。同時,理論上應盡量縮短己酮可可堿的孵育時間。但在實際操作中,由于精液混勻、檢測讀數、形成報告等均需要時間,操作時間會不可避免的帶來誤差。而孵育時間越短,則操作時間的帶來誤差干擾就越大。綜合考慮,本實驗選取的孵育時間為10 min。

在冷凍前添加己酮可可堿,不僅使操作更為簡便,對精子的損傷也更小,具體表現在:1)在冷凍時,直接使用添加了己酮可可堿的保護劑進行冷凍,這樣相對于正常冷凍來說沒有增加溶劑。2)由于在冷凍程序降溫階段和復蘇孵育階段,已酮可可堿已經存在于精液中,從而發揮作用了,相對于復蘇后再添加,則能節省復蘇后孵育的時間。3)冷凍前的精子更易耐受混勻攪拌,從而增加了精子的存活率。

為減小誤差,本實驗使用程序降溫儀進行精子冷凍,可以保證同一實驗批次的精子標本,以相同的冷凍曲線進行冷凍。使用計算機輔助精子分析儀(CASA)檢測精子各項參數,每份標本觀察精子數≥200個,觀測3個視野,從而排除人肉眼觀察的誤差。同時為更準確的判斷精子活力變化,本實驗將精子運動能力參數化,這些參數是CASA根據精子的運動軌跡,使用特定公式計算得到的,可以更為精確的描述精子的運動功能[14]。其中直線速度VSL和曲線速度VCL是最有代表性的兩個精子運動指標,值越高則精子活力越好。擺動性WOB越小則擺動性越大,說明精子活力越高。側擺幅度ALH的值越高,精子的活力越高。直線性LIN,也稱線性度,為精子運動曲線的直線分離度。精子的運動能力直接決定了精子的活力,對這些運動參數進行統計分析,有助于更深入的判斷精子的活力變化。

實驗結果顯示添加PF后,不會對精液的濃度產生影響。在冷凍前后均可以改善精子活力,能夠顯著的提高精子的復蘇率;能夠提高精子活力,提高其中PR精子的占比,降低IM精子的占比;能夠提高精子的運動能力,尤其是對VSL和VCL的提高最為顯著。這種提高作用在精子冷凍前后均有體現,復蘇后PF的提高作用更加明顯,并且隨著PF濃度的增加,復蘇率逐漸提高。目前數據顯示在體外作用10 min時,終濃度為3.6 mmol/L的PF作用效果最好。

此項研究具有重要的臨床意義,如行ICSI時,如果男性患者的精液中沒有a級和b級精子,只有c級精子時,可以嘗試選擇低濃度的PF進行短時處理,如果c級精子得以激活成a級或b級精子,則會有效提高工作人員挑選效率[15]。

需要說明是文中數據針對的只是健康男性精子冷凍前添加PF對其活力和精子運動的影響。所以對于少弱精癥患者的精子而言,本實驗結果僅具備參考價值,還有待進一步實驗。此外,由于滿足實驗條件的健康體檢者數目較少,所以樣本量較少,實驗結果仍需要驗證。