不同水分和光照處理對走馬胎生理生化特性的影響*

王文濤,魏 蓉,徐幸酬,3,李亞麗,陳紅鋒**

(1.中國科學院華南植物園,中國科學院植物資源保護與可持續利用重點實驗室,廣東廣州 510650;2.中國科學院大學,北京 100049;3.贛南師范大學,江西贛州 341000)

走馬胎(Ardisiakteniophylla)為報春花科(Primula)紫金牛屬(Ardisia)多年生常綠灌木[1],是我國嶺南少數民族地區常用的民間藥物,素有“嶺南藥王”之稱[2]。其根或根莖常作為風濕跌打藥被廣泛使用,有“兩腳邁不開,就用走馬胎”的說法[3]。其葉亦供藥用,具有去腐生肌、消炎等功效,并作為少數民族(瑤、苗、壯、侗等)傳統藥浴的常備原料[4],在傳統瑤醫理論“七十二風”中占有重要地位。其三萜皂苷類成分具有顯著的抗腫瘤作用[5,6]。然而,隨著市場需求的不斷增大以及當地人們掠奪性的采挖,其野生植物資源遭到嚴重破壞[2]。目前,走馬胎已被《廣東省重點保護野生植物名錄》收錄為地方重點保護野生植物。因此,推動走馬胎人工栽培勢在必行。走馬胎生性喜陰,常見于林下陰暗潮濕的地方[7]。光照和水分是影響走馬胎生長的重要因素。

作為影響植物茁壯成長的關鍵生態因子[8],光和水的時空變化及其交互作用,使植物在形態特征、生理反應及次生代謝產物等方面產生可塑性響應[8-10]。研究發現,吊羅山薹草(Carexdiaoluoshanica)在40%透光率和70%土壤持水量(θf)下生長最好[9]。印楝(Azadirachtaindica)在充足光照和適當干旱脅迫下,其初生代謝及次生代謝產物的積累顯著提高[10]。然而,走馬胎的生長和代謝在不同水分和光照條件下的研究尚未見報道。因此,本文采用盆栽試驗和人工遮光的方法研究不同水分和光照條件對走馬胎生長、生理指標、光合特性和藥效成分的影響,以期找出走馬胎生長的最適光照和水分條件,為走馬胎的野外保護及引種栽培提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料和組別設置

走馬胎種子采于廣東省南雄市,其帶果植株經華南植物園陳紅鋒研究員鑒定為報春花科植物走馬胎(ArdisiakteniophyllaA.DC)。

試驗于2016年4-7月在廣東省廣州市華南植物園種質資源圃進行,選擇生長環境一致、植株形態大小相似、健康無病斑的二年生走馬胎苗,單株種于花盆中。選取泥炭∶細沙∶椰糠=2∶2∶1的混合栽培基質。試驗采用雙因素隨機區組設計。遮陽棚采用塑料膜和遮陽網搭建,設置3 個光照梯度:30%-40%透光率(L1)、20%-30%透光率(L2)、10%-20%透光率(L3)。水分處理設置3個水分梯度:90% -100%θf(W1)、70% -80%θf (W2)、50%-60%θf (W3)。共計產生9個處理組(L1W1、L1W2、L1W3、L2W1、L2W2、L2W3、L3W1、L3W2、L3W3),每個處理組3盆幼苗,共27盆。試驗時間共90 d。

1.2 株高和莖粗測定

試驗結束后采樣。首先將各處理組中走馬胎植株進行標記,然后測量生長指標:卷尺量株高,游標卡尺統一在距離地面2 cm 部位測量莖粗。各指標測定均為3次重復。

1.3 不同組織部位生長量測定

株高和莖粗測量結束后,將走馬胎植株從盆內取出,抖掉泥土,流水沖洗干凈,隨后用枝剪將其分離成根、莖及葉等不同部位,再置于烘箱內,100℃殺青30 min,然后在60℃下烘干至恒重后稱量干重,重復3次。稱量完的樣品保存于干燥箱備用。

1.4 生理指標測定

試驗結束后,隨機選取各處理組中位置相同、形態相似的健康植株葉片,用蒸餾水沖洗干凈,帶回實驗室測定各生理指標,每個處理組重復3次。脯氨酸(Proline)采用茚三酮比色法測定[11];可溶性糖采用蒽酮比色法測定[12];丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法測定[12];細胞質膜相對透性(RP)采用雷磁DDS-11A 數顯電導率儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)測定[12]。

1.5 光合生理指標測定

葉綠素含量以走馬胎葉片為材料,采用95%乙醇萃取,并用分光光度法測定[11]。走馬胎苗在適應各組處理后,選一個天氣晴朗的上午(8:30-11:30),利用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR 公司,美國)測定光合作用-光響應曲線[13],測定從1 500μmol·m-2·s-1光合有效輻射(PAR)開始,依次降為1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1,所有數據均由光合儀自動記錄。

1.6 總皂苷測定

走馬胎總皂苷采用紫外-可見分光光度法測定,其主要步驟如下:將1.3節中已干燥的走馬胎根、莖及葉樣品分別準確稱取0.2 g,置于錐形瓶中,加入50 m L 50%乙醇,稱量,超聲提取30 min(超聲功率為240 W),靜置于室溫,50%乙醇補足質量。根及莖樣品過濾,收集續濾液作為供試品備用。葉樣品補足質量后,濾過,濾渣與錐形瓶用20 m L 50%乙醇分數次洗滌,合并濾液和洗液于250 m L 茄形瓶中,減壓回收溶劑至無醇味。定量轉移至分液漏斗中,用等體積石油醚萃取3次,棄去石油醚層,水層定量轉移至50 m L量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,作為供試品備用。最后用L5S型紫外可見分光光度計(山東濟南禾普儀器設備有限公司)檢測,波長設定為520 nm。以齊墩果酸為標準品,獲得回歸方程為y=0.0044x-0.0212,R=0.999 3,對走馬胎總皂苷成分進行定量計算。

1.7 數據統計

采用Microsoft Office Excel 2013進行數據錄入和統計,利用SPSS 26軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗,作圖采用Graphpad Prism 8軟件,圖片編輯采用Adobe Illustrator 2021軟件。使用光合數據分析軟件Photosynthesis V1.0 計算光飽和點(Light Saturation Point,LSP)、光補償點(Light Compensation Point,LCP)、最大凈光合速率、光下呼吸速率、光合速率擬合值及表觀量子效率(Apparent Quantum Efficiency,AQE)等參數,采用經典的非直角雙曲線模型擬合曲線。

2 結果與分析

2.1 水分及光照處理對走馬胎株高、莖粗及生物量的影響

通過雙因素方差分析(表1)可以看出,不同水分條件對走馬胎株高,根、莖、葉及全株生物量均產生顯著影響,對莖粗影響不顯著;光照條件對各生長指標均產生顯著影響;而二者的交互作用對株高,根、莖及全株生物量影響顯著,對莖粗和葉生物量影響較小。

表1 走馬胎各項指標的二元方差分析(F 值)Table 1 Dualistic variance analysis of various indexes of A.kteniophylla(F value)

如圖1所示,在水分條件相同時,走馬胎的株高,莖粗,根、莖、葉及全株的生物量均在L2 條件下最高,顯著高于L1和L3。表明走馬胎在20%-30%透光率下生長最好,過高或過低的透光率都會使其生長受到明顯抑制。在光照條件相同時,株高以及莖粗均在W2條件下最高,但沒有表現出顯著性差異;根、莖、葉及全株的生物量在不同水分條件下,均表現出顯著性差異(P＜0.05),并且其變化規律基本一致:W2＞W1＞W3。表明走馬胎在70%-80%θf條件下生長最好,水分過多或過少其生長都會受到限制。

圖1 光照和水分對走馬胎生長指標的影響Fig.1 Effects of light and water treatments on the growth parameters of A.kteniophylla

2.2 水分和光照對走馬胎滲透調節物質及膜質過氧化作用的影響

由表1可知,不同水分及光照條件對走馬胎脯氨酸和可溶性糖的含量均產生顯著影響,二者交互作用對脯氨酸影響顯著,而對可溶性糖的影響較小。如圖2所示,在相同水分條件下,脯氨酸和可溶性糖含量大體上隨著光照強度的降低而降低,均是在L1條件下達到最大值,并顯著高于其他處理,在L2和L3條件下沒有顯著性差異。走馬胎在30%-40%透光率下,脯氨酸和可溶性糖等生理滲透調節物質顯著積累,表明光照太強對走馬胎來說屬于逆境。在相同光照條件下,脯氨酸的含量在W3最高,其次為W1,最小為W2;而可溶性糖的含量則表現出隨著水分減少而不斷增加的規律,即W3＞W2＞W1,并且不同水分處理之間差異顯著(P＜0.05)。由此可見,脯氨酸和可溶性糖等生理滲透調節物質分別在70%-80%θf和90%-100%θf條件下積累最少,表明走馬胎適宜生長在水分充足的環境中。此外,水分和光照強度對脯氨酸存在顯著的交互作用,L1W3條件下脯氨酸含量最高。

圖2 光照和水分對走馬胎生理指標的影響Fig.2 Effects of light and water treatments on the physiological parameters of A.kteniophylla

由表1可知,不同水分及光照條件對丙二醛含量和細胞質膜相對透性均產生顯著影響,二者交互作用對丙二醛含量的影響顯著,而對細胞質膜相對透性的影響較小。如圖2所示,在水分條件相同時,丙二醛含量隨著光照強度的降低而降低,L1條件下丙二醛含量顯著高于其他處理組;細胞質膜相對透性在L1條件下最高,其次為L3,在L2條件下最低。在3種水分條件下,丙二醛含量和細胞質膜相對透性均在L1條件下最高,表明在30%-40%透光率時,走馬胎膜系統的受害程度最重。在相同光照條件下,丙二醛含量和細胞質膜相對透性均是在W3條件下最高,其次是W1,最低為W2。其中,二者在W2條件下均顯著低于處理組W1和W3。走馬胎在70%-80%θf條件下,丙二醛含量和細胞質膜相對透性等膜質過氧化指標最低,表明該水分生長條件下,走馬胎膜的穩定性最好。

2.3 水分和光照對走馬胎葉綠素及總皂苷含量的影響

通過雙因素方差分析(表1)可以看出:水分對葉綠素含量主效應不顯著,光照對葉綠素含量的影響達到了顯著水平;光照和水分的交互作用對葉綠素含量影響達到了顯著水平。從圖3可知,在相同水分條件下,葉綠素含量在不同光照條件下均表現出先升高后降低的趨勢,在L2光照條件下葉綠素含量最高,L3條件下葉綠素含量最低。在L1和L2光照條件下,葉綠素含量均呈隨水分降低而降低的趨勢,但各處理組間差異不顯著;在L3光照條件下,葉綠素含量則表現出先降低后增高的趨勢。此外,水分和光照對葉綠素含量存在顯著的交互作用,L2W1條件下葉綠素含量最高。

圖3 光照和水分對走馬胎葉綠素及總皂苷含量的影響Fig.3 Effects of light and water treatments on the contents of chlorophyll and total saponins in A.kteniophylla

雙因素方差分析表明水分對走馬胎的根、莖及葉總皂苷含量影響顯著,光照除了對莖總皂苷的影響不顯著外,對走馬胎的根、葉總皂苷含量影響達到顯著水平。光照和水分的交互作用對走馬胎的根及葉總皂苷含量影響達到顯著水平(表1)。從圖3可知,走馬胎根總皂苷的含量在W2和W3水分條件下,有隨著光照的減弱呈先升高后降低的趨勢,L2與L3間沒有顯著性差異,而二者均顯著高于L1;在W1 條件下,根總皂苷含量隨著光照的減弱表現出逐步升高的趨勢,但各處理組間差異不顯著。走馬胎莖、葉中總皂苷的含量在W1和W3水分條件下,隨著光照的減弱表現出先升高后降低的趨勢;在W2條件下,莖總皂苷的含量在不同光照條件下差異不顯著,葉總皂苷的含量在L1光照條件下顯著高于其他處理組(P＜0.05)。走馬胎在L2光照條件下,除莖、葉的W2水分條件下外,其余組織部位及水分條件的總皂苷含量均最高。相同光照條件下,走馬胎根、莖總皂苷的含量均表現出隨著水分的減少而升高的趨勢,其中W3處理組顯著高于W2和W1,而W2和W1處理組間差異不顯著;葉總皂苷含量在L1光照條件下,隨著水分的減弱表現出先升高后降低的趨勢;在L2光照條件下,表現出隨著水分的減弱先降低后升高的趨勢,W3處理組顯著高于其他處理組;而在L3光照條件下,各水分處理組間差異不顯著。走馬胎在W3水分條件下,各個組織部位的總皂苷含量均最高。此外,水分和光照對走馬胎根和葉總皂苷含量存在顯著的交互作用,根和葉總皂苷含量均在W3L2 條件下最高。

2.4 走馬胎葉片的光合作用-光響應曲線

植物對光照條件的要求由植物的光飽和點和光補償點體現,LSP、LCP與植物利用光能進行光合作用的能力有關。如圖4所示,在相同水分不同光照條件下,在達到光飽和點之前,凈光合速率(Net Photosynthetic Rate,Pn)隨光合有效輻射PAR的增加而增大;在達到光飽和點后,Pn隨PAR的增加趨于穩定并有降低的趨勢,可能是過高的光照強度引起了光抑制。

圖4 不同透光率下走馬胎的光合速率Fig.4 Photosynthetic rate of A.kteniophylla under different light transmittance

如表2 所示,隨著光照強度的下降(L1W2＞L2W2＞L3W2),葉片最大凈光合速率Pmax和LSP隨之遞減,表觀量子效率隨之增加,L1 與L2、L3 之間差異顯著(P＜0.05),L2與L3之間差異不顯著。LCP是植物耐陰性評價的重要指標,直接反映植物對弱光的利用能力。陽性植物的光補償點為9-18 μmol·m-2·s-1,陰性植物的光補償點＜9μmol·m-2·s-1,從表2可以看出走馬胎植株對弱光有較強的適應能力。

表2 不同光照條件對走馬胎光合特性的影響Table 2 Effects on photosynthetic characters of A.kteniophylla in different light conditions Unit:μmol·m-2·s-1

3 討論

植物生長受外界環境條件的影響,光照和水分作為植物生長發育必不可少的環境因子,對植物的生長和發育起著決定性的作用[14-16]。研究發現,低水分抑制植株的苗高、地徑和葉面積等,而低光照同樣會使植株的葉面積、株高及基徑等降低[14,15]。董伊晨等[16]研究發現,隨著土壤水分的降低,異株蕁麻(Urticadioica)生長量和生物量積累呈先上升后下降趨勢,其最佳生長的土壤水分為67.90%-80.74%。本研究結果表明,走馬胎在70%-80%θf條件下,株高,莖粗,根、莖、葉及全株生物量的值均最高,表明該水分條件下走馬胎生長最好;而在50%-60%θf的低水分條件下,走馬胎生長受到顯著抑制,這也與前人的研究結果[14,16]一致。有研究表明,走馬胎在弱光條件(20%)下產量最高[4]。本研究中,走馬胎在20%-30%透光率下,株高,莖粗,根、莖、葉及全株生物量均最高,這也與周澤建[4]的研究結果類似。因此,走馬胎的最適生長環境為70% -80%θf 和20%-30%透光率。

游離脯氨酸和可溶性糖作為常用的植物生理滲透調節物質,在植物遭受低溫、干旱、水澇及強光等逆境脅迫時會在體內大量積累,以提高細胞的滲透調節,這是植物自身的一種保護性反應[10,17]。MDA 作為膜質過氧化產物之一,其含量可以表示膜系統的損傷程度[15];而細胞質膜相對透性則能反應出膜的穩定性,其值越大表示細胞膜損傷程度越大[18]。本研究結果表明,脯氨酸、可溶性糖、MDA 及細胞質膜4種抗逆相關的生理指標主要是在強光照(L1)下大量積累,而在低光照條件下沒有明顯變化。這也與周澤建[4]的研究結果一致,但與甘薯(Dioscoreaesculenta)[19]和紅毛五加(Eleutherococcusgiraldii)[20]的研究結果相反。同時,研究表明在水分不足時,會導致MDA 含量增多,細胞質膜相對透性增大,脯氨酸和可溶性糖含量增高。這也與前人的研究結果[15,21,22]一致。綜上,較強光照和較低的水分條件使得MDA 含量積累增多,并導致細胞質膜相對透性增大,這對植株的膜和細胞造成一定損傷。走馬胎通過積累脯氨酸和可溶性糖來提高細胞的滲透調節能力,使細胞膨壓得以維持,從而減緩環境脅迫帶來的負面影響。因此,從抗逆生理指標來看,強光照和低水分對走馬胎來說屬于逆境,70%-80%θf和20%-30%透光率最適于走馬胎生長。

走馬胎主要藥用成分為具有抗腫瘤作用的多種三萜皂苷類成分。藥用植物在逆境脅迫下,作為主要藥效成分的次生代謝產物往往會大量積累[4,10]。研究表明適度缺水情況下,菘藍(Isatistinctoria)根部靛玉紅的含量積累呈升高的趨勢[23],黃檗(Phellodendronamurense)幼苗中藥根堿、小檗堿及掌葉防己堿的合成積累增多[24]。本研究發現,走馬胎在同一水分條件下,在L2和L3光照條件下,根、莖的總皂苷含量均較高。這也與周澤建[4]的研究結果一致。相同光照條件下,走馬胎根、莖總皂苷的含量在W3處理組較高,與菘藍[23]、黃檗[24]一致。這表明水分較低的逆境更有利于走馬胎總皂苷的合成積累。

通過擬合光合作用-光響應曲線得到一系列光響應特征參數,對了解植物光合作用進程中的光化學效率有著重要意義[25]。LSP是植物的光合速率達到最大值時的光照強度,代表了植物耐強光的能力[25]。LCP可代表植物的耐陰能力,LCP越低,說明植物利用弱光的能力越強[26]。AQE是指植物光合作用的光能利用效率,AQE越高,說明葉片光能轉化效率越高,利用弱光的能力越強[27]。Pmax是植物光合潛能的重要參數,反映植物最大光合作用能力[28]。本研究結果表明,走馬胎在較強光照(L1)下,植物光合潛能最高,但對光的利用效率最低。而在L2 條件下,其光合作用潛能及光的利用效率適中,最適宜植物生物量的積累,這也與本研究中生物量在L2條件下積累最多的結果(圖1)一致。本研究中,LSP隨光照強度的下降遞減,LCP為3-6μmol·m-2·s-1,而陰生植物LCP＜9μmol·m-2·s-1,這表明走馬胎耐強光能力較弱,利用弱光的能力較強,符合典型的陰生植物特點[29]。

4 結論

本研究結果表明,強光照和低水分對走馬胎的影響較大,不利于其生長。70%-80%θf和20%-30%透光率為走馬胎最適生長條件,并且適度的缺水脅迫能夠促進藥效成分總皂苷的合成積累。光照和土壤水分對走馬胎的生長、生理指標、光合特性和藥效活性成分具有一定的影響。該研究可為走馬胎的野外保護、人工栽培以及更好地開發利用提供參考。