林分類型對亞熱帶森林土壤團聚體中真菌反硝化微生物豐度的影響

鄧米林，林永新，葉桂萍，胥 超，宛 頌，賀紀正

(1.福建師范大學濕潤亞熱帶山地生態國家重點實驗室培育基地，福建 福州 350117；2.福建師范大學地理科學學院，福建 福州 350117；3.閩江學院地理與海洋學院，福建 福州 350108；4.福建三明森林生態系統與全球變化國家野外科學觀測研究站，福建 三明 365000)

森林是陸地生態系統的主要組成部分，約占全球陸地面積的27.7%[9]。森林土壤可以作為大氣中N2O的源或匯，在調節全球氣候變化的過程中發揮著至關重要的作用[9]。我國濕潤亞熱帶地區森林廣布，約占全國森林總面積的34%，且該地區屬于典型的季風氣候，水分飽和，土壤高度風化呈酸性，是全球最大的N2O天然來源之一[10]。Zhang等[11]認為，真菌可能是亞熱帶森林土壤N2O的潛在重要排放源。Wu等[12]研究發現，亞熱帶森林土壤的真菌群落比溫帶森林土壤更豐富。Prendergast-Miller等[13]指出，菌根真菌可以產生N2O，表明真菌在森林土壤N2O產生過程中發揮重要作用。章偉等[14]研究發現天然林土壤真菌反硝化活性高于細菌，但對產生N2O的貢獻與細菌相當。Chen等[15]對人工林和廢棄農田等多個生態系統進行研究發現，真菌對不同生態系統土壤N2O的產生均有很大貢獻，且在酸性人工林中貢獻更高。盡管前人已對森林土壤真菌反硝化過程開展了部分研究，但大多數研究只關注真菌對N2O排放量的貢獻，而對產生N2O的關鍵基因FnirK及其影響因素的研究極其匱乏。此外，團聚體作為土壤的重要分類單元和功能調節器，可為微生物的定居提供合適的微環境。但目前關于團聚體中真菌反硝化微生物的研究甚少。Lin等[16]對長期施肥的農田土壤研究發現粒徑較小的團聚體(<0.053 mm和0.053～ <0.25mm)中FnirK豐度高于較大團聚體(0.25～2 mm和> 2 mm)。那么，FnirK在森林土壤不同粒徑團聚體中如何分布？不同林分類型是否會通過影響團聚體粒徑大小從而影響FnirK基因豐度？不同粒徑團聚體中FnirK基因豐度對林分類型的響應是否存在差異？目前尚不清楚。

基于以上研究背景，本研究選取了3種典型亞熱帶森林土壤：米櫧次生林、杉木人工林和馬尾松人工林，利用熒光定量PCR，分析不同林分類型對土壤團聚體中真菌反硝化微生物功能基因FnirK豐度的影響，以期為亞熱帶森林管理和N2O溫室氣體減排提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究區位于福建省三明市森林生態系統與全球變化研究站陳大觀測點(26°19′N，117°36′E)。該地區以丘陵和山地為主，屬于亞熱帶海洋性季風氣候，年平均氣溫19.1 ℃，相對濕度81%，年平均降水量1 749 mm，且主要集中在3月至8月之間。研究區土壤由花崗巖發育而成，屬于紅壤。近200多年里，米櫧天然林一直是該地區的優勢種。除米櫧外，該地區還包含格式栲(Castanopsiskawakamii)、木荷(Schimasuperba)、桂北木姜子(Litseasubcoriacea)、杜英(Elaeocarpusdecipiens)等物種。米櫧次生林由米櫧天然林在1976年經過高強度的選擇性砍伐后自然再生而成；杉木人工林和馬尾松人工林在同一時間由米櫧天然林經過砍伐、焚燒后人工種植幼苗長成。米櫧次生林、杉木人工林、馬尾松人工林的平均樹高分別為13.7、18.2、18.3 m，平均胸徑分別為16.8、15.6、18.3 cm，林分密度分別為2 158、2 858、1 500株·hm-2[17]。

1.2 樣地設置與樣品采集

土樣采集于2022年1月，在米櫧次生林(SF)、杉木人工林(CF)和馬尾松人工林(PF)坡度均勻的地段分別選取4塊20 m×20 m樣方，共計12塊樣方。刨除表面雜草和凋落物，用鐵鍬鏟下0～10 cm深的土塊，每塊呈三角狀間隔3 m左右分別取3份土壤混合成一個重復，共計12份樣品。對采集的全土(bulk soil)用自封袋包好后放入塑料方盒保鮮，防止運輸途中破壞團聚體結構，在實驗室過8 mm篩后挑去碎石、細根和凋落物等雜質，隨后分為4份，其中1份用于團聚體的篩分，其余3份過2 mm篩后分別進行風干、保存于4 ℃和-80 ℃冰箱，分別用于理化性質、反硝化潛勢測定和分子生物學試驗。

1.3 土壤理化性質測定和團聚體分級

土壤pH值、總有機碳、可溶性有機碳、銨態氮、硝態氮、全氮、有效磷和土壤含水率的測定方法參照鄧米林等[18]進行。團聚體的篩分參考Elliott[19]進行，采用濕篩法將土壤團聚體分為4種粒徑：大團聚體(>2 mm)、小團聚體(0.25～2 mm)、微團聚體(0.053～<0.25 mm)和粉-黏顆粒(<0.053 mm)。將得到的各組分進行冷凍干燥后計算質量分數，隨后保存于-80℃冰箱用于分子生物學試驗。

1.4 土壤反硝化潛勢的測定

反硝化潛勢(PD)參照王夢娟等[20]所述方法進行，即稱取(10±0.05) g(烘干稱質量)新鮮土樣于300 mL玻璃培養瓶中，蓋上封口膜后放置于25 ℃恒溫恒濕培養箱中過夜預培養24 h。取出后向瓶中加入20 mL去離子水，搖勻后蓋上帶三通閥的瓶蓋，用高純氮氣反復沖洗培養瓶直至形成無氧環境，用注射器抽取30 mL高純乙炔代替瓶內頂空氣體。置于恒溫振蕩培養箱25 ℃，100 r·min-1培養12 h。培養過程中于0、6、12 h用針筒采集瓶內上方氣體5 mL，用氣相色譜儀(GC2030，島津，日本)測定N2O氣體濃度，反硝化潛勢根據采集氣體的N2O濃度和時間的一次方程斜率計算[21]。

1.5 土壤總DNA提取和熒光定量PCR

稱取0.5 g保存于-80 ℃冰箱的全土和冷凍干燥后的各粒級團聚體組分，按照FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒的操作說明，提取土壤總DNA，利用實時熒光定量PCR(Bio-Rad Laboratories，Harcules，美國)測定FnirK基因的豐度。引物序列、反應體系、反應條件和標準曲線的制作參照Lin等[16]。根據標準曲線計算FnirK的拷貝數，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增后的產物有無非特異性擴增。溶解曲線為單峰，擴增效率為126.5%，R2為0.996。

1.6 數據處理與分析

采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)研究不同林分類型對土壤理化性質、團聚體結構、FnirK基因豐度和反硝化潛勢的影響，以及土壤團聚體對FnirK基因豐度的影響。利用LSD檢驗差異顯著性(α=0.05)。采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)比較不同林分類型和團聚體大小對FnirK基因豐度的影響。利用Pearson相關性分析FnirK基因豐度和反硝化潛勢與土壤理化性質之間的相關性。采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質和團聚體結構

由表1可以看出，杉木人工林和馬尾松人工林土壤pH顯著高于次生林。次生林土壤銨態氮含量顯著高于杉木人工林和馬尾松人工林，有效磷和含水率均顯著低于馬尾松人工林，但與杉木人工林無顯著差異。3種林分土壤大團聚體和小團聚體占比較高，小團聚體和粉-黏顆粒占比較低(表2)。除次生林土壤小團聚體占比高于杉木人工林外，不同林分類型土壤團聚體組成均無顯著差異。

表1 不同林分類型土壤理化性質和FnirK基因豐度Tab.1 Soil physicochemical properties and FnirK gene abundance in different forest types

表2 林分類型對土壤團聚體粒徑分布比例的影響Tab.2 Effects of forest types on the particle size distribution ratio of soil aggregates %

2.2 土壤團聚體FnirK基因豐度和土壤反硝化潛勢

由表1可以看出，馬尾松人工林全土FnirK基因豐度最高，為5.30×108copies·g-1，顯著高于杉木人工林土壤的2.49×108copies·g-1和次生林土壤的1.21×108copies·g-1。土壤團聚體各粒級的FnirK基因豐度呈現同樣趨勢：馬尾松人工林>杉木人工林>次生林(圖1)。雙因素方差分析表明，林分類型顯著影響FnirK基因豐度(P<0.001)，而團聚體大小及其交互作用對FnirK均無顯著影響(表3)。與次生林相比，天然林轉變為杉木人工林顯著增加了微團聚體和大團聚體中FnirK基因豐度；天然林轉變為馬尾松人工林顯著增加了4種粒級團聚體中FnirK基因豐度。此外，馬尾松人工林和杉木人工林土壤具有較高的反硝化潛勢，分別為10.23和6.41 μg·kg-1·h-1，顯著高于次生林土壤的2.76 μg·kg-1·h-1。相關性分析表明，反硝化潛勢與土壤pH值和FnirK基因豐度顯著正相關(圖2)。FnirK基因豐度和反硝化潛勢與土壤可溶性有機碳含量呈顯著負相關，與有效磷含量和含水率均呈顯著正相關。

不同大寫字母表示相同粒徑不同林分類型之間差異顯著；不同小寫字母表示同一林分不同粒徑之間的差異顯著(P<0.05)。圖1 不同林分類型土壤團聚體中FnirK基因豐度Fig.1 The abundance of FnirK gene in soil aggregates of different forest types

表3 林分類型和團聚體粒徑及其交互作用對土壤FnirK基因豐度影響的雙因素方差分析Tab.3 Two-way analysis of variance (ANOVA)of the effects of forest type，aggregate size and their interactions on FnirK gene abundance

3 討論

土壤基本理化性質如pH值、含水率、有效磷以及碳氮有效性等是調控土壤微生物的豐度、多樣性和群落組成的主要非生物因子[22-25]。本研究結果表明，不同林分土壤團聚體組成無顯著差異，這可能是由于團聚體結構與土壤有機質含量密切相關，而3種林分土壤有機碳含量無顯著差異，因此3種林分團聚體組分無顯著差異[17]。不同林分類型顯著影響土壤理化性質和FnirK基因豐度。其中，杉木人工林和馬尾松人工林土壤FnirK基因豐度較高，次生林土壤較低。原因可能如下：(1)人工林土壤經過營林改造等措施，土壤貯水性能更好，土壤含水量長期高于次生林，更有利于反硝化真菌的生長[22，26]。(2)杉木人工林和馬尾松人工林土壤有效磷含量較高，從而有利于提高土壤真菌豐度和多樣性[27-28]。(3)pH值的變化通常會影響土壤中大多數微生物的生存，在酸性的森林土壤中，pH值升高往往有利于微生物的生長[26，29]。本研究中，杉木人工林和馬尾松人工林土壤pH值顯著高于次生林(表1)，可能是人工林土壤FnirK豐度較高的部分原因。(4)不同植被類型，其凋落物數量、成分、有機質含量、土壤養分以及根系分泌物等均存在較大差異，對微生物生長具有選擇刺激性作用，本研究采樣點位于中亞熱帶地區，氣候濕潤多雨，人工林植被多樣性和凋落物量較次生林低，表層土壤養分易隨雨水流動，更利于微生物生長[30]。本研究結果表明，不同林分類型土壤團聚體結構無顯著差異，但杉木人工林和馬尾松人工林土壤各團聚體中FnirK基因豐度均高于次生林?？傮w而言，次生林土壤4種粒徑團聚體中FnirK基因豐度無顯著差異，但杉木人工林和馬尾松人工林土壤FnirK在2種較大粒徑團聚體中分布較多，在2種較小粒徑團聚體中分布較少(圖1)。這與細菌反硝化nirK和nirS的分布特征一致[18]。這可能是因為人工林土壤具有較高的水分和有效磷含量，提高了土壤各團聚體組分的FnirK基因豐度[27]。此外，由于人工林表層土受人為干擾較強，且相較于粉-黏顆粒，較大團聚體受到環境變化的影響更大[29]，因此人工林土壤2種較大團聚體FnirK基因豐度較高。此外，研究表明，粒徑較大的兩種團聚體中有機碳和總氮的濃度往往高于粒徑較小的團聚體，且易于分解，因此，當人工林土壤理化性質如pH值、有效磷和含水量等更高時，較大團聚體更有利用微生物對養分的利用[31]。雙因素方差分析結果表明，林分類型顯著影響FnirK基因豐度，但團聚體結構對FnirK基因豐度無顯著影響(表3)。然而，在先前的研究中發現，林分類型和團聚體粒徑均顯著影響細菌nirK和nirS基因豐度[18]。因此，相比于細菌，真菌可能更不易受土壤團聚體粒徑大小的影響。

本研究中，杉木人工林和馬尾松人工林土壤反硝化潛勢均顯高于次生林(表1)。這可能是因為，相較于次生林，人工林土壤具有更高的nirK、nirS和FnirK豐度，細菌和真菌反硝化活性更強，反硝化作用產生更多的N2O[26]。盡管真菌和細菌在進行反硝化作用產生N2O的過程中都更偏好缺氧、中性或堿性的環境，但先前的多項研究表明，當pH值介于4～8時，真菌通常比細菌更能耐受酸性，且較于其他生態系統，林地中的真菌更豐富[15，32]。3種林分土壤反硝化潛勢與FnirK基因豐度呈顯著正相關(圖2)，因此，在酸性的森林土壤中，含nirK基因的真菌可能比細菌在產生N2O的過程中發揮著更重要的作用，這與前人研究結果相似[33-35]。此外，FnirK基因豐度和反硝化潛勢與土壤含水率和有效磷含量顯著正相關(圖2)，表明不同林分類型主要通過影響土壤有效磷含量和含水率來影響真菌反硝化功能基因FnirK豐度，從而影響真菌反硝化產生N2O。此外，反硝化潛勢還與土壤pH值呈顯著正相關(圖2)，這可能是由于細菌反硝化的作用[18]。本研究選取的3種林分土壤pH值均在5左右，細菌反硝化作用受限，先前研究已發現細菌nirK和nirS豐度在不同林分類型土壤中的分布特征主要受pH值和銨態氮含量的影響[18]，因此反硝化潛勢對pH值的響應可能主要源于細菌反硝化。綜上，亞熱帶酸性森林土壤中反硝化真菌對林分類型的響應特征不同于反硝化細菌，主要受控于土壤有效磷和含水率。

4 結論

不同林分類型土壤團聚體結構無顯著差異，但杉木人工林和馬尾松人工林土壤和團聚體中FnirK基因豐度以及反硝化潛勢均高于次生林。FnirK基因豐度受林分類型顯著影響，而受團聚體粒徑大小影響較小。FnirK基因豐度在次生林土壤4種粒徑團聚體中無顯著差異，但在杉木和馬尾松人工林土壤大團聚體和小團聚體中相對較高，微團聚體和粉-黏顆粒中較低。不同林分類型主要通過影響土壤含水率和有效磷含量來影響FnirK基因豐度，從而影響土壤反硝化潛勢。因此，建議未來在森林管理過程中，應盡量減少人工林種植，讓其自然演替，以減少溫室氣體N2O排放。