長期施肥處理對東北黑土真菌多樣性和群落結構的影響

鄧慧玉，劉子愷 ，馬星竹，郝小雨，趙 月，沈菊培，賀紀正

(1.福建師范大學地理科學學院/碳中和未來技術學院，福建 福州 350117；2.黑龍江省黑土保護利用研究院，黑龍江 哈爾濱 150086)

施肥是農業生態系統的主要管理措施，對糧食增產起著舉足輕重的作用。大量化肥的輸入，如氮(N)和磷(P)肥，會改變土壤養分含量[1]，影響土壤元素化學計量平衡，改變土壤微生物群落組成，而微生物群落結構的改變反過來會影響土壤養分轉化，進而影響土壤健康和生態系統功能[2]。真菌是土壤微生物的重要組成部分[3]，其所分泌的酶可降解復雜的化合物。另外，真菌對外界環境的變化比細菌更為敏感[4]。因此，研究長期施肥等管理措施對真菌群落結構的影響，對提高土壤肥力、促進有機質降解、認識作物抗病和抗逆性具有重要的意義[5-6]。

土壤微生物不僅受土壤環境變化(如土壤pH)的影響，同時還受養分(如氮、磷肥)輸入的影響。氮肥的長期輸入會導致土壤pH降低[7]，使土壤細菌數量減少，而真菌由于有較寬的pH耐受范圍，促使真菌細菌比值增加，致使多種病原真菌大量繁殖，對作物生長產生威脅。如Paungfoo-lonhienne等[8]發現施氮會降低真菌的生物量，減少多樣性，并改變土壤中真菌的群落結構。有研究發現磷的輸入可以減緩氮對土壤真菌多樣性的負面影響，改善土壤功能[9]。但另有研究通過分析發現隨著磷肥施入量的增加砂姜黑土真菌多樣性顯著降低，且與土壤磷含量顯著負相關[10]?？梢?，氮或磷肥的輸入對土壤微生物特別是真菌的影響與土壤類型、施用年限等息息相關，且兩者交互作用的影響目前還沒有定論。

東北黑土區是我國重要的商品糧生產基地，耕地面積和糧食總量均占全國的1/4[11]。然而，過去幾十年，由于對黑土資源的高強度利用，并受水土流失的影響，東北黑土地耕地質量不斷下降，存在黑土層變薄、障礙層次增厚、土壤酸化等問題[12]。黑土質量的大幅度下降，威脅著東北黑土地作為國家糧食安全中“壓倉石”和“穩壓器”的作用[13]。目前對長期施肥處理下黑土土壤真菌類群的影響還不是很明確[14]。因此，選擇東北典型黑土作為研究對象，依托長期施肥定位試驗平臺[1]，采用高通量測序的方法，探究長期氮磷施肥措施下真菌群落結構的變化及其與土壤養分的關系，為黑土區退化土壤恢復和管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣品采集

研究樣地位于黑龍江省哈爾濱市黑龍江省農業科學院試驗基地(126°35′E，45°40′N)，海拔151 m，屬松花江二級階地，地處中溫帶，一年一熟制，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，≥10 ℃平均有效積溫2 700 ℃，年均日照時數2 600～2 800 h，年降雨量533 mm，無霜期約135 d。試驗地為旱地黑土，成土母質為洪積黃土狀粘土。1980年開始按小麥-大豆-玉米順序輪作[15]。

研究選擇長期樣地4種施肥處理，即施氮(N)、施磷(P)、氮磷混施(NP)和不施肥(CK)，3次樣方重復，一共12個樣方，每個樣方36 m2。每年肥料施用量分別為 N 15 g·m-2(小麥和玉米季)和 7.5 g·m-2(大豆季)，P2O57.5 g·m-2(小麥和玉米季)和 15 g·m-2(大豆季)，氮、磷均為秋季施肥(玉米季氮肥50%秋施，50%于大喇叭口期追施)。氮肥為尿素(N 46%)，磷肥為重過磷酸鈣(P2O546%)、磷酸二銨(N 18%，P2O546%)。土壤樣品采集于2021年4月玉米播種季。采樣時在每個樣方的核心區隨機選取5個取樣點，用直徑為5 cm的土鉆，取表層土壤(0～20 cm)混勻，每個處理3次重復，冰盒冰袋保鮮條件下帶回實驗室。挑去碎石及可見的植物根系，過2 mm篩后，將每個樣方的樣品分成3部分。一份保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于DNA提??；一份置于4 ℃冰箱冷藏，用于鮮樣指標和土壤含水量測定；另一份風干后，用于土壤理化性質分析。

1.2 土壤理化指標的測定

1.3 土壤DNA的提取和高通量測序

土壤總DNA的提取使用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，CA，USA)試劑盒，根據操作手冊逐步完成，并使用NanoDrop ND-2000驗證DNA的濃度和純度。

利用特定引物ITS1F和ITS2R[17]對土壤真菌ITS片段擴增，并在Illumina MiSeq 平臺測序，測序得到的序列使用QIIME2進行質量控制，去除真菌為低質量(Qscore<25)，長度較短(< 200 bp)的片段以及模糊序列，并去除無重復以及單一無重復序列，得到相似度較高100%聚類的amplicon sequence variants(ASVs)。采用“microeco”包[18]計算真菌Shannon指數和ASV豐富度，并基于Bray-Curtis距離的beta多樣性指數。

1.4 數據分析

統計分析主要使用Excel 2019和SPSS 26進行單因素方差(One-way ANOVA)分析，測序數據統計檢驗，制圖和非度量多維尺度分析 (non-metric multidimensional scaling，nMDS)主要使用R語言“microeco”，“vegan”等包進行。冗余分析(redundancy analysis，RDA)主要采用Canoco5.0進行。

2 結果與分析

2.1 長期施肥對黑土理化性質的影響

表1 長期施肥對黑土土壤性質的影響
Tab.1 Effects of long-term fertilization on black soil properties

處理ω(NO-3)/ (mg·kg-1)ω(HN+4)/ (mg·kg-1)ω(DON)/ (mg·kg-1)ω(DOC)/ (mg·kg-1)ω(AP)/ (mg·kg-1)CK5.85±0.41b2.91±0.35b19.81±2.63c6.64±0.59b9.59±0.32dN26.26±5.70a4.61±0.64a50.13±8.94b7.28±0.74b15.01±1.43cNP26.57±0.99a5.20±1.24a67.20±10.05a8.98±0.09a104.71±4.29bP7.43±0.05b2.88±0.14b23.13±2.75c9.19±0.58a115.32±0.07a處理pHω(TC)/(g·kg-1)ω(TN)/(g·kg-1)ω(TP)/(g·kg-1)CK6.52±0.11a16.04±0.83b1.29±0.03b0.39±0.02bN5.22±0.03c16.90±0.49ab1.35±0.10ab0.38±0.07bNP5.35±0.05b17.17±0.41a1.66±0.32a0.58±0.06aP6.43±0.04a16.14±0.23b1.20±0.04b0.61±0.09a

2.2 長期施肥對黑土真菌群落多樣性和群落組成的影響

采用Illumina MiSeq 平臺對土壤真菌ITS片段開展多樣性分析，所有樣品共獲得1 331個真菌ASVs?；贏SV信息發現長期施肥處理對土壤α多樣性產生顯著影響(圖1(a)、1(b))。土壤真菌Shannon多樣性指數和ASVs數均在NP處理最低，分別為4.16和405，顯著低于其他處理(P<0.05)，而CK處理最高。利用Bray-Curtis距離基于ASVs相對豐度對土壤真菌群落結構進行nMDS分析，結果發現不同處理間真菌類群群落結構有顯著差異。具體表現為，沿著第一軸CK和P處理與N 和NP處理分開，而沿第二軸N和NP處理顯著分開，說明CK和P處理群落結構較為相似，而N和NP與其他處理真菌群落結構具有較低的相似性(圖1(c))。通過差異性檢驗(ANOSIM)也發現類似的結果，即不同處理間真菌群落結構差異顯著(圖1(d))。

圖1 長期氮磷施肥處理下土壤真菌群落多樣性(a和b)和群落結構特征(c和d)Fig.1 Soil fungal community diversity (a and b)and community structure (c and d)in long-term N and P fertilizers addition

高通量測序結果發現土壤真菌類群最豐富的3個門水平類群為子囊菌門(相對豐度為63%～68%)，毛霉門(相對豐度為15%～20%)和擔子菌門(相對豐度為9.1%～15%).不同施肥處理下土壤真菌群落在綱水平豐度大于1%的主要類群為Sordariomycetes(37%～40%)，Mortierellomycetes(15%～18%)，Dothideomycetes(12%～17%)，Tremellomycetes(5.6%～14%)，Leotiomycetes(5.2%～9.4%)，Agaricomycetes(1.8%～7.6%)，Eurotiomycetes(2.9%～3.3%)，和Pezizomycetes(1.6%～2.8%)(圖2(a))。Kruskal_wallis檢驗結果發現Mortierellomycetes(P=0.041 5)、Agaricomycetes(P=0.037 8)綱在處理間差異顯著。進一步對不同施肥處理下土壤真菌屬水平的類群進行分析(圖2(b))，共有16個不同真菌屬平均豐度大于1%，其中13個真菌屬為子囊菌門(占總豐度的31%～42%)，其余2個屬和1個屬分別分布在擔子菌門(占總豐度的5.3%～12.2%)和毛霉門(占總豐度的14.4%～18.7%)(圖2(b))。

圖2 不同施肥處理下真菌綱(a)和屬(b)水平主要類群的相對豐度Fig.2 The relative abundance of fungi community at class (a) and genus (b) levels in different fertilization treatments

2.3 黑土真菌群落結構的主要影響因子

圖3 真菌群落相對豐度和群落結構的主要影響因子Fig.3 Main factors controlling fungi community composition and structure

采用RDA分析進一步對不同理化因子對真菌群落結構進行解析(圖3(b))，發現所檢測的土壤性質對真菌群落結構的變化都有較高的解釋率，第一和第二軸分別解釋了真菌變異的30.75%和24.66%。另外，土壤pH是解釋CK和P處理真菌群落變化的主要影響因子，而其他土壤因子則對NP處理有重要的影響。

3 討論

土壤真菌是物質循環和能量流動的主要驅動者，在養分循環、有機質降解和碳固定等方面發揮著重要作用[24]。經過40年左右的施肥處理，發現土壤真菌群落結構在不同處理間差異顯著，特別是施氮處理，這與Zhou等[14]在同一樣地施肥處理34年的研究結果一致，而與本課題組早先在黑土施肥處理后13年的研究結果不一致[25]。引起這一差異的原因主要是施肥年限的不同，說明長期耕作對黑土土壤理化性質和微生物群落產生了重要的影響[26]，也從另一方面證明開展野外樣地長期定位觀測和數據積累的必要性和重要性[27]。土壤微生物生長和活性主要受底物濃度和pH的影響。研究發現pH是影響土壤真菌的主要環境因子，由于氮肥的長期施用，土壤pH在N處理中下降幅度最大，盡管真菌比細菌有更高的耐酸能力，但pH的變化對真菌類群產生了顯著的影響，這一結論也通過基于真菌類群相對豐度與pH的Pearson相關性分析和RDA分析得到驗證(圖3)。以上結果與前期在農田生態系統及在其他生態系統的大量研究結果一致[3]。近期有研究利用機器學習的方法基于基因組探討了細菌的 pH 偏好性，發現了結合生物地理和基因組數據推斷和預測不同細菌類群的環境偏好的價值[28]，因此，推測今后可以基于基因組學層面解析真菌對pH的適應性和偏好性，以便獲取更多有價值的信息。

4 結論

(1)經過40余年長期氮磷肥處理顯著提高黑土土壤有效態氮和土壤磷的含量，降低了土壤pH，但對土壤TC的影響不顯著。

(2)農田黑土真菌主要類群為子囊菌門，而長期氮磷施用對真菌群落組成沒有顯著影響。