嗜肺軍團菌效應蛋白Lpg1972與CNOT7相互作用研究

劉子赫，吳書嫻，甄向凱

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學南方生物醫學研究中心，福建 福州 350117)

嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)作為一種帶鞭毛的革蘭氏陰性胞內致病菌，可以誘發軍團菌肺炎，臨床特征表現為急性下呼吸道感染癥狀[1-2]。嗜肺軍團菌在1976年美國費城退伍軍人大會上爆發的非典型肺炎中被首次分離出來[3]。嗜肺軍團菌大多生存在天然及人工水環境，包括空調冷卻塔、淋浴器和噴泉等。人們吸入被軍團菌污染的氣溶膠后感染，引發非典型肺炎[4]。嗜肺軍團菌在入侵宿主細胞后，可以通過Ⅳ型分泌系統分泌330多種效應蛋白[5]，用來干擾宿主細胞內的各種生命活動，如營養物質運輸、自噬、免疫反應等多種生理生化反應，最終導致疾病的產生[6]。宿主細胞通過胞吞作用將周圍環境中的嗜肺軍團菌內吞進細胞中，在胞質中形成含軍團菌的囊泡樣吞噬小體(Legionella-containing vacuole，LCV)，為軍團菌在宿主細胞內大量復制增殖提供生理環境[7-8]。LCV中的嗜肺軍團菌通過IVB型(Dot/Icm)分泌系統將效應蛋白轉運至宿主細胞內[9]，這些效應蛋白間彼此分工協作，調節宿主細胞信號通路，干擾宿主細胞生理進程，包括組蛋白修飾、囊泡運輸和基因表達等[10]。

致病菌在與宿主的對抗中不斷進化來逃避宿主的免疫防御[11]，通過誘導或沉默宿主體內基因來幫助致病菌生存[12]。病原菌進入宿主細胞，會試圖通過阻止宿主防御因子轉錄和翻譯來抑制免疫反應或應激反應[13-14]。最近研究表明嗜肺軍團菌的效應蛋白lpg1972可以靶向Ccr4-Not復合物中的CNOT7亞基，干擾宿主細胞內mRNA的降解，影響宿主細胞內基因的轉錄翻譯。

真核細胞Ccr4-Not(carbon catabolite repressor 4-negative on TATA)復合物是一種重要的、保守的蛋白質復合物，由至少6個核心亞基組成，以模塊化結構排列[15]。Ccr4-Not復合物調控基因表達的許多方面(如染色質重塑、轉錄、mRNA輸出和RNA干擾)，其中研究最透徹的作用是用于降解mRNA，發揮去腺苷化酶活性[16-17]。Ccr4-Not復合物以分子質量較大的多結構域蛋白CNOT1為基礎[18]，通過蛋白中心的MIF4G結構域結合DEDD(Asp-Glu-Asp-Asp)核酸酶模塊(哺乳動物細胞中的CNOT7和CNOT8)[19]。CNOT7與CNOT8亞基競爭結合MIF4G結構域，執行相似但不同的催化作用[20]。除了DEDD核酸酶之外，Ccr4-NOT還包含由旁系同源物CNOT6和CNOT6L組成的二級核酸內切酶-核酸外切酶-磷酸酶(EEP)核酸酶模塊，它通過與DEDD直接相互作用結合在Ccr4-Not復合物中[21-22]。盡管催化功能相似，每個核酸酶模塊調節不同的mRNA亞群，具有特定poly(A)結合偏好[23]。

綜上將嗜肺軍團菌效應蛋白Lpg1972作為主要研究對象，結合分子生物學及結構生物學手段，探究了Lpg1972與Ccr4-Not復合物中CNOT7亞基的相互作用，對復合物晶體進行了篩選，并基于Alphafold2預測模型，分析它們之間的相互作用位點。

1 實驗材料

1.1 分子克隆實驗相關材料試劑

分子克隆實驗所用試劑：DH5α感受態細胞、2×Taq PCR Mix、KOD-Plus-Neo酶、SspⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、瓊脂糖、50×TAE緩沖液、GelStain核酸染料(10 000×)、DNA Marker、DNA上樣緩沖液、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒。

1.2 蛋白表達與純化相關試劑

蛋白表達純化過程中所用試劑如下。

感受態細胞培養所用試劑：BL21(DE3)感受態、氯化鈉、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG。

蛋白純化所用相關試劑：Tris、氯化鈉、咪唑、PMSF、Ni-NTA填料、硫酸鎳、Glutathione Beads填料、還原型谷胱甘肽。

蛋白質SDS-凝膠電泳所用試劑：Omni-EasyTM一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蛋白 Marker、考馬斯亮藍R-250、考馬斯亮藍G-250。

1.3 蛋白晶體篩選相關試劑

晶體初篩試劑盒信息如表1所示。

表1 晶體初篩試劑盒Tab.1 Crystal primary screening kit

1.4 實驗儀器

實驗所需儀器：超聲破碎儀(美國SONICS 超聲波細胞破碎儀)、高壓細胞破碎儀(永聯生物科技(上海)有限公司)、恒溫培養箱(上海知楚儀器有限公司)、MiniQ超純水儀(默克Millipore)、臺式冷凍離心機(賽默飛世爾)、落地式低溫高速離心機(Thermo)、電泳儀(Bio-Rad)、PCR儀(Bio-Rad)、AKTApure蛋白純化系統(GEHealthcare)、Nanodrop(Thermo)、電子分析天平(Sartorius)、金屬浴(Coyote)、水浴鍋(常州普天儀器)、脫色搖床(Scilogex)、高壓滅菌鍋(Panasonic)、渦旋混合儀(Kylin-Bell)。

1.5 實驗用緩沖液配制

實驗用緩沖液配方如表2所示。

表2 緩沖液體系Tab.2 Buffer systems

2 實驗方法

2.1 分子克隆

2.1.1 目的基因的獲取及引物設計

在NCBI (national center for biotechnology information)數據庫中查找Lpg1972和CNOT7蛋白的基因序列，利用SnapGene軟件設計引物。

2.1.2 目的片段擴增

用嗜肺軍團菌基因組和HEK293T細胞基因組作為模板進行目的片段擴增，PCR反應程序和反應體系如表3和表4所示。

表3 PCR反應程序Tab.3 PCR reaction procedure

表4 PCR反應體系Tab.4 PCR reaction system

2.1.3 目的片段回收

瓊脂糖凝膠電泳：PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，向擴增結束的目的基因片段中按比例加入6×DNA上樣緩沖液，混合均勻后通過電泳遷移分離目的片段。

膠回收：當上樣緩沖液中的指示劑條帶跑到合適位置時停止電泳，取出瓊脂糖凝膠，在DNA Marker的指示下，判斷PCR產物長度，切下目的條帶，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Gel Extractionn kit)說明書進行膠回收，回收完成后用Nanodrop儀器測量濃度，用于后續實驗。

2.1.4 線性化表達載體制備

將含有空載環狀載體質粒的菌株接入5 mL含有抗性的培養基，放置于37 ℃、220 r·min-1恒溫搖床過夜培養。使用試劑盒進行質粒提取，所得質粒用Nanodrop儀器測量回收質粒濃度，用于質粒線性化。

質粒線性化：選取合適的酶切位點，將空載環狀載體質粒酶切制備線性載體，按體系加入樣品，37 ℃酶切反應4 h，反應體系如表5所示。反應結束通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收線性化載體。

表5 反應體系Tab.5 Reaction system

2.1.5 目的基因與表達載體構建

采用同源重組法，將回收的目的DNA片段構建到表達載體上，參照無縫克隆plus One step PCR Cloning kit試劑盒說明書將線性化載體與目的片段以合適的比例加入離心管中進行重組反應，混合溶液50 ℃金屬浴反應10 min，反應體系參考表6。

表6 反應體系Tab.6 Reaction system

2.1.6 轉化

取儲存在-80 ℃冰箱中的100 μL DH5α感受態置于冰上，待感受態完全融化后將步驟2.1.5中的重組質粒全部加入感受態細胞中。冰上孵育25～30 min 后，42 ℃ 熱激90 s，冰上靜置2 min。加入500 μL無抗LB培養基，置于37 ℃ 恒溫搖床，220 r·min-1培養30 min。培養后將感受態4 000 r·min-1離心3 min，吸取去500 μL上清后，用剩余上清重懸細胞并涂于含有相應抗性的LB固體培養皿中，置于37 ℃ 恒溫搖床靜置培養14 h。

2.1.7 菌落PCR及測序

由于目的片段與載體連接可能出現假陽性，需對長出的菌落進行鑒定。取滅菌EP管加入含相關抗性的LB培養基，挑取單克隆菌落37 ℃ 培養4 h左右。取1 μL菌液進行菌落PCR，按照步驟2.1.2設置相關程序。將擴增產物進行核酸膠電泳，挑選與目的基因片段大小相同的樣品，取200 μL菌液進行測序。

2.2 目的蛋白的表達及純化

2.2.1 目的蛋白的表達

取陽性質粒轉化到大腸桿菌表達型菌株E.coliBL21(DE3)中，分別挑取V7- Lpg1972、pGEX-6P-1-CONT 7以及V7-Lpg1972-CNOT7共表達的單克隆菌落接入100 mL含有氨芐青霉素抗性的LB培養基中，37 ℃搖床220 r·min-1培養6 h。將菌液轉接到含有氨芐青霉素抗性的1 L LB培養基中擴大培養，37 ℃搖床220 r·min-1培養2～4 h，分光光度計測量菌液濃度D600 nm=0.8時，加入400 μL 1 mol·L-1IPTG誘導目的蛋白表達，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1，置于18 ℃搖床中繼續培養14～16 h。最后以4 000 r·min-1離心收集大腸桿菌細胞，并置于-20 ℃儲存。

2.2.2 蛋白質純化

(1)高壓破菌：將收集的菌塊按每升菌液收集的細胞加入15～20 mL裂解緩沖液重懸備用，重懸后的菌液用高壓破碎儀破碎。破碎結束后，收集溶液并用高速冷凍離心機離心，離心機參數為4 ℃，17 000 r·min-1，離心30 min。

(2)親和層析：由于重組蛋白N末端具有6×His標簽和GST標簽，蛋白質純化使用親和層析的方法[24]。帶有6×His標簽的目的蛋白可特異性吸附在Ni填料上，帶GST標簽的蛋白可以特異性結合谷胱甘肽瓊脂糖凝膠，雜蛋白則不結合填料或結合能力較差，從而將目的蛋白與雜蛋白分離，最后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。

(3)SDS-凝膠電泳：蛋白質在SDS電泳液中變性并帶上相同電荷，在電流的作用下遷移，移動速度與蛋白質分子質量相關，通過考馬斯亮藍染色使蛋白質條帶顯現，與標準分子質量蛋白Marker比較，判斷蛋白質樣品純度。

2.2.3 分子排阻層析

分子排阻層析也稱為凝膠排阻層析或分子篩，根據樣品組分的分子質量進行分離和純化，主要步驟如下。

(1)蛋白質濃縮：將純化的蛋白質樣品轉移到濃縮管中，4 ℃臺式離心機4 000 r·min-1離心，濃縮至1 mL。濃縮的蛋白質樣品轉移到1.5 mL EP管，使用小型離心機(13 000 r·min-1，15 min，4 ℃)離心至無沉淀。

(2)分子篩緩沖液配制：20 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol·L-1NaCl，用0.22 μm濾膜抽濾去除雜質，超聲波超聲20 min去除氣泡。

(3)層析柱平衡：泵頭用ddH2O清洗后放入分子篩緩沖液中，進行泵沖洗和系統清洗。清洗結束后設置系統參數：流速0.4 mL·min-1，壓力上限報警2 MPa。層析柱與AKTA連接，用當前參數沖洗1個柱體積。

(4)上樣：平衡結束后，重新設置系統參數：流速0.4 mL·min-1，壓力上限報警2 MPa，檢測紫外(UV)吸收波長A280 nm和A254 nm，當基線平穩后上樣。上樣前吸取分子篩緩沖液清洗上樣環3次，洗凈后將蛋白質樣品注入上樣環，改變系統流路，使上樣環中的蛋白質樣品流進層析柱。根據分子排阻色譜圖評估蛋白質信息并收集樣品。

(5)SDS-凝膠電泳：通過SDS-凝膠電泳檢測，取狀態較好的蛋白質樣品濃縮，Nanodrop測量蛋白質濃度，用于后續實驗。

2.3 蛋白質pull-down實驗

蛋白質Pull-down是通過誘餌蛋白來特異性識別配體蛋白質，是在體外研究蛋白質與蛋白質相互作用的有力工具。將帶有親和標簽(如谷胱甘肽轉移酶、6×His、生物素)的誘餌蛋白固定在固體基質上，當目標蛋白或細胞、組織抽提液流經時，與誘餌蛋白相互作用的配體蛋白質被捕獲，通過改變洗脫條件回收被捕獲的蛋白，利用蛋白質印跡或質譜檢測這種相互作用關系。

CNOT7蛋白的基因構建到6p-1載體上，使其N末端帶GST標簽，經過表達、純化得到的蛋白樣品作為誘餌蛋白結合到GST填料上。Lpg1972蛋白的基因構建在V7載體上進行表達純化，N末端帶6×His標簽。純化所得到的Lpg1972蛋白加入帶有誘餌蛋白的GST填料中，用緩沖液反復沖洗，直至不再有蛋白洗脫下來。將帶有誘餌蛋白的GST填料加入緩沖液，置于金屬浴95 ℃加熱5 min，使蛋白質變性，從GST填料上脫離下來。取10 μL樣品通過SDS-凝膠電泳進行鑒定，分析二者之間是否可能存在相互作用。

2.4 晶體的篩選

蛋白結晶的方法主要包括：氣相擴散法(Vapor diffusion)、微量透析法(Crystallization by dialysis)和液-液擴散法(Liquid-liquid diffusion)等。結晶主要原理：蛋白質在沉淀劑作用下，溶解度不斷降低；封閉環境下，點晶孔中的溶液通過汽-液交換擴散到池液中，蛋白質濃度緩慢升高而析出，蛋白質分子由無序轉變為有序排列，經過成核-生長，最終生成晶體。

初篩常用試劑盒為：PEG-Rx、 PEG-Ion、Index、SaltRx、Crystal Screens、Wizard classic 1/2、Wizard classic 3/4、Core Ⅰ、Core Ⅱ、Core Ⅲ、Core Ⅳ、SaltRx、PACT、Proplex。每種試劑盒中細分96個條件，使用96孔初篩板進行初篩。

3 實驗結果

3.1 Lpg1972和CNOT7原核表達

3.1.1 引物設計與表達載體構建

使用SnapGene軟件對Lpg1972與CNOT7的基因序列設計引物(表7)。以嗜肺軍團菌基因組和HEK293T基因組為模板擴增出目的片段，將兩個目的片段分別構建到V7載體和pGEX-6P-1載體上，使目的蛋白分別在N末端帶6×His標簽或GST標簽，通過大腸桿菌原核表達系統BL21(DE3)表達。

表7 引物信息Tab.7 Primer information

3.1.2 Lpg1972蛋白純化

鎳柱親和層析：將Lpg1972菌破碎并離心得到上清倒入鎳柱，待目的蛋白與鎳填料充分結合，向裂解緩沖液中分別加入20、50、300 mmol·L-1濃度的咪唑進行梯度洗脫。收集各組分洗脫液樣品，進行SDS-凝膠電泳(圖1)。電泳泳道從左至右依次為蛋白Marker、沉淀、上清、流穿、20 mmol·L-1IM洗脫樣、50 mmol·L-1IM洗脫樣、300 mmol·L-1IM洗脫樣。結果顯示用300 mmol·L-1濃度的咪唑緩沖液洗脫下來的蛋白質樣品純度較好，收集這些樣品進行濃縮。

圖1 Lpg1972鎳柱親和層析SDS-凝膠電泳結果Fig.1 The SDS-PAGE results for the Lpg1972 nickel column affinity chromatography

分子排阻層析：將蛋白質溶液濃縮至1 mL，質量濃度為20 mg·mL-1，13 000r·min-1離心并去除沉淀。分子排阻層析選用Superdex 200層析柱，具體步驟參照2.2.3，分子排阻層析結果如圖2(a)所示，SDS-凝膠電泳結果從左至右依次為：分子篩上樣前樣品、蛋白 Marker以及峰尖樣品，由此判斷出峰尖樣品純度較好，如圖2(b)。

圖2 Lpg1972蛋白分子排阻層析色譜(a)和SDS-凝膠電泳結果(b)Fig.2 Results of size exclusion chromatography(a) and SDS-PAGE(b) for Lpg1972 protein

3.1.3 CNOT7蛋白純化

將CNOT7的表達菌破碎并離心，將上清與GST柱孵育，待目的蛋白與填料充分結合后進行洗脫，洗脫液為20 mmol·L-1還原型谷胱甘肽。收集洗脫下來的溶液樣品，濃縮換液將谷胱甘肽濃度降至0，加入Prescission Protease酶反應4 h切去GST標簽，酶切后加入GST柱孵育，切除標簽的目的蛋白不與柱料結合，從而與標簽分離，取各組分樣品進行SDS-凝膠電泳，結果如圖3所示。

從左至右依次為沉淀、上清、流穿、20 mmol·L-1谷胱甘肽洗脫樣、酶切后流穿樣、Prescission Protease酶、酶切后洗脫樣(GST標簽)、蛋白 Marker。圖3 CNOT7親和層析SDS-凝膠電泳檢測結果Fig.3 SDS-PAGE detection results for CNOT7 affinity chromatography

3.1.4 GST pull-down驗證二者相互作用

將純化所得的CNOT7蛋白(帶標簽)重新結合在GST柱上，并向層析柱中加入純化所得的Lpg1972蛋白，4 ℃旋轉孵育6 h后進行洗脫。收集洗脫下來的溶液樣品，經過分子排阻層析純化后，根據SDS-凝膠電泳判斷蛋白質相互作用，結果如圖4所示，SDS-凝膠電泳結果從左至右依次為分子篩上樣前、蛋白Marker、峰1、峰 2、峰3。由第二個峰處的結果可以判斷蛋白之間具有相互作用。

圖4 GST pull-down的分子排阻層析色譜(a)和SDS-凝膠電泳檢測(b)結果Fig.4 Results of GST pull-down molecular size exclusion chromatography(a) and SDS-PAGE detection(b)

3.2 復合物蛋白純化

3.2.1 引物設計與共表達載體構建

將CNOT7和Lpg1972序列之間通過一個核糖體結合位點(RBS)連接，并將重組序列連接在V7載體，設計共表達質粒。其中CNOT7蛋白N末端帶6×His標簽，引物設計如表8。構建方法參考2.1。

表8 引物信息Tab.8 Primer information

3.2.2 復合物蛋白純化

帶6×His標簽的CNOT7蛋白可以與Ni填料結合，Lpg1972可以通過結合CNOT7蛋白間接結合在填料上。并通過不同濃度咪唑洗脫復合物蛋白，收集洗脫下來的溶液樣品，根據SDS-凝膠電泳判斷蛋白質表達及純化結果如圖5(b)。電泳結果從左至右依次為沉淀、上清、流穿、0 mmol·L-1IM洗脫樣、20 mmol·L-1IM洗脫樣、50 mmol·L-1IM洗脫樣、300 mmol·L-1IM洗脫樣、蛋白Marker、峰1、峰2。在峰2處可以收集到純度較好的復合物蛋白。

圖5 CNOT7-Lpg1972復合物分子排阻層析色譜(a)和SDS-凝膠電泳(b)結果Fig.5 Results of size exclusion chromatography(a) and SDS-PAGE(b) for the CNOT7-Lpg1972 complex

3.3 結構預測及分析

利用AlphaFold2對Lpg1972進行了三級結構的預測[25-26]，如圖6所示，Lpg1972主要由5個β折疊及另一側的α螺旋組成。對Lpg1972的三級結構進行了Dali分析，在PDB數據庫中沒有發現與它具有相似的結構的同源蛋白。表面電荷分析發現Lpg1972的C末端具有一個明顯的帶負電荷的區域。

圖6 Lpg1972三級結構預測Fig.6 AlphaFold2-generated structural model of Lpg1972

COT7蛋白已經被證實為一種去腺苷化酶，可以在體外降解RNA，它的三級結構如圖7所示[27]。通過電荷分析可以看出CNOT7蛋白有2個正電腔，推測可能為Lpg1972的結合位點。

圖7 CNOT7蛋白三級結構(PDB：2D5R-A)Fig.7 Three-dimensional structure of CNOT7 protein (PDB：2D5R-A)

通過軟件AlphaFold2對CNOT7-Lpg1972復合物蛋白結構進行了預測，來分析它們之間相互作用的方式[28]。CNOT7-Lpg1972復合物的結構如圖8(a)所示。根據復合物的三級結構模型分析了二者的相互作用位點，如圖8(b)，Lpg1972的C末端深入CNOT7的正電荷口袋中，Lpg1972蛋白的Lys124與CNOT7蛋白的Asp40之間可以形成氫鍵相互作用，同時分析二者的表面電荷發現Lpg1972蛋白的Glu114和Glu117與CNOT蛋白的Arg49可以發生靜電相互作用。

圖8 復合物結構預測(a)和相互作用位點分析(b)Fig.8 AlphaFold2-generated structural model of the complex(a) and analysis of their interaction sites(b)

4 總結與討論

嗜肺軍團菌效應蛋白數量繁多，功能豐富，通過IVB型分泌系統向宿主細胞內分泌并轉運，在致病過程中發揮重要的作用。其中Lpg1972作為一種效應蛋白，可以與Ccr4-Not復合物發生相互作用。Ccr4-Not復合物可以調控真核細胞內mRNA降解，在細胞增殖、凋亡和自噬過程中發揮著重要作用，因此研究效應蛋白Lpg1972與CNOT7亞基的相互作用關系具有重要意義。

本研究通過體外生化實驗驗證了Lpg1972和CNOT7蛋白的相互作用，并在此基礎上利用分子生物學手段構建了共表達重組質粒，在大腸桿菌表達系統中表達，分離純化了純度較好的復合物蛋白。因此嗜肺軍團菌效應蛋白Lpg1972可以通過相互作用的方式影響Ccr4-Not復合物的生理活性，進而干擾真核細胞內mRNA的降解，影響宿主細胞的正常生理進程。最后通過AlphaFold2軟件預測了復合物結構并分析了可能的互作位點，為后續的相關研究奠定了基礎。