基于灰色關聯分析的蓽茇體外抗氧化活性譜效關系研究

張 弘，張慧文，張莎莎，宋曉玲，梁 越，李俊利，孫麗君，白云霞*

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；2.鄂爾多斯市中心醫院 中心實驗室，內蒙古 鄂爾多斯 017000；3.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040；4.內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010017）

蓽茇是胡椒科胡椒屬植物蓽茇（PiperlongumL.）的干燥未成熟或成熟果穗，主產于印度、菲律賓等地，在我國多地均有栽培，是中、蒙、藏、維醫等的習用藥材[1]?，F代醫學研究表明蓽茇具有良好的抗氧化、調節糖代謝和保護胃黏膜等多種藥理活性?，F代研究表明，蓽茇有效成分為酰胺類生物堿[2]成分，如蓽茇寧（piperlonguminine）、胡椒堿（piperine）、pipernonaline、dehydropipernonaline、幾內亞胡椒堿（guineensine）等。

有學者對蓽茇的質量控制做過研究，但由于標準物質的缺乏，多是基于胡椒堿含量檢測的質量控制方法，同時缺乏與活性的相關性分析，無法全面反映藥材的質量。譜效關系研究通過中藥成分-生物活性相關分析，能快速地從復雜中藥體系中篩選活性成分。機體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）在體內累積，會損傷機體組織中蛋白質[3]、核酸和脂質等生物大分子[4]，其中胰島β細胞內抗氧化物水平較低，因此較其他組織更易受到氧化應激損傷[5]。ROS可直接損傷胰島β細胞，特別是破壞線粒體結構，促進胰島β細胞凋亡，導致胰島β細胞減少[6]。對于糖尿病患者，在持續高血糖條件下，超氧產物會大幅度增加，當超氧產物的產生速率超過其移除速率，就會產生氧化應激，引起胰島β細胞功能損傷及外周胰島素抵抗，加重糖尿病病情[7]。因此，具有清除ROS作用的活性成分，有開發成為新型糖尿病藥物的潛力。

本研究采集蓽茇不同極性部位的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，考察不同極性部位的體外抗氧化活性，通過灰色關聯分析探索蓽茇的抗氧化活性譜效關系，探討蓽茇發揮抗氧化作用的物質基礎，為蓽茇的質量控制及后期深入開發利用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）； Ultimate 3000 型超高效液相色譜儀（美國 Dionex 公司），串聯 Thermo Q Exactive 型高分辨質譜（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；Welch Ultimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；冷凍干燥器（東京理化器械株式會社）；潔凈安全柜（山東新華醫療器械股份有限公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒醫療器械有限公司）；CO2恒溫培養箱（美國Thermo Fisher科技公司）；熒光倒置顯微鏡（德國Leica公司）；FilterMax F5濾光片型多功能酶標儀（美國Molecular Devices科技公司）；離心機（日本Hitachi公司）；HIRAYAMA高壓消毒鍋（日本平山制作所株式會社）。

1.2 藥材

蓽茇藥材購自內蒙古騰翔中藥飲片公司，經內蒙古醫科大學藥學院生藥教研室張慧文博士檢定，符合《中國藥典》2020年版規定。

1.3 試劑

RPMI1640培養基（以色列BI）；滅活胎牛血清（以色列BI）；青鏈霉素混合液（100×，美國Gibco）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma）；0.25 %胰蛋白酶（美國Gibco）；β-巰基乙醇（美國Gibco）；葡萄糖（美國Sigma）；2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，Solarbio）；甲酸，甲醇，乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）；正丁醇（天津市福晨化學試劑廠）；乙酸乙酯（天津市富宇精細化工有限公司）；石油醚（天津市永晟精細化工有限公司）。

1.4 細胞

INS-1大鼠胰島素瘤細胞株（上海中喬新舟生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 蓽茇不同極性部位提取物的制備

取2 kg蓽茇，粉碎，用70 %甲醇溶液30 L浸泡12 h，60 ℃下回流提取3次，每次1 h，過濾后合并濾液，濃縮后按1:1比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮后收集浸膏（I，91.7 g），得到石油醚部位（II，1.70 g）、乙酸乙酯部位（III，5.18 g）、正丁醇部位（IV，51.21 g）和水提部位（V，3.16 g）。分別以序號 I、II、III、IV、V依次表示蓽茇70 %乙醇提取總部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。

2.2 蓽茇不同極性部位HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 蓽茇不同極性部位供試品溶液的制備 分別精密稱取不同極性部位提取物約0.03 g，分別置20 ml量瓶中，加入甲醇，超聲（功率300 W，頻率50 kHz）20 min，放至室溫，甲醇定容至刻度，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：甲醇（A）-0.1 % 甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，55 %A，5～25 min，55 %A～90 %A，25～50 min，90 %A～100 %A）；流速：1 ml/min；檢測波長為272 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μl。

2.2.3 質譜條件 離子源為HESI源；正離子檢測模式，輔助氣體體積流量30 L/min，噴霧電壓4.00 kV，離子傳輸管溫度300 ℃，輔助氣溫度100 ℃，碰撞能量（CE）為45 eV，檢測方式為Full-MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1500。

2.2.4 HPLC指紋圖譜特征峰的辨識 前期研究已建立蓽茇HPLC指紋圖譜[8]，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），確定了18個共有峰。按2.2.1項下方法制備不同極性部位的供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件進行HPLC圖譜采集。色譜圖見圖1。

圖1 蓽茇不同極性提取物的HPLC圖譜

查閱數據庫及相關文獻，采用Xcalibur 3.0軟件進行峰提取、峰匹配等質譜數據處理，對蓽茇進行化學成分分析，對比二級碎片離子、文獻及胡椒堿標準品，鑒定18個指紋圖譜特征峰，結果見表1。特征峰化學成分結構見圖2。

表1 蓽茇HPLC特征峰化學成分分析鑒定

圖2 蓽茇HPLC特征峰化學成分結構

2.3 蓽茇不同極性部位的抗氧化活性

2.3.1 細胞培養 從液氮中取出凍存的INS-1胰島β細胞，放入37 °C水浴鍋中快速解凍，1000 r/min離心5 min，棄去上淸。加含10 %FBS的RPMI1640培養基吹打細胞，接種至含10 %胎牛血清的RPMI1640培養基中，5 % CO2，37 °C條件下培養24 h后換液。細胞長至亞融合狀態，采用胰蛋白酶消化傳代；每3 d按1:3比例傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.3.2 蓽茇不同極性部位提取物對INS-1胰島β細胞內ROS的影響 為探究蓽茇不同極性部位提取物對高糖引起的INS-1胰島β細胞氧化應激損傷是否具有改善作用，采用16.7 mmol/L葡萄糖直接損傷胰島β細胞，建立高糖細胞模型，以蓽茇不同極性部位提取物處理細胞。對每組細胞內的ROS進行熒光探針標記，以乙酰半胱氨酸為陽性對照。用含10 % FBS的正常完全RPMI 1640培養液將INS-1胰島β細胞接種于96孔黑板，細胞密度為1×105個/ml，置37 ℃，5 % CO2培養箱中培養24 h。小心棄去培養液，PBS小心漂洗一次后，按照分組處理24 h，吸去孔中原培養液，用無血清培養基洗兩遍，洗去孔中剩余的血清。每孔加入10 μmol/L DCFH-DA（無血清培養基配制）50 μl，培養30 min。吸去DCFH-DA，用PBS洗兩遍，避免探針對結果的影響。吸掉孔中原培養液，每孔加入PBS 100 μl，于激發波長485 nm/發射波長535 nm測熒光，結果見表2。

表2 蓽茇不同極性部位提取物對INS-1胰島β細胞內ROS的影響（±s，n=6）

表2 蓽茇不同極性部位提取物對INS-1胰島β細胞內ROS的影響（±s，n=6）

注：**P<0.01，*P<0.05 vs 正常細胞；ΔΔP<0.01，ΔP<0.05 vs模型細胞

分組ROS值正常組 4965.00±397.62高糖模型組 6878.33±1000.90**1000 μg/ml I處理組 5709.00±278.14*Δ 500 μg/ml II處理組 6902.50±65.76**Δ 1000 μg/ml III處理組 6887.25±532.06**1000 μg/ml IV處理組 5676.33±432.76ΔΔ 1000 μg/ml V處理組6326.33±93.85**陽性對照組6640.625±115.08**

2.4 蓽茇不同極性部位HPLC圖譜與抗氧化活性的灰色關聯度分析

灰色關聯度分析模型[9]通過比較序列幾何曲線之間距離的相近性來判斷其相似性，序列間距離越短，則關聯度越大，序列越相似。進行灰色絕對關聯度計算時，需對原始數據進行無量綱化處理，然后根據公式計算灰色關聯度。本研究借助“灰色關聯度分析軟件”第七版，可直接得出灰色關聯度，簡化了實驗數據的處理過程[10]。本研究以蓽茇不同部位的體外抗氧化活性為系統特征行為序列，以蓽茇各極性部位HPLC特征峰平均峰面積為相關因素行為序列，計算二者之間的灰色關聯度，可直接反應相關因素行為序列對系統特征行為序列的影響程度，結果見表3。

表3 蓽茇不同極性部位指紋圖譜特征峰面積與體外抗氧化活性的灰色關聯度

采用灰色關聯度分析方法，對蓽茇各極性部位HPLC特征峰平均峰面積與蓽茇不同部位體外抗氧化活性進行譜效相關性分析，結合灰色關聯度系數與排序，考察蓽茇18個特征峰與抗氧化活性的相關性。結果顯示灰色關聯度較高的10個化合物分別是1（蓽茇寧，piperlonguminine），7（pipernonaline），5（pipercallosine），6（dehydropipernonaline），4（墻草堿，pellitorin），3（胡椒堿，p i p e r i n e），8（假蓽茇酰胺B，retrofractamide B），12（brachystamide B），11[(2E,4E,13E)-14-(benzo[d][1,3]dioxol-6-yl)-Nisobutyltetradeca-2,4,13-trienamide]和10（幾內亞胡椒堿，guineensine）號峰，說明這10個化合物對抗氧化活性貢獻較大。

3 討論

與1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）和2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）抗氧化活性實驗比較，基于細胞模型的體外抗氧化活性實驗更能反映藥物抗氧化活性的真實水平。因此，本文對每組細胞內的ROS進行熒光探針標記，從而測定不同藥物處理組細胞內ROS水平，其結果能更為準確地反映蓽茇不同極性部位提取物的抗氧化活性，及對高糖引起的INS-1胰島β細胞氧化應激損傷是否具有改善作用。

蓽茇是藥食同源傳統習用藥材，其毒性低，具有較好的抗氧化活性，并對胰島細胞氧化應激具有保護作用，可開發為天然抗氧化劑，用于藥品、食品等領域，具有良好的開發和研究價值。