AHP-CRITIC法結合正交設計優化紅黃丹酊提取工藝

吳作敏，于曉濤，王韻旨，寧 萌，王 瑞,2,3*

（1.漯河市中心醫院 藥學部，河南 漯河 462000；2.河南省中藥制劑與加工中醫藥重點實驗室，河南 漯河 462000；3.河南省中藥制劑現代化技術研發與臨床應用工程研究中心，河南 漯河 462000）

紅黃丹方為臨床經驗方，由紅花、大黃等12味藥材組成，外用具有活血化瘀、消腫止痛的功效，臨床用于瘀血腫痛、跌打損傷等軟組織損傷的治療，療效確切。方中紅花活血化瘀，大黃涼血止痛，共為君藥?，F代藥理研究證實紅花中的羥基紅花黃色素A[1-2]和大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸等蒽醌類成分[3-5]均有抑制損傷組織中炎癥因子表達、減輕細胞損傷、改善血液流變學、提高損傷局部痛閾、減輕損傷局部組織病理學變化的作用。目前該方采用飲片打粉，使用時加入一定濃度乙醇調配外敷而用，存在質量不易控制、透皮吸收差、使用不方便等缺點[6]。依據處方藥味理化性質及臨床使用情況，擬將此方開發為外用酊劑，提高制劑質量均一性及患者依從性。中藥酊劑系指采用一定濃度的乙醇將中藥飲片提取或溶解成澄清液體制劑，也可用浸流膏稀釋制成，因其療效顯著且給藥形式靈活，安全可靠性高被廣泛應用于臨床[6-7]。本研究利用層次分析-基于指標相關性混合加權法（AHPCRITIC）結合正交試驗，以羥基紅花黃色素A、大黃游離蒽醌類成分的提取率及總固體物得率為評價指標，優選紅黃丹酊的提取工藝，以期為該方的后續研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配置四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站（美國Agilent公司）；Milli-Q型純水機（美國Millipore公司）；AUW-120D型電子天平（日本島津公司）；5810R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；JA2003N型電子天平（上海精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

紅花（批號：200201），大黃（批號：210801），牡丹皮（批號：201001）等14味中藥飲片均購自河南鴻博藥業有限公司，經河南省中藥制劑與加工中醫藥重點實驗室副主任藥師于曉濤鑒定，質量均符合2020年版《中國藥典》的要求；對照品羥基紅花黃色素A（批號：DSTDQ001701，含量：98.98 %），蘆薈大黃素（批號：DST190626-007，含量：98.00 %），大黃酸（批號：DST200819-029，含量：98.29 %），大黃素（批號：DST191112-030，含量：98.69 %），大黃酚（批號：DST200819-032，含量：98.67 %），大黃素甲醚（批號：DST200325-0312，含量：99.80%），均購自成都德思特生物技術有限公司；甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸（色譜純，上海麥克林） ；乙醇（藥用輔料級別，新鄉市先豐醫藥新材料有限公司）。

2 方法與結果

2.1 指標成分的含量測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定。

2.1.1 色譜條件 Intertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2 %磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，18 %～31 %A；5～15 min，31 %～36 %A；15～20 min，36 %～56 %A；20～35 min，56 %～60 %A；35～50 min，60 %～74 %A；50～65 min，74 %～80 %A；65～85 min，80 %～85 %A） ；檢測波長403 nm（羥基紅花黃色素A，0～20 min），254 nm（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚，20～85 min）；流速1.0 ml/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μl。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量于量瓶中，加甲醇定容，得各對照品儲備液，分別取適量對照品溶液混勻成混合對照品溶液（羥基紅花黃色素A濃度2.34×10-2mg/ml，蘆薈大黃素濃度4.28×10-3mg/ml，大黃素濃度4.32×10-3mg/ml，大黃酸濃度6.89×10-3mg/ml，大黃酚濃度1.38×10-2mg/ml，大黃素甲醚濃度4.49×10-3mg/ml）。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取中藥飲片，除薄荷冰和冰片外，粉碎成粗粉，過2號篩，置有蓋玻璃容器中，加入適量規定濃度的乙醇，攪拌均勻后靜置，浸漬適當時間，過濾收集醇提液，取適量該醇提液溶解處方量的薄荷冰和冰片后，再次并入上述醇提液中，攪拌均勻，靜置24 h，濾過，濾液添加原濃度的乙醇至規定量，分裝，即得紅黃丹方醇提液。精密量取紅黃丹方醇提液適量，加50 %乙醇稀釋10倍，12 000 r/min離心10 min，取上清，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.2.3 陰性樣品溶液的制備 分別稱取缺紅花、大黃的處方量藥材各一份，按2.1.2.2項下方法制備兩份陰性樣品溶液。

2.1.3 專屬性考察 取混合對照品溶液、供試品溶液及兩種陰性樣品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。由圖1可見，供試品溶液與對照品溶液在相應位置有相同色譜峰，陰性樣品溶液在對照品峰相應的位置上無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 紅黃丹方中6種有效成分HPLC圖譜

2.1.4 線性關系 精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液2，4，6，8，10，15 μl，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y） ，進樣量為橫坐標（X） ，進行線性回歸，得標準曲線，見表1。由表1可見，各成分在各自線性范圍內線性關系良好。

表1 線性回歸方程

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果顯示各指標性成分峰面積的RSD值分別為0.34 %（羥基紅花黃色素A），0.63 %（蘆薈大黃素），1.27 %（大黃酸）和1.44 %（大黃素），0.59 %（大黃酚），1.49 %（大黃素甲醚），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性考察 取同一批次處方量藥材6份，按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別進樣分析。測得各指標成分峰面積并計算含量，結果羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量RSD分別為0.99 %，1.68 %，1.74 %，0.91 %，1.13 %，1.45 %，表明該方法重復性良好。

2.1.7 樣品溶液穩定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按2.1.1項下色譜條件下進樣10 μl檢測，測得羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚面積RSD分別為1.86 %，1.68 %，1.45 %，0.84 %，0.75 %，1.27 %，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率考察 精密吸取一定量已知各指標成分含量（羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量分別為141.06，15.19，64.76，6.76，19.04，8.94 μg/ml）的紅黃丹方醇提液，按2.1.2項下方法制得供試品溶液。取供試品溶液1 ml，均精密加入2.1.2項下混合對照品溶液1 ml，平行操作6份，按2.1.1項下色譜條件進樣分析，計算回收率。結果，羥基紅花黃色素A、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均加樣回收率分別為100.91 %，98.78 %，99.34 %，100.50 %，97.64 %，98.93 %，RSD分別為1.79 %，1.93 %，2.41 %，2.09 %，1.98 %，2.71 %。

2.2 總固體得率測定

精密量取各編號的紅黃丹方醇提液3份，每份20 ml，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，轉移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，按下式計算總固體得率及RSD值。

式中，W為20 ml紅黃丹方醇提液的總固體質量，V為樣品溶液總體積，M為中藥飲片的質量。

2.3 正交試驗設計與結果

參考文獻[8-9]報道，并結合單因素預試驗結果與實際生產要求，選取乙醇濃度（A）、加醇倍量（B）、浸漬時間（C）為考察因素，各因素水平見表2，以羥基紅花黃色素A提取率（羥基紅花黃色素A提取量/紅花飲片質量）、大黃游離蒽醌提取率[（蘆薈大黃素提取量+大黃酸提取量+大黃素提取量+大黃酚提取量+大黃素甲醚提取量）/大黃飲片質量]，及總固體得率綜合評分為評價指標，設計L9（34）正交試驗優選提取工藝，因素水平見表2，結果見表3。

表2 因素水平表

表3 正交試驗設計與結果

2.4 指標權重的確定

2.4.1 層次分析法（AHP） AHP將定性分析與定量分析相結合，通過層次分析的方法建立成對比較的優先判斷矩陣，賦予各項指標相對評分，并計算出各指標的權重比例[10-11]。本研究根據復方組方規律，結合文獻[12]，將羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌提取率、總固體得率3個指標分為2個層次，確定指標優先順序為：羥基紅花黃色素A提取率=大黃游離蒽醌提取率>總固體得率，構建優先矩陣見表4，借助在線分析軟件SPSSAU軟件（https://www.spssau.com）進行AHP層次分析，得出羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌提取率、總固體得率的權重系數分別是0.42857，0.42857，0.14286，CR（一致性比例因子）=0＜0.10，說明了權重系數的有效性。

表4 判斷矩陣評分

2.4.2 基于指標相關性的權重確定法（CRITIC）CRITIC是通過指標間相關性判斷各個指標的重要性[13]，以評價指標間的對比強度及沖突性為基礎來確定客觀權重系數，充分考慮到各指標內的變異性及指標間的沖突性，由CRITIC法確定的權重系數與復方中各評價指標間的關聯性和各樣本間數據變異性密切相關[14-15]。首先將各評價指標數據按公式“指標歸一化值=[（實測值-最小值）/（最大值-最小值）］×100 %”進行歸一化處理，通過SPSSAU軟件進行 CRITIC分析，得羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌提取率、總固體得率權重系數分別為0.3272，0.3886，0.2842，其中大黃游離蒽醌提取率的權重系數最大，羥基紅花黃色素A提取率次之。

2.4.3 AHP-CRITIC混合加權法 AHP法以主觀評價為基礎來確定各指標權重系數，CRITIC法則更為客觀地反應各指標的權重系數。為更加真實地評價試驗結果，兼顧主客觀因素，本文將兩種權重系數確定方法加以結合，根據公式ωAHP-CRITIC=ωAHPij×ωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij[16]，計算得羥基紅花黃色素A、大黃游離蒽醌、總固體得率權重系數分別為0.4037，0.4794，0.1169。

2.4.4 權重評分的比較及確定 分別采用 AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC法對權重賦值后，對正交試驗結果按以下公式計算綜合評分（S）。

其中ω為指標權重，Y為指標數值，具體結果見表5。

表5 3種方法評分結果

直觀分析可知3種評分方法給出的結果具有一致性，應用SPSS軟件分別對綜合評分與權重系數進行相關性分析。AHP法、CRITIC法與AHPCRITIC法綜合評分相關系數分別為0.998，0.994，AHP法與CRITIC法綜合評分相關系數為0.998，且相關性均極顯著（P<0.01），表明3種權重賦值法給出的評分結果具有一致性；AHP法與CRITIC法權重系數的相關系數為0.811（P>0.05），說明兩組相關系數相關性不顯著，表明AHP法與CRITIC法給出的信息疊加性較差。AHP-CRITIC法整合主觀與客觀兩方面因素進行評價，所展現的信息更加科學合理，因此選擇AHP-CRITIC法進行綜合權重評分。

2.5 提取工藝的確定

采用AHP-CRITIC法確定權重系數，對正交試驗結果進行綜合評分，并利用SPSS 19.0對正交試驗結果進行分析，直觀分析結果見表6，方差分析結果見表7。根據直觀分析可知，3因素對綜合評分的影響順序為A>C>B，即乙醇濃度對綜合評分影響最大，加醇倍量的影響最??；根據方差分析結果可知3個影響因素對指標成分含量及總固體得率均無顯著影響，為節約工業生產時間與成本，選擇最佳工藝為A1B1C2，即應用4倍量50 %乙醇浸漬10 d，其符合制劑生產方便、成本低等特點。

表6 直觀分析結果

表7 方差分析結果

2.6 驗證性試驗

為驗證正交試驗結果的準確性，保證紅黃丹酊制備工藝的合理性，稱取處方量藥材3份，按照最終確定的最佳工藝A1B1C2，進行3批驗證試驗，結果見表8，各指標的RSD值均小于3 %，說明A1B1C2工藝穩定可靠，可繼續開展下一步研究。

表8 工藝驗證結果

3 討論

3.1 評價指標成分的選擇

紅黃丹方中的紅花、牡丹皮等藥材均含揮發性成分，加熱會導致其揮發性成分的逸散損失，且大黃中的蒽醌類成分穩定性差，高溫易分解，因此不宜采用加熱的提取方式，且因大黃富含黏性成分（鞣質）等，不適合滲漉法提取[17]，因此最終選擇浸漬法作為紅黃丹酊劑的提取方法。根據前期預實驗結果，提取次數增加，指標成分得率相對增加，但隨著溶劑量的增加，指標成分濃度下降，且因復方中含揮發油成分及不穩定性活性成分，不宜加熱濃縮以減少溶劑體積，為保證藥物療效，綜合考慮，確定紅黃丹方提取次數為1次。

中藥復方一般通過多組分、多靶點、多通路的方式從整體上調節機體功能[18]，為更科學地體現工藝研究的合理性，本研究采用多組分綜合評分的方法聯合正交設計篩選工藝參數。由于羥基紅花黃色素A、大黃游離蒽醌類成分分別為君藥紅花、大黃中具有化瘀止痛作用的主要藥效成分[5,19]，總固體得率常作為中藥酊劑研究的評價指標[20]，因此本研究以羥基紅花黃色素A提取率、大黃游離蒽醌類成分提取率及總固體得率作為評價指標。

3.2 權重系數的確定

權重系數的確定是采用多指標進行綜合評分篩選相關參數時，能否科學合理進行綜合評分的重要環節[21]。AHP法將各指標按主觀經驗進行重要性排序并分層，其在一定程度上體現復方配伍規律，但缺乏與實際數據信息的結合；CRIRIC法則能客觀分析實際數據信息，但缺少與不同指標間輕重關系的結合；AHP-CRIRIC混合加權法整合兩種賦權方法的特點，既考慮到復方配伍及藥效發揮特點，又客觀分析了實際數據信息。經對比分析，本研究采用整合主觀與客觀因素為一體的AHP-CRIRIC混合加權法確定多指標權重系數，篩選出的最佳制備工藝為4倍量50 %乙醇浸漬10 d，且通過驗證試驗檢驗了該工藝的穩定可行性，為下一步研究提供數據支持。